长链非编码gas5缺陷的人a375稳转细胞株及构建方法
【专利摘要】本发明属于医学分子生物学领域。本发明所述的长链非编码GAS5缺陷的人A375稳转细胞株是将设计合成的F链5’-GATCCTGGCACAAGAAGATTAAAACTCGAGTTTTAATCTTCTTGTGCCATTTTTG-3’和R链5’-AATTCAAAAATGGCACAAGAATATTAAAACTCGAGTTTTAATCTTCTTGTGCCAG-3’经退火形成DNA双链，然后插入慢病毒载体pLVX-shRNA2中，再感染A375细胞，使得这一DNA双链整合到A375细胞的基因组中，靶向敲减A375细胞内源性GAS5表达90％以上的稳转细胞株。与传统的反义核酸技术相比，本发明具有特异性强、针对性强、级联放大等优点。
【专利说明】长链非编码GAS5缺陷的人A375稳转细胞株及构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医学分子生物学领域。
【背景技术】 [0002]人类2万个左右的蛋白编码基因只占到整个基因组的2%，而90%以上的人类基因组都是发生了转录的，这就意味着相当数量的转录本是不编码蛋白质的，这部分转录本被称为“非编码RNA” (non-codingRNA, ncRNA)。之前它们被认为是转录“噪音”，然而越来越多的研究表明ncRNA在细胞生长、分化及代谢等过程中发挥着重要的生物功能。依据ncRNA的长度将其分为两类，长度在200个核苷酸以下的称为短链非编码RNA，长度在200个核苷酸以上的则称之为长链非编码RNA(longnon-codingRNA，IncRNA)。短链非编码RNA包括长度在21-23nt之间的微小RNA (microRNAormiRNA)、小分子干扰RNA(smallinterferenceRNA, siRNA)、核内小分子 RNA(smallnucleolarRNA, snoRNA)以及与piwi蛋白相互作用的RNA(piwi_interactingRNAs, piRNAs)等。IncRNA的研究相对较少，但是近年来发现IncRNA在表观遗传学水平、转录水平、转录后水平及翻译水平广泛参与基因表达的调控。IncRNA除了与系统性红斑狼疮、Alzheimer及心脑血管疾病等多种疾病的发生发展相关外，还与多种肿瘤的发生关系密切，其中部分IncRNA与黑色素瘤的发生发展关系密切。
[0003]长链非编码RNA生长阻滞特异性转录本5 (GrowthArrestSpecif ictranscript5, GAS5)的基因定位于lq25.1，包含12个外显子和11个内含子，其基因全长为4087bp，成熟的GAS5转录本为651nt。GAS5最早是在1988年研究对生长阻滞敏感的基因时发现，这一转录本的表达具有组织特异性，在生长活跃的细胞中表达水平极低，但是在生长阻滞的细胞中表达水平明显升高。近年发现GAS5调控T淋巴细胞正常情况下的生长阻滞，并且在哺乳动物雷帕霉素革G体蛋白(mammaliantargetofRapamycin, mTOR)拮抗剂产生的T淋巴细胞分化抑制过程中，需依赖GAS5的参与。Mourtada等认为GAS5发挥功能主要通过其内含子编码的核内小分子RNA (smallnucleolarRNA, snoRNA)。GAS5具有不同的转录本，不同的转录本在不同的细胞株中功能相差很大，其中的GAS51B、GAS52B、GAS53A、GAS54A在不同的细胞系中过表达以后，会增加细胞对凋亡的敏感性，GAS5-01在乳腺癌中明显低于其他转录本。
[0004]目前尚没有发现有关长链非编码RNAGAS5与黑色素瘤发生发展关系的文献报道。
[0005]黑色素瘤是发生于皮肤黑色素细胞的恶性肿瘤，恶性程度高，预后极差，发病率在全球范围内呈现升高趋势。根据美国癌症协会2013年发布的数据，在大多数恶性肿瘤发病率和死亡率均下降的情况下，黑色素瘤的发病率依然却呈现上升趋势，年增长率在
2.5% -3.9%之间。全球每年黑色素瘤新发病例199627例，死亡例数为46372例。虽然黑色素瘤在我国发病率较低，但近年来成倍增长，2000年发病率统计仅为0.2/10万，2005-2007年我国发病率约1/10万，每年新发病例约2万人。黑色素瘤已经成为严重危及我国人民健康的疾病之一。尽管有学者提出，黑色素瘤的发生是遗传与环境共同作用的结果，如容易形成色素痣及过多暴露于阳光下等，但是发病的分子机制仍未阐明，深入了解黑色素瘤发生发展机制和寻找有效治疗方法目前亟待解决的问题。
【发明内容】
[0006]本发明的目的旨在提供一种长链非编码GAS5缺陷的人A375稳转细胞株，作为模型用于研究GAS5与肿瘤的相关性及其可能的机制。
[0007]本发明的另一目的在于提供这种细胞株的构建方法。
[0008]本发明所述的长链非编码GAS5缺陷的人A375稳转细胞株是将设计合成的F链5’ -GATCCTGGCACAAGAAGATTAAAACTCGAGTTTTAATCTTCTTGTGCCATTTTTG-3’ 和 R链
[0009]5，-AATTCAAAAATGGCACAAGAATATTAAAACTCGAGTTTTAATCTTCTTGTGCCAG-3，经退火形成DNA双链，然后插入慢病毒载体pLVX-shRNA2中，再感染A375细胞，使得这一 DNA双链整合到A375细胞的基因组中，靶向敲减A375细胞内源性GAS5表达90%以上的稳转细胞株。[0010]上述的A375细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。该细胞株来源于一位54岁的女性，是D.J.Giard等人建立的一系列细胞株中的一株。该细胞属上皮细胞，贴壁生长，具有致瘤性，它在抗胸腺细胞球蛋白(免疫抑制剂)、血清处理的NIH瑞士小鼠中形成类似于恶性黑素瘤的快速增长的皮下肿瘤。经细胞遗传学分析显示此细胞是含有62条染色体的亚三倍体细胞，其中9条标记染色体，其DNA上的STR位点有:Amelogenin:X ;CSF1P0:11，12 ;D13S317:11，14 ；D16S539:9 ;D5S818:12 ；D7S820:9 ；THOl:8 ；TPOX:8, 10及vWA:16，17。本发明所述的长链非编码GAS5缺陷的人A375稳转细胞株是将上述DNA双链片段插入含ZsGreenl绿色荧光蛋白基因的pLVX_shRNA2表达载体，再转入A375细胞株，在细胞中表达siRNA，经阳性细胞克隆筛选，qRT-PCR定量检测显示siRNA靶向沉默了内源性GAS5的表达量达90%以上，经多次传代培养，荧光强度稳定且干扰效率未降低。
[0011]本发明所述的长链非编码GAS5缺陷的人A375稳转细胞株的构建方法由以下步骤组成:
[0012]一、shRNA序列设计与合成
[0013]干扰序列由TBI在线程序设计，根据干扰序列设计互补序列，经添加BamHI和EcoRI酶切位点、6个核苷酸的loop结构发卡环和保护性碱基制备成靶向人GAS5的shRNA的F链，依据碱基互补配对合成R链；
[0014]二、构建shRNA-慢病毒表达载体
[0015]将设计好的shRNAF链和R链单链等体积混合，煮沸，退火后形成双链；BamHI和EcoRI双酶切慢病毒载体pLVX-shRNA2使之成为线性质粒，shRNA双链与线性质粒在T4DNA连接酶作用下连接形成重组质粒，重组质粒转化E.coliDH5 α感受态细菌，含氨苄青霉素的LB固体培养基平板涂布，培养过夜，挑选阳性菌落扩增培养，提取质粒测序鉴定，shRNA-慢病毒表达载体构建成功；
[0016]三、慢病毒包装与生产
[0017]病毒包装质粒和重组质粒pLVX_shRNA2-GAS5_shRNA 通过 lipofectamine2000 共转染293T细胞，6h后取出培养皿，弃去培养基，I XPBS清洗细胞3次，轻柔地加入8ml新鲜的293T培养基，继续培养；细胞转染36h后，收集培养基上清液作为慢病毒液，之后每3h收集一次,共收集3-4次；每次收集的病毒上清液用0.45 μ m的针头滤器过滤，以去除293T细胞；
[0018]四、慢病毒感染A375细胞
[0019]根据预实验确定细胞所需感染复数以及病毒对细胞状态和传代的影响，感染复数定义为感染时病毒和细胞数量的比值，病毒感染细胞前，用胰酶消化处于生长对数期的A375细胞，离心后用无抗生素的培养基重悬细胞，并进行细胞计数；取5X IO5个A375细胞接种于培养皿中，待细胞贴壁后，向培养皿中加入2ml温浴后的病毒上清液，加入终浓度为2 μ g/ml的聚凝胺Polybrane ;培养3h，弃去培养基，更换2ml病毒上清液继续培养，重复2次；
[0020]五、A375-GAS5 Λ稳转细胞株筛选和鉴定
[0021]Α375细胞经病毒上清液感染3次后，向培养皿中加入无抗生素的培养基，培养48h后，弃去培养基，换用含氨苄青霉素Ampicillin的培养基并筛选阳性细胞；隔日观察细胞，弃去原培养基及死细胞，I XPBS清洗细胞3次，更换抗性培养基唏嘘培养细胞，持续筛选7天；待细胞长满，消化细胞，接种于IOmm培养皿中扩增培养，传代3次；筛选后置于荧光显微镜下观察，所有细胞均呈现出高亮的绿色荧光；进一步行qRT-PCR检测GAS5的表达，结果显示A375-GAS5 Λ细胞株中GAS5的表达量较Α375细胞下降了 93.74%，干扰效率达到预期，长链非编码GAS5缺陷的人Α375稳转细胞株构建成功。
[0022]目前国内外文献中尚未见到GAS5缺陷的人黑色素瘤Α375稳转细胞株及其相关研究的报道。本申请应用shRNA-慢病毒系统沉默Α375细胞内源性GAS5的表达，构建了 GAS5缺陷的Α375稳转细胞株(A375-GAS5 Δ )，并对其GAS5的表达进行了检测。本模型可用于探究长链非编码RNAGAS5与肿瘤的相关性及其机理；为深入研究长链非编码RNAGAS5与黑色素瘤发生发展的可能机制奠定材料基础。
[0023]本申请构建的GAS5缺陷的Α375细胞的方法不同于现有技术。一方面RNAi技术是近几年快速发展起来的一项基因沉默技术，其机制为:在生物体细胞内，外源性或者内源性的双链RNA(double-strandedRNA, dsRNA)引起同源mRNA特异性的讲解,从而抑制目的基因表达的技术。与传统的反义核酸技术相比，具有特异性强、针对性强、级联放大等优点。另一方面，通过构建pLVX-shRNA2-GAS5-shRNA重组载体并生成慢病毒颗粒感染A375细胞，将携带GAS5-shRNA的DNA模板随病毒基因组整合到A375细胞基因组。由于pLVX_shRNA2载体具有U6启动子能启动GAS5-shRNA的表达，GAS5-shRNA自身形成发卡结构，细胞核内表达的GAS5-shRNA转运至细胞质后在Dicer酶的作用下被切割成GAS5_siRNA，经由RISC复合物介导特异性地沉默靶基因。所使用的pLVX-shRNA2载体具有氨苄青霉素抗性，可用于单克隆细胞挑选。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是质粒pLVX_shRNA2的物理图谱。
[0025]图2是干扰序列的测序结果图。
[0026]图3是qRT-PCR检测干扰效率结果图。
[0027]图4是病毒感染细胞显微图40X。
[0028]图5是qRT-PCR检测稳转细胞株中GAS5的表达量。【具体实施方式】
[0029]1.选择干扰载体及设计合成shRNA模板DNA
[0030]选取PLVX-shRNA2作为干扰载体，GAS5 (NR_002578.2)的3条干扰序列及无关对照序列由 TBI 在线数据库设计(http://RNA.tb1.univie.ac.at/cg1-bin/RNAxs),经添加酶切位点、发卡环和保护性碱基制备成靶向人GAS5的siRNA的F链，依据碱基互补配对原则合成R链。
[0031 ] 2.shRNA模板DNA插入载体
[0032]将设计好的GAS5shRNA的F链与R链分别等体积混合后，沸水浴中煮沸5min，然后72°C保持15min，自然冷却至室温，约60min，备用。载体双酶切，在无菌的0.2mLEP反应管，取pLVX-shRNA2载体15 μ L，用BamHI与EcoRI双酶切，酶切体系按照说明书配制，混匀后，37°C反应4h以上，用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，最终得到洗脱出的DNA。将制备好的GAS5shRNAl， 2，3片段各4 μ L与载体I μ L，及T4DNALigase等配备反应体系16°C连接2h，如图1所示。
[0033]3.重组干扰载体转化DH5ci感受态细菌并鉴定
[0034]连接产物的转化，冰浴中将5 μ L连接产物分别加入至50 μ LDH5 α感受态细胞中，轻轻旋转混匀，冰浴30min，42°C水浴热休克90min，快速将管转移至冰浴中，冰浴2min后加入200 μ LLB培养基，混匀，37°C、200rpm振荡培养lh，于超净工作台中，将菌液均匀涂布于含氨苄青霉素(Amp) (100yg/mL)的LB平板上，室温下放置，倒置平板，转移入37°C生化培养箱过夜培养。次日观察LB培养基浊度，超净台内取600 μ I菌液，加入280 μ I甘油混匀，-20°C保存，其余菌液采用带有纯化柱的高纯质粒小量提取试剂盒，按照说明书操作。提取后的重组干扰载体送华大基因进行测序，测序结构显示重组载体构建成功，如图2所示。
[0035]4.慢病毒包装与生产
[0036]293T细胞经复苏，传代，当细胞密度达70%-80%时即可用于转染。转染前2个小时，将细胞培养基更换为无双抗完全培养基，准备DNA沉淀液。将40μ LLipOfectamine2000和1.46ml完全培养基加入到1.5mlEP管中(标记为A管)；在另一 1.5mlEP管(标记为B管)中加入DNA沉淀液,重组质粒及包装质粒共1.5ml,慢病毒包装质粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)按照1:1:1比例混合。将B管中的DNA沉淀液缓缓地逐滴加入到A管中，轻轻混匀。在室温静置一段时间后，将沉淀混合物逐滴均匀加入到IOcm细胞培养皿中，轻轻晃动，放入37°C、5% C02培养箱中培养。转染次日早上，弃去旧培养基，每皿加入IOml新鲜完全培养基(含I %双抗)。收集病毒，分别收集转染24h和48h的含病毒培养上清液，1000rpm离心5min,上清用0.45 μ m针头滤器过滤，以去除293T细胞；4°C、50000g高速离心2h，弃上清液，病毒沉淀用ImlPBS充分溶解，再用0.22 μ m针头滤器过滤，除去可能的细菌(细菌直径一般0.5 μ m),取出一部分病毒-80 °C保存留作后用。
[0037]5.慢病毒感染A375细胞
[0038]根据预实验确定感染复数:准备2个无菌的1.5mLEp管，在每个管中加入45 μ L的常规培养基，吸取5 μ L的I X 108TU/mL的病毒(预先从-80°c取出在冰上融化)加入到第一个管中，轻柔混匀，勿使产生泡沫。同样从第一管中吸取5μ L的病毒到第二个管中，混匀，第一个管中的病毒滴度为I X 107TU/mL,而第二个管中的滴度为I X 106TU/mL ;将10 μ L三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。加入的病毒量分别为I X IO6TU, I X IO5TU, I X IO4TU,细胞的数目为IXIO4个，三个孔的MOI分别为100、10、I ;在水平方向轻轻拍打培养板，使培养基和病毒等试剂充分混匀，然后把细胞板放回培养箱孵育；培养8~12h以后观察细胞状态，弃去细胞上清液，更换为新鲜培养基。感染2~3天后，观察荧光表达情况，通过观察细胞感染效果，确认目的细胞的感染最佳MOI为100。取密度为IXlO6Ail的A375细胞5ml，加入滴度为IX 108TU/mL的病毒5ml，充分混匀后放回CO2培养箱孵育；12小时后更换新鲜培养基；72小时后观察荧光表达情况，发现绝大多数细胞呈现绿色荧光。
[0039]注:Μ0Ι:是“Multiplicityoflnfection”的缩写，中文为感染复数或者复感染指数，含义为感染时病毒和细胞数量的比值。 [0040]6.荧光定量PCR检测瞬时转染后3个重组载体的干扰效率
[0041]细胞内总RNA提取:瞬转后细胞培养于6孔板中，当细胞汇合度达到约80%时，弃去培养基，加入预冷的IXPBS溶液Iml清洗细胞I次，加入RNAisoPluslml/well，枪头吹打，使细胞充分裂解；室温放置5min后转移至1.5mlEP管(DEPC处理)中，加入氯仿0.2ml,用力振摇15s。室温静置5min后，离心(4°C，12000rpm, 15min)。离心后液体分为三层(无色上清液，中层白色蛋白层和底层红色有机层)。小心吸取上清液并转移至另一支EP管中，加入等体积异丙醇，混匀，-2(TC下静置30min,离心(4?，12000rpm, IOmin)。弃去上清液，加入lml75%乙醇，温和振荡悬浮沉淀，离心(4°C，12000rpm, 5min)，尽量弃去乙醇，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。后每管加入20-50 μ I水(DEPC处理)溶解。
[0042]逆转录合成cDNA:取总 RNA2ng_2 μ g，用 ReverseTranscriptaseM-MLV 逆转录酶，按说明合成cDNA。具体步骤:先在总RNA中加入2μ I随机引物(浓度为25 μ Μ)，加水(DEPC处理)补足至12 μ 1，混匀，70°C温育IOmin后，冰浴急冷2min。依次加入RNA酶抑制剂 0.5 μ I,5XM-MLVBuffer4μ 1，RTaseM-MLV(200U/μ 1)0.5 μ 1，dNTPMixture (各IOmM) I μ 1，加水(DEPC处理)补足至20μ 1，30°C反应lOmin，再42°C保温lh，最后70°C保温15min灭活反转录酶后冰上冷却。
[0043]荧光定量PCR:按说明书配置反应体系，上机进行PCR扩增和检测。反应总体系为20 μ 1，具体是2 X MixSYBRGreenI荧光反应液10μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各0.25μ 1，样品模板I μ I，用灭菌水补足20 μ I体系。反应条件95°C 2min预变性，循环内95°C 30s变性，60°C退火35s，PCR反应设置40个循环，并在每个循环延伸末收集荧光信号，绘制扩增曲线。40个循环后设置(95°C 15s，60°C 30s, 95°C 15s)反应步骤，并且对60°C到95°C升温过程进行全程突光信号收集，绘制融解曲线。用Bio-RadCFXManagerversionl.6软件进行数据分析，如图3所示。
[0044]7.重组干扰载体干扰效率筛选及缺陷GAS5的A375-GAS5 Λ稳转细胞株构建
[0045]根据荧光定量PCR检测结果筛选出干扰效率最高的重组载体对应的病毒颗粒进行后续试验。将该病毒颗粒反复多次感染Α375细胞，具体操作为:A375-WT细胞经病毒上清液感染3次后，向培养皿中加入无抗生素的DMEM(10% FBS)培养基，37°C，5% C02条件下培养48h后，弃去培养基，更换带有Ampicillin (0.5 μ g/ml)的培养基培养以筛选阳性克隆。待细胞长满时，消化细胞，接种于IOmm培养皿中扩增培养，隔日观察细胞，弃去原培养基及死细胞，IXPBS清洗细胞3次，更换DMEM(10% FBS, 0.5 μ g/mlAmpicillin)培养基继续培养细胞，传代3次后于荧光显微镜下观察，视野下全部细胞均带有绿色荧光，提示慢病毒载体成功感染A375细胞,如图4所示。[0046]8.GAS5缺陷的A375-GAS5 Λ稳转细胞株筛选及鉴定
[0047]荧光定量PCR鉴定A375-GAS5 Λ稳转细胞株:荧光定量PCR检测A375-GAS5 Λ稳转细胞内GAS5 Δ mRNA表达水平。总RNA提取、逆转录合成cDNA和荧光定量PCR过程同前，如图5所示。
【权利要求】
1.一种长链非编码GAS5缺陷的人A375稳转细胞株，其特征在于是将设计合成的F链
5’ -GATCCTGGCACAAGAAGATTAAAACTCGAGTTTTAATCTTCTTGTGCCATTTTTG-3’ 和 R链 5，-AATTCAAAAATGGCACAAGAATATTAAAACTCGAGTTTTAATCTTCTTGTGCCAG-3 ’ 经退火形成DNA双链，然后插入慢病毒载体pLVX-shRNA2中，再感染A375细胞，使得这一 DNA双链整合到A375细胞的基因组中，靶向敲减A375细胞内源性GAS5表达90%以上的稳转细胞株。
2.如权利要求1所述的长链非编码GAS5缺陷的人A375稳转细胞株的构建方法，其特征在于由以下步骤组成: 一、shRNA序列设计与合成 干扰序列由TBI在线程序设计，根据干扰序列设计互补序列，经添加BamHI和EcoRI酶切位点、6个核苷酸的loop结构发卡环和保护性碱基制备成靶向人GAS5的shRNA的F链，依据碱基互补配对合成R链； 二、构建shRNA-慢病毒表达载体 将设计好的shRNAF链和R链单链等体积混合，煮沸，退火后形成双链；BamHI和EcoRI双酶切慢病毒载体pLVX_shRNA2使之成为线性质粒，shRNA双链与线性质粒在T4DNA连接酶作用下连接形成重组质粒，重组质粒转化E.coliDH5a感受态细菌，含氨苄青霉素的LB固体培养基平板涂布，培养过夜，挑选阳性菌落扩增培养，提取质粒测序鉴定，shRNA-慢病毒表达载体构建成功； 三、慢病毒包装与生产 病毒包装质粒和重组质粒pLVX-shRNA2-GAS5-shRNA通过lipofectamine2000共转染293T细胞，6h后取出培养皿，弃去培养基，IXPBS清洗细胞3次，轻柔地加入8ml新鲜的293T培养基，继续培养；细胞转染36h后，收集培养基上清液作为慢病毒液，之后每3h收集一次,共收集3-4次；每次收集的病毒上清液用0.45 μ m的针头滤器过滤，以去除293T细胞； 四、慢病毒感染A375细胞 根据预实验确定细胞所需感染复数以及病毒对细胞状态和传代的影响，感染复数定义为感染时病毒和细胞数量的比值，病毒感染细胞前，用胰酶消化处于生长对数期的A375细胞，离心后用无抗生素的培养基重悬细胞，并进行细胞计数；取5X IO5个A375细胞接种于培养皿中，待细胞贴壁后，向培养皿中加入2ml温浴后的病毒上清液，加入终浓度为2 μ g/ml的聚凝胺Polybrane ;培养3h，弃去培养基，更换2ml病毒上清液继续培养，重复2次； 五、A375-GAS5Λ稳转细胞株筛选和鉴定 Α375细胞经病毒上清液感染3次后，向培养皿中加入无抗生素的培养基，培养48h后，弃去培养基，换用含氨苄青霉素Ampicillin的培养基并筛选阳性细胞；隔日观察细胞，弃去原培养基及死细胞，I X PBS清洗细胞3次，更换抗性培养基唏嘘培养细胞，持续筛选7天；待细胞长满，消化细胞，接种于IOmm培养皿中扩增培养,传代3次；筛选后置于突光显微镜下观察，所有细胞均呈现出高亮的绿色荧光；进一步行qRT-PCR检测GAS5的表达，结果显示A375-GAS5 Λ细胞株中GAS5的表达量较Α375细胞下降了 93.74%，干扰效率达到预期，长链非编码GAS5缺陷的人Α375稳转细胞株构建成功。
【文档编号】C12N5/09GK103937745SQ201410174911
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】朱月春, 陈龙, 况应敏, 蔡天池, 王艳玲, 李玉倩 申请人:昆明医科大学