长链非编码rna afap1-as1在制备肺癌辅助诊断和预后判断制剂上的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNA AFAP1-AS1的原位杂 交探针、检测试剂及其应用方法。
【背景技术】
[0002] 人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划（The Encyclopedia of DNA Elements Pr〇ject，ENCODE)研宄成果表明，蛋白编码基因序列仅占人类基因组序 列的1-3%，而人基因组中绝大部分可转录的序列为长链非编码RNA(Long non-coding RNA，IncRNA)。LncRNA广泛地存在于各种生物中，且随着生物复杂程度的升高，基因组中 IncRNA序列的比例也相应地增大，提示IncRNA在生物进化过程中有重要意义。随着IncRNA 不断被发现，它们的功能逐渐被诠释，科学家们发现IncRNA广泛而活跃地参与到生命活动 不同层面的功能调控中，作为一个崭新的领域，已经成为国际生命科学研宄领域新的前沿 与热点。
[0003] LncRNA可作为功能蛋白质的信号（signal)、诱导（guide)、诱馆（decoy)或支架 (scaffold)分子等多种方式，在染色质重构、基因转录、翻译及蛋白修饰等多重水平调控基 因的表达，并在包括发育、免疫、生殖等基本生理过程中扮演了不可替代的角色，更重要的 是，IncRNA的表达与功能失调已经与包括恶性肿瘤在内的人类多种疾病紧密联系在了一 起。因此，深入研宄IncRNA的功能，揭示由IncRNA介导的遗传信息传递方式和表达调控网 络，不仅可以从蛋白编码基因以外的角度重新注释和阐明基因组的结构与功能，深入发现 生命活动的本质和规律，还有望从一个新的视角认识包括肿瘤在内的多种人类常见疾病的 发病机理，并为这些疾病的诊断与治疗提供新的分子标志物与治疗靶点。
[0004] 肺癌是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤，近50年来全球肺癌的发病率和 死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，在女性中则占 第二位。研宄表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，LncRNA 在肺癌的发生发展过程中可能也起到了重要的作用。最近我们利用IncRNA芯片，构建了 肺癌活检组织及正常对照样品中IncRNA的表达谱，从中筛选了一些在肺癌中差异表达的 IncRNAs，经扩大样本实时荧光定量PCR验证，证实IncRNA AFAP1-AS1 (NCBI accession number: NR_026892)在肺癌中表达显著上调，针对该IncRNA的检测制剂可以用于肺癌 的辅助诊断。随后，我们进一步增加样本，在226例有临床随访资料的肺癌石蜡存档标本 中，通过原位杂交（in situ hybridization)的方法检测了 AFAP1-AS1的表达水平，发现 AFAP1-AS1表达高的患者更容易发生转移，其生存时间短于该IncRNA表达低的患者，因此 针对该IncRNA的检测制剂也可以用于肺癌的预后判断。
[0005] 我们通过设计并合成靶向AFAP1-AS1的短发夹RNA(short-hairpin RNA, shRNAs) 序列，构建了靶向AFAP1-AS1的RNA干扰载体，转染到肺癌细胞株中，在体外培养细胞 模型中证实了靶向干扰AFAP1-AS1的表达可明显抑制肺癌细胞的侵袭与转移能力。将 AFAP1-AS1的RNA干扰载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米基因转运体， 多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒可保护AFAP1-AS1的RNA干扰载体免受核酸酶降解，延长作 用时间，且有更高的转染效率。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供长链非编码RNA AFAP1-AS1的原位杂交探针、试剂及其应用 方法，利用长链非编码RNA AFAP1-AS1序列可以制备用于肺癌预后预测的制剂。
[0007] LncRNA AFAP1-AS1的应用方法，用于制备肺癌疗效预测的制剂，该长链非编码RNA AFAPI-ASl的序列如SEQ NO: 1所示。
[0008] 所述的肺癌疗效预测的制剂为原位杂交检测试剂。
[0009] 所述的原位杂交检测试剂中包括用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸 探针，序列如下：
[0010] AFAP1-AS1 探针 1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3'，SEQ N0:2，
[0011] AFAP1-AS1 探针 2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3'，SEQ NO: 3，
[0012] AFAP1-AS1 探针 3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'，SEQ N0:4。
[0013] 所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。
[0014] 试剂盒中含有上述用于原位杂交检测AFAP1-AS1表达的寡核苷酸探针：
[0015] AFAP1-AS1 探针 1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3'
[0016] AFAP1-AS1 探针 2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3，
[0017] AFAP1-AS1 探针 3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'
[0018] 阳性对照探针（检测看豕基因 GAPDH):
[0019] GAPDH 探针 1 :5' -CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'，SEQ N0:5，
[0020] GAPDH 探针 2 :5, -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3,，SEQ N0:6，
[0021] GAPDH 探针 3 :5, -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3,，SEQ NO: 7。
[0022] 试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物 检测试剂、DAB染色试剂；
[0023] 其它常规生物化学试剂，包括20x柠檬酸钠缓冲溶液（saline sodium citrate, SSC)，硫酸葡聚糖（Dextran sulphate)，去离子甲酰胺（Deionized Formamide)， 多聚腺苷酸（polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺苷酸（polydeoxyadenylic acid， Poly dA)，变性剪切的娃精 DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)， 酵母转运 RNA(yeast t-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇（DTT)，50x 邓罕氏缓冲液（Denhardts' s solution)，磷酸缓冲液（PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白（BSA)，三乙醇胺 (TEA)，醋酸酐，阻断试剂（Blocking reagent agent)，TNB 缓冲液（即：ρΗ7· 5 的 0· IM Tris-Cl+0. 15Μ NaCl+0. 5 % 阻断试剂），TNT 缓冲液（即：ρΗ7· 5 的 0· IM Tris-Cl+0. 15Μ NaCl+0. 05% Tween 20) 〇
[0024] 我们通过原位杂交在存档的肺癌石蜡组织标本中发现AFAP1-AS1的表达与肺癌 患者的预后密切相关，AFAP1-AS1表达高的患者生存时间更短，提示AFAP1-AS1可作为肺癌 预后预测的分子标志。本发明为肺癌的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工 具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
【附图说明】
[0025] 图1为实时荧光定量PCR技术验证IncRNA AFAP1-AS1在肺癌和癌旁肺组织中的 表达情况，AFAP1-AS1在肺癌（T)中的表达比癌旁肺组织（N)中显著提高；
[0026] 图2为原位杂交检测AFAP1-AS1在肺癌中的表达情况；
[0027] 在85 %的肺癌（226例肺癌组织中的192例）中检测到有AFAP1-AS1的高表达 (左），其余的34例肺癌组织中AFAP1-AS1的表达较低（右）；
[0028] 图3为肺癌