一种牙鲆原始生殖细胞早期追踪、定位方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及胚胎期PGCs的定位标记方法，具体的说是一种牙鲆原始生殖细胞早期追踪、定位方法。
【背景技术】
[0002]牙鲆是我国经济价值很高的海水养殖鱼类，其肉质细嫩，营养丰富，深受消费者欢迎。牙鲆具有雌鱼比雄鱼生长快，个体大的特点。近年来，随着牙鲆雌核发育技术的突破，遗传雌性幼鱼，在关键发育期进行外源或者环境因子处理，可诱导获得雌性或者雄性主导群体，牙鲆已逐步在性分化研宄领域成为经济鱼类模式物种。胚胎整体原位杂交可以跟踪胚胎发育过程中PGCs的迀移及数量变化，但这一技术主要在淡水鱼中易去卵膜的鱼中应用，传统的胚胎整体原位杂交前取样及保存方式并不适用于海水鱼胚胎样品，同时步骤繁琐。因此，建立牙鲆胚胎发育过程中PGCs的定位标记方法，对于牙鲆PGCs发生模式和分化相关规律的阐明具有重要的意义。
【发明内容】
[0003]本发明目的在于提供一种牙鲆原始生殖细胞早期追踪、定位方法。
[0004]为实现上述目的，本发明采用技术方案为:
[0005]一种牙鲆原始生殖细胞早期追踪、定位方法:
[0006]I)将收集的牙鲆各阶段胚胎样品经浓度为4% PFA溶液固定；固定后用含50%去离子甲酰胺的PBS溶液于_20°C保存，待用；
[0007]2)将上述固定后保存样品去卵膜后进行梯度甲醇脱水、复水，待用；
[0008]3)上述复水后各个阶段胚胎样品经用无RNA酶的PBS缓冲液洗涤，62-65°C预杂交2-4h ;杂交后将含有牙鲆RNA探针的杂交液加入至各个阶段预杂交后的胚胎样中于62-65°C下杂交过夜；杂交处理后洗涤，并经抗体孵育，再洗涤，避光显色，进而实现对牙鲆原始生殖细胞早期追踪、定位的标记。
[0009]所述各阶段胚胎样品是将各个阶段胚胎分别用无RNA酶的PBS缓冲液多次洗涤，每次5-10min ;洗涤后利用浓度4% PFA溶液于0_4°C固定24_48h。
[0010]将固定后用含50%去离子甲酰胺的PBS溶液保存的样品去掉卵黄卵膜，而后加入至含50%去离子甲酰胺的PBS溶液中进而保存1-2月；
[0011]或，去除卵黄卵膜后用无RNA酶的PBS缓冲液洗涤多次，每次5_10min ;洗涤后25%-100% (V/V)梯度的甲醇对其进行脱水处理，每个梯度5-10min脱水处理，脱水后再用100% — 25%梯度的甲醇进行复水处理，每个梯度5-10min。
[0012]所述含有牙鲆RNA探针的杂交液是将用预杂交液稀释探针至终浓度为l_2ng/ul，再将其置于75-85?变性10-15min，变性后加入至各个阶段预杂交后的胚胎样中；所述探针为:
[0013]DF:5’ -GTTCTGCGTGTGCTGACT-3’ ；
[0014]DR: 5 ’ -TTGTCTTGGAACAGGGCT-3’。
[0015]所述预杂交液为:50(v) %去离子甲酰胺，25 (V) % 20 X SSC, 50mg/ml肝素50 μ 1，酵母 tRNA 25mg, 0.1 (v) % Tween 20，0.5M 的朽1 檬酸(Citric Acid) 850 μ I，加无 RNAase 超纯水到50ml，最终PH为6.0-6.5。
[0016]所述杂交处理后洗涤是将杂交后各阶段样品分别用进行系列洗脱；系列洗脱是首先在62-65°C下用体积比为1:1的去离子甲酰胺和2XSSCT混合液洗涤多次，每次30min，再在62-65°C下用2XSSCT洗涤多次，每次15min，而后62_65°C下用0.2XSSCT洗涤多次，每次30min，最后在室温下用无RNA酶的PBS缓冲液洗涤多次，每次5min。
[0017]所述杂交处理洗涤后向各阶段样品中加入浓度为1-2% blocking室温下封闭处理2-4h，而后再加入碱性磷酸酶抗体在室温下经抗体孵育2-4h，再避光显色处理，进而定位标记。
[0018]所述经抗体孵育后的各阶段样品用无RNA酶的PBS缓冲液洗涤多次，每次1min ；洗涤之后加入BCIP/NBT显色液在4°C过夜或室温下2-4h避光显色处理，进而定位标记。
[0019]本发明具有如下优点:
[0020]1.牙鲆属于分批产卵的海水鱼类，取样通常在养殖场完成，无法进行随时取样，同时取样后也无法即刻完成后续的定位操作。海水鱼相较模式生物斑马鱼卵膜与胚盘间隙要小很多，剥除卵膜和卵黄困难，传统的保存方法不适用于本物种。本发明物种提供了一种可以取样后长期保存的方法。同时，经50%去离子甲酰胺保存后的胚胎样品比直接在固定液中保存的样品，更干净透亮，便于后续的操作。
[0021]2.牙鲆卵较软，固定及长期保存中均去掉Tween，直接用浓度为4% PFA固定，用含50%去离子甲酰胺的PBS长期保存。
[0022]3.传统原位杂交中抗体孵育后用MT洗涤，本发明中经抗体孵育后，用PBST替代MAT，可以减慢显色速度，信号检测效果很好，同时背景色较浅，适合于胚胎整体原位杂交。
[0023]4.本发明提出胚胎整体原位杂交后，杂交探针可以回收再利用，大大节约实验成本。
[0024]5.本发明提供了更加便利实用的样品保存方法，解决了传统胚胎整体原位杂交经甲醇脱水保存后导致去卵膜卵黄困难的问题，显色过程用PBST替换MT简化了操作步骤。本发明能很好地对牙鲆胚胎发育过程中的PGCs进行定位标记
【附图说明】
[0025]图1牙鲆早期胚胎发育原始生殖细胞的起源，迀移和增殖过程。
【具体实施方式】
[0026]实施例
[0027]1.取样，洗样。根据胚胎发育时序，在体视镜下跟踪受精卵的发育状态，采集各关键期样品0.5ml，用无RNA酶的PBS缓冲液，洗涤两次，洗去海水，每次l_2min。
[0028]2.固定。洗涤以后的胚胎样品置于15ml无RNAase离心管中，样品与浓度为4%PFA的体积比为1:10，颠倒混匀以后，平放置于4°C，固定24h。
[0029]3.长期保存。用含50%去离子甲酰胺缓冲液(含50%去离子甲酰胺缓冲液是由体积比为1:1的去离子甲酰胺:无RNA酶的PBS缓冲液混合)置换4% PFA,置于_20°C长期保存。
[0030]4.剖卵。在体式镜下，在胚胎样品中加入含50%去离子甲酰胺缓冲液使样品润湿，剖除卵膜和卵黄。
[0031]5.洗涤。剖除卵膜和卵黄后采用无RNA酶的PBS缓冲液，洗涤，5minX 3。
[0032]6.脱水。洗涤后采用梯度甲醇(甲醇(PBST) 25%、50%、75%、100% )脱水，每个梯度5min。
[0033]7.洗涤。脱水处理后再经用无RNA酶的PBS缓冲液，洗涤，5minX 3。8.复水。洗涤后再经梯度甲醇(甲醇(PBST) 100%、75%、50%、25% )复水，每个梯度5min。
[0034]9.预杂交。复水后加入至1.5ml无RNAase离心管中，再加入Iml预杂交液，封口膜封好，置于65°C烘箱，预杂交2h。