专利名称:一种缨小蜂体内共生沃尔巴克氏细菌的检测方法
技术领域：
本发明涉及昆虫体内共生菌的分子检测，具体涉及缨小蜂体内共生菌沃尔巴克氏 (Fo^acAia)细菌的检测方法。
背景技术：
缨小蜂隶属膜翅目缨小蜂科(Mymanidae)，是水稻主要害虫飞虱卵期一种重要的寄生蜂。缨小蜂群体数量大、效能高，对早稻田发生的灰飞虱、白背飞虱和晚稻田后发的褐飞虱起显著的抑制作用。因此，对缨小蜂的研究在水稻病虫害生物防治中具有重要意义。现有的研究已经表明，寄生蜂体内存在着大量的共生微生物，其中沃尔巴克氏(Wolbachia )细菌分布最广，它能诱导寄生蜂产雌孤雌生殖和细胞质不亲和，引起寄主的生殖行为异常，使寄主后代性比失衡。此外，沃尔巴克氏(rWhdia)细菌还影响寄生蜂行走和扩散能力、寄生率和羽化率、寿命、竞争力和滞育等。对寄生蜂体内共生菌的研究有助于研究人员深入探索寄生蜂和寄主昆虫之间的协同进化关系、攻克寄主防御系统以及调控寄主生长发育并正确理解寄生蜂成功进化的生态策略。同时，对提高寄生蜂的人工繁育效率、控制农林重大害虫的发生与危害的潜能均具有重要的理论和实践意义。
昆虫体内沃尔巴克氏(Wolbachia)细菌的检测是最为基础性的工作，到目前为止， 沃尔巴克氏细菌(Wolbachia)尚无法在寄主体外进行培养，所以很难用传统微生学的方法对沃尔巴克氏(Wolbachia)细菌进行检测和研究，沃尔巴克氏(Wolbachia)细菌的检测主要依赖基于聚合酶链式反应(PCR)的分子生物学技术方法。
当前常用于研究沃尔巴克氏(Wolbachia)细菌的分子标记主要是位于核糖体RNA 基因编码区(16S rDNA、23S rDNA、5S rDNA)、核糖体RNA基因非编码区(16S和23SrRNA编码基因间的间隔区一ITS-I和位于23S和5SrRNA编码基因间的间隔区一ITS-2)的序列，以及编码蛋白的基因序列，如Wsp基因、ftsZ基因等。洪晓月等人公开的中国发明专利检测叶螨体内共生菌的多重PCR检测方法(申请号2009 1 0032015. 5，公开号CN 101603081 Α)中公开了基于Wsp基因的昆虫体内共生菌沃尔巴克氏(Wolbachia)细菌的检测方法。上述现有技术的共同特点在于它们均包含两个关键步骤提取昆虫的总DNA，然后采用适合的分子标记进行PCR扩增，随后可以根据电泳检测的结果或者测序分析的结果来判断昆虫体内是否存在共生菌沃尔巴克氏(Wolbachia)细菌，以及其种类。
现有技术的缺陷在于影响PCR的因素，如提取的DNA模板质量、用于PCR的引物和试剂、PCR反应体系、PCR反应条件、所用引物对样品DNA中目标基因的扩增效率等均可能影响到最终的检测结果，现有技术无法在实验体系中确保检测结果不受上述因素的影响， 尤其是在得出阴性的检测结果时。因此，建立一种相对严谨的基于PCR的对昆虫体内沃尔巴克氏(rWhcAia)细菌检测的实验体系，是当前研究中需要解决的重要问题。此外，快速、 准确的确定昆虫体内沃尔巴克氏(Wolbachia )细菌的种类也是需要解决的问题。
发明内容
[0006]本发明的目的在于解决现有技术的不足，建立一种相对严谨的基于PCR的检测缨小蜂体内沃尔巴克氏(rwhdia)细菌的实验体系，同时，该检测方法的结果同时可以快速、准确的确定昆虫体内沃尔巴克氏(Wolbachia )细菌的种类。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是
以提取获得的缨小蜂总DNA为模板，采用巢式PCR与DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)，即变性梯度凝胶电泳，技术结合的方式进行共生菌沃尔巴克氏 (Fo^acAia)细菌的检测，具体技术路线图如附图1所示。
在一个优选的方案中，本发明的方法为一种缨小蜂体内共生沃尔巴克氏细菌的检测方法，包括提取缨小蜂总DNA ；扩增沃尔巴克氏细菌和细菌16S rDNA基因片段；对获得德沃尔巴克氏细菌和细菌16S rDNA基因片段进行变性梯度凝胶电泳分析；其特征在于所述沃尔巴克氏细菌和细菌16S rDNA基因片段的扩增采用巢式PCR，其具体步骤为 (1)、以提取获得的缨小蜂DNA为模板，用沃尔巴克氏细菌的16S rDNA引物99F/994R或者 315F/6^R扩增获得相应的基因片段，用细菌的16S rDNA引物27F/1492R和27F/REUB分别扩增获得缨小蜂体内总细菌和不含沃尔巴克氏细菌的总细菌的相应基因片段。
在一个优选的方式中，该方法还包括步骤(2)以(1)中扩增获得的缨小蜂体内沃尔巴克氏细菌、总细菌、不含沃尔巴克氏细菌的总细菌的16S rDNA的基因片段为模板，采用带有GC夹子的细菌16S rDNA V3高变区引物341F/517R扩增相应的用于变形梯度凝胶电泳分析的16S rDNA基因片段；所述扩增获得沃尔巴克氏细菌和细菌16S rDNA基因片段的变性梯度凝胶电泳分析在完全相同的条件下进行，以总细菌的DGGE图谱作为缨小蜂DNA的提取效果、沃尔巴克氏细菌的16S rDNA基因片段PCR扩增效果的控制性对照，且以沃尔巴克氏细菌的16S rDNA基因片段的DGGE图谱中条带的测序分析结果作为缨小蜂体内沃尔巴克氏细菌的检测结果。优选的，GC夹子的序列为SQ10。
优选的，所述的方法还包括所述扩增获得的沃尔巴克氏细菌和细菌16S rDNA基因片段的变性梯度凝胶电泳分析结果中，以缨小蜂体内总细菌和不含沃尔巴克氏细菌的总细菌的相应基因片段的变性梯度凝胶电泳的图谱是否有条带的差异来初步判断缨小蜂体内是否存在沃尔巴克氏细菌。
在一些具体的方式中，如下方法巢式PCR扩增缨小蜂体内沃尔巴克氏 iVo Ibachia )细菌具体步骤为1、用沃尔巴克氏(Jolbachia )细菌的16S rDNA弓丨物 99F/994R或者315F/6^R扩增获得沃尔巴克氏(Zfo^acAia)细菌的16S rDNA的基因片段； 用细菌的16S rDNA引物27F/1492R和27F/REUB分别扩增获得缨小蜂体内总细菌和不含沃尔巴克氏(Fo^acAia)细菌的总细菌的16S rDNA的基因片段，其中27F/REUB引物的扩增产物再次作为模板，用引物27F/1492R扩增获得不含沃尔巴克氏(rWhdia)细菌的总细菌的16S rDNA的基因片段。所述引物的序列为
名称序列序列编号99F5’ -TTGTAGCCTGCTATGGTATAACT-3’SQl994R5’ -GMTAGGTATGATTTTCATGT-3’SQ2315F5’ -GCATGAGTGAAGAAGGCC-3SQ3628R5’ -AGATAGACGCCTTCGCCA-3’SQ427F5’ -GTGCTGCAGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’SQ5REUB5’ -GCCAAGGCATCCACC-3’SQ61492R5’ -CACGGATCCTACGGGTACCTTGTTACGACTT-3’SQ7
4PCR 反应总体系为 25 μ L,包括 2. 5 μ L 10XPCR Buffer (包含 20 mmol/L 的 MgCl2), 1 U 的 Taq DNA Polymerase, 2 μ L dNTPs (2. 5 mmol/L each)，正反向弓|物各 0· 4 μ L (10 μ mol/L), DNA 模板 10-20 ng,用 ddH20 补加到 25 μ L。
PCR反应的程序为 94°C 4 min，94°C 1 min，51°C 45 s (其中，用 27F/1492R、27F/ REUB引物扩增相应基因片段时为55°C )，72°C 45 s (其中，用27F/1492R、27F/REUB引物扩增相应基因片段时为1.5 min)，第2 — 4步进行31个循环，在72°C延伸8 min后停止反应。PCR产物用1%琼脂糖电泳检测。
2、以步骤1中获得的缨小蜂体内沃尔巴克氏(Fo^acAia)细菌的16S rDNA的基因片段、总细菌和不含沃尔巴克氏(rWhcAia)细菌的总细菌的16S rDNA的基因片段为模板，用带有GC夹子的细菌16S rDNA V3高变区引物341F和517R扩增相应的16S rDNA V3 高变区基因片段。其中，所述引物的序列为
34IF 5'-CTACGGGAGGCAGCAG-3' SQ8 517R 5' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3' SQ9 ； 所述GC夹子的序列为
5 ‘ -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCC-3‘ SQlO0
PCR 反应总体系为 25 μ L,包括 2. 5 μ L 10XPCR Buffer (包含 20 mmol/L 的 MgCl2), 1 U 的Taq DNA Polymerase, 2 μ L dNTPs(2. 5 mmol/L each)，正反向弓|物各0. 4 μ L (10 μ mol/L), DNA 模板 10-20 ng,用 ddH20 补加到 25 μ L。
PCR 反应的程序为 94°C 4 min，94°C 1 min，55°C 30 s，72°C 40 s，第 2— 4 步进行33个循环，在72°C延伸8 min后停止反应。PCR产物用1%琼脂糖电泳检测。
在以上方法中，DGGE分析的具体步骤为
制备聚丙烯酰胺变性梯度胶，分析所用的PAGE(聚丙烯酰胺)胶浓度为8% (质量浓度)， 变性梯度为40 %作为对检测样品中是否含有沃尔巴克氏(ro^acAia)细菌的初步判断，可以通过比较缨小蜂体内总细菌和不含沃尔巴克氏(Fo^acAia)细菌的总细菌的16S rDNA V3 高变区基因片段产物的DGGE图谱中条带的差异来判断，如果样品中不含有沃尔巴克氏 (rWhcAia)细菌，它们的DGGE图谱应完全一致，如果它们的DGGE图谱有条带的差异，则可初步判断缨小蜂体内存在沃尔巴克氏OVolbachia)细菌。
本发明的有益效果
本发明的优点和积极效果在于采用巢式PCR-DGGE的实验体系检测缨小蜂体内沃尔巴克氏(Wolbachia)细菌过程中，对总细菌的扩增和分析结果是对影响PCR的因素的控制性对照，用于表明提取DNA的质量、PCR反应条件和反应体系等对检测的结果没有影响。尤其是当样品中未扩增出沃尔巴克氏(Wolbachia)细菌的16S rDNA基因片段产物，而扩增获得了总细菌和除沃尔巴克氏(Wolbachia)细菌外总细菌的16S rDNA基因片段产物，则表明其中确实不存在沃尔巴克氏(Wolbachia)细菌。该实验体系相对于当前其它基于PCR的沃尔巴克氏(Wolbachia)细菌检测方法是相对而言更为严谨的检测体系。此外，经DGGE检测确定沃尔巴克氏(Wolbachia)细菌的存在后，直接对DGGE条带切胶回收、克隆和测序，还可以快速、准确的提供昆虫体内感染的沃尔巴克氏(Wolbachia)细菌种类数和种属信息，在沃尔巴克氏(Wolbachia)细菌的群落结构和多样性的分析中也更有实用价值。
图1 巢式PCR-DGGE检测缨小蜂体内共生菌沃尔巴克氏(Wolbachia)细菌的技术路线。
图2 不同缨小蜂体内沃尔巴克氏(Wolbachia)细菌、总细菌、除沃尔巴克氏 (Wolbachia)细菌外总细菌16S rDNA V3高变区基因片段的DGGE结果。其中，图中泳道编号为不同样品，Tl和T2为采集自浙江缨小蜂在不同温度下培养物，P5为采集自菲律宾的缨小蜂；分组标记表示用于DGGE分析的16S rDNA V3高变区产物的模板来源于该引物扩增基因组DNA的PCR产物；途中条带的编号表示切胶的条带。
图3 以图2中切胶回收的条带1 (band 1)和条带2 (band 2)的测序结果构建的系统发育树。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明方法作进一步的详细描述，但应该理解本发明并不受这些内容所限制。
实施实例
1、本实施实例所用的缨小蜂虫源为稻虱缨小蜂，Tl和T2采自浙江，为不同温度下培养的样品，P5采自菲律宾国际水稻研究所试验农场稻田，采集的样品保存于_72°C冰箱备用。
2、基因组DNA提取将低温保存的稻虱缨小蜂样品取出，置于洁净工作台解冻。每种稻虱缨小蜂样品分别取10头装入无菌的2 ml离心管中，加入1 mL 70%的乙醇，轻轻晃动5 min,随后用无菌水漂洗3次，重复该步骤3次以去除稻虱缨小蜂表面的细菌。
采用DNeasy Blood & Tissue Kit (购买自 Qiagen Corp.)提取稻虱缨小蜂样品的基因组DNA。将去除表面细菌的稻虱缨小蜂样品置于新的无菌的2 mL离心管中，加入 ISOyL的ATL buffer，用无菌的玻璃棒研磨样品直至肉眼看不到虫体组织。向离心管中加入20 UL的蛋白酶K，充分混合后放入水浴摇床中，56 °C条件下水浴过夜。随后步骤参照试剂盒提供的操作步骤进行。提取获得的DNA样品用NanoDrop-2000 (Thermo Corp.)测定浓度后置于-20 °C保存备用。
3、稻虱缨小蜂体内沃尔巴克氏(Jolbachia )细菌、总细菌、不含沃尔巴克氏 (Wolbachia)细菌的总细菌的16S rDNA V3高变区基因片段的扩增。参照图1中的路线图， 以提取获得的Tl、T2、P5样品总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应总体系为25 μ L，包括 2. 5μ L IOXPCR Buffer (包含 20 mmol/L 的 MgCl2), 1 U 的 TransTaq-T DNA Polymerase (TransGen Corp. ),2 μ L dNTPs (2.5 mmol/L each)，正反向引物各 0. 4 μ L( 10 ymol/L),
6DNA 模板 10-20 ng，用 ddH20 补加到 25 μ L。
PCR 反应的程序为 94°C 4 min，94°C 1 min，51°C 45 s (该温度为用 99F/994R、 315F/628R引物扩增相应基因片段时的褪火温度，用27F/1492R、27F/REUB、GC+341/517R 引物扩增相应基因片段时为)，72°C 45 s (该时间度为用99F/994R、315F/6^R、 GC+341/517R引物扩增相应基因片段时的延伸时间，用27F/1492R、27F/REUB引物扩增相应基因片段时为1.5 min)，第2 — 4步进行31个循环，在72°C延伸8 min后停止反应。
PCR产物用1%琼脂糖电泳检测，电泳图经Quantity One软件(Bio-Rad Corp.)数字化处理，参照电泳时Marker对应条带的DNA含量进行相对定量。
4、PCR产物的DGGE分析前述扩增获得的稻虱缨小蜂样品Tl、T2、P5的沃尔巴克氏(Zfo^acAia)细菌、总细菌、除沃尔巴克氏(Zfo^acAia)细菌外总细菌的16S rDNA V3 高变区基因片段产物PCR产物用基因突变检测系统(Bio-Rad Dcode, USA)分析，用于DGGE 分析的PAGE (聚丙烯酰胺)胶浓度为8 % (质量浓度)，变性梯度为40 %5、DGGE条带的回收、克隆、测序、分析DGGE凝胶中的主要条带切下后用dd H2O冲洗，捣碎后用30 μ L TE buffer在4°C浸泡过夜，PCR回收的切下的条带中的DNA。回收条带的PCR产物再次经DGGE检测以确保回收条带PCR产物的正确。PCR产物用Sarfr印柱式DNA 胶回收试剂盒(Sangon Corp.)纯化后连入PMD18-T载体，转入E. coli DH5a感受态细胞， 采用菌落PCR检测阳性克隆，每个样品随机挑选3个载有插入片段的阳性克隆送交上海生工公司测序。测序结果在GenBank中比对分析，之后用MEGA 4. 1软件以Neighbor-Joining 法构建系统发育树，各分支的bootstrap置信度用1000次自导复制来评价。
6、稻虱缨小蜂样品T1、T2、P5中沃尔巴克氏(Fo^acAia )细菌的检测结果稻虱缨小蜂样品Τ1、Τ2、Ρ5的沃尔巴克氏(Fo^acAia)细菌16S rDNA基因片段的DGGE图谱显示， 3个样品均有明显的1个优势条带，如图2所示。其中，对图2中编号为条带1 (band 1)和 2 (band 2) DNA进行割胶回收、克隆后的测序结果条带1的序列(SQ11) (band 1)为
5’-CTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCATGAGTG AAGAAGGCCTTTGGGTTGTAAAGCTCTTTTAGTGAGGAAGATAATGACGGTACTCACAGAAGAAGTCCTGGCTAACT CCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT-3'
条带2的序列(band 2)为(SQ12)
5’-CTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCATGAGTG AAGAAGGCCTTTGGGTTGTAAAGCTCTTTTAGTGAGGGAGATAATGACGGTACTCACAGAAGAAGTCCTGGCTAACT CCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT-3'
经GenBank中比对分析后用MEGA 4. 1软件以Neighbor-Joining法构建系统发育树， 如图3所示，条带1 (band 1)和2 (band 2)均与已知的沃尔巴克氏(Zfo^acAia)细菌16S rDNA序列相似，表明band 1和band 2代表的细菌是沃尔巴克氏(Fo^acAia)细菌，由此可以确定稻虱缨小蜂样品Tl、T2、P5中均含有沃尔巴克氏(Fo^acAia)细菌。
稻虱缨小蜂Tl、T2、P5中总细菌和除沃尔巴克氏(Zfo^acAia)细菌外总细菌的DGGE图谱(如图2)显示，它们大多数条带完全相同，但在对应切胶条带1和2的位置有一定的差异，其中样品P5的差异较为明显，这与稻虱缨小蜂样品中沃尔巴克氏(rWhdia) 细菌的含量有一定的关系。从各样品总细菌和除沃尔巴克氏(Volbachia )细菌外总细菌的 DGGE图谱的差异，可以初步判断各样品中存在沃尔巴克氏(rWhcAia)细菌，这与最终的测序分析结果也是一致的。
权利要求
1.一种缨小蜂体内共生沃尔巴克氏细菌的检测方法，包括提取缨小蜂总DNA;扩增沃尔巴克氏细菌和细菌16S rDNA基因片段对获得沃尔巴克氏细菌和细菌16S rDNA基因片段进行变性梯度凝胶电泳分析；其特征在于所述沃尔巴克氏细菌和细菌16S rDNA 基因片段的扩增采用巢式PCR，其具体步骤为(1)、以提取获得的缨小蜂DNA为模板，用沃尔巴克氏细菌的16S rDNA引物99F/994R或者315F/628R扩增获得相应的基因片段，用细菌的16S rDNA引物27F/1492R和27F/REUB分别扩增获得缨小蜂体内总细菌和不含沃尔巴克氏细菌的总细菌的相应基因片段。
2.根据权力要求1所述的方法，该方法还包括步骤(2):以(1)中扩增获得的缨小蜂体内沃尔巴克氏细菌、总细菌、不含沃尔巴克氏细菌的总细菌的16S rDNA的基因片段为模板， 采用带有GC夹子的细菌16S rDNA V3高变区引物341F/517R扩增相应的用于变形梯度凝胶电泳分析的16S rDNA基因片段；所述扩增获得沃尔巴克氏细菌和细菌16S rDNA基因片段的变性梯度凝胶电泳分析在完全相同的条件下进行，以总细菌的DGGE图谱作为缨小蜂DNA 的提取效果、沃尔巴克氏细菌的16S rDNA基因片段PCR扩增效果的控制性对照，且以沃尔巴克氏细菌的16S rDNA基因片段的DGGE图谱中条带的测序分析结果作为缨小蜂体内沃尔巴克氏细菌的检测结果。
3.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于所述扩增获得的沃尔巴克氏细菌和细菌 16S rDNA基因片段的变性梯度凝胶电泳分析结果中，以缨小蜂体内总细菌和不含沃尔巴克氏细菌的总细菌的相应基因片段的变性梯度凝胶电泳的图谱是否有条带的差异来初步判断缨小蜂体内是否存在沃尔巴克氏细菌。
4.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于，GC夹子的序列为SQ10。
5.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于，制备聚丙烯酰胺为所述的变性梯度胶，分析所用的聚丙烯酰胺胶浓度为8% (质量浓度)，变性梯度为40 %专利摘要
本发明提供一种缨小蜂体内共生菌沃尔巴克氏细菌群的检测方法，具体包括以下几个步骤提取缨小蜂样品的总DNA，采用巢式PCR扩增缨小蜂样品中沃尔巴克氏细菌、总细菌和除沃尔巴克氏细菌外总细菌的16SrDNAV3高变区的基因片段，然后进行DGGE(变性梯度凝胶电泳)分析，通过DGGE图谱的分析和DGGE条带的回收、克隆和测序分析，可以检测缨小蜂样品中的沃尔巴克氏细菌。该方法提供了一种相对严谨的基于PCR的检测缨小蜂体内沃尔巴克氏细菌的技术方法，还可以快速、准确的确定缨小蜂体内沃尔巴克氏细菌的种类，对当前昆虫体内共生沃尔巴克氏细菌的检测和相关研究具有重要促进意义和实用价值。
文档编号C12Q1/04GKCN102443635SQ201110368959
公开日2012年5月9日 申请日期2011年11月18日
发明者刘淑平, 吕仲贤, 徐红星, 杨亚军, 汤江武, 王新, 郑许松 申请人:浙江省农业科学院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan