一种预测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种预测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的试剂，更具体的说 是通过测定与AMD相关基因 VEGF-A的多态性预测受试者对于雷珠单抗治疗年龄相关性黄 斑变性的易感性，该方法可用于指导年龄相关性黄斑变性雷珠单抗的个体化治疗，属于生 物技术领域。
【背景技术】
[0002] 年龄相关性黄斑变性（Age-related macular degeneration，AMD)是西方 50 岁以 上人群致盲的首要原因，研宄发现AMD可能与紫外线照射、微量元素缺乏等有关，但具体病 因仍不清楚。国内的调查显示，年龄相关性黄斑变性发病率为15. 5%，其发病率随着年龄的 增加而增加。随着人口老龄化的到来，年龄相关性黄斑变性已经成为我国老年人致盲的首 要原因。主要表现是患者视物变形、视力下降、眼前黑影遮挡，眼底表现是出血、渗出，严重 者视力完全丧失，进而严重危害老年人的生活质量。
[0003] AMD属多基因疾病，具有明显的遗传倾向，虽然通常认为遗传与环境因素在AMD发 病中起主导作用，但确切的病因与发病机制仍不清楚。
[0004] 研宄发现，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF)是 导致年龄相关性黄斑变性（AMD)脉络膜新生血管（CNV)形成的关键因子，抗VEGF药物雷珠 单抗能够结合血管内皮生长因子A (VEGF-A)所有亚型，有效抑制CNV的生长及渗漏，但仍有 25. 8 %患者治疗后最终视力低于基线视力。
[0005] 目前进行AMD遗传病因研宄，多采用SNP作为基因组标志的关联分析方法，是有效 的。SNP是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率 需>1%，SNPs是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70. 1 %为同型碱基之间的转换：如 G/A或T/C，29. 1 %为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。C (胞嘧啶）是人类基因组中最易发生 变化的位点，因为大多数是甲基化胞嘧啶，能够自发脱氨基转换为T(胸腺嘧啶），SNP包含 了已知多态性的80-90%，是最常见的遗传变异。
[0006] 由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。 SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个。SNP以其密度高（平均 每Ikb就有1个）、代表性强（位于基因内部的SNP可能直接影响蛋白质结构或表达水平）、 遗传稳定性好（同微卫星多态性比较而言）、易于自动化分析（因 SNP在人群中多为双等位 基因标记，可简单以"+/ -或1/0"直接分型）等特点成为很好的遗传标志。
[0007] 目前国外多选取WAMD易感基因研宄其与雷珠单抗疗效的相关性。有报道研宄药 物治疗的靶基因及其通路VEGF及VEGFR变异与雷珠单抗疗效的相关性，但结论不一致。目 前尚无任何关于VEGF-A基因 rs3025018T>G位点与雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效 相关的研宄结果。
【发明内容】
[0008] 本发明的主要目的是提供一种预测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的方 法。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种预测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的 试剂，包括PCR引物和含有该引物的试剂盒。
[0010] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0011] 一种预测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的方法，通过提取宿主细胞的基 因组DNA，测定受试者的VEGF-A基因第6内含子rs3025018T>G位点的基因型，预测受试者 对雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性的疗效；VEGF-A基因第6内含子区rs3025018T>G位 点的基因型为GT时，受试者对雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性的疗效较好；携带G等位 基因时，受试者对雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性的疗效较好。
[0012] 本发明提供了一种分离核酸，具有SEQ ID No. 1所示的碱基序列，其+501位即是 变异位点，以字母"B"标示出。该核酸序列为VEGF-A基因全长序列。图1为VEGF-A基 因结构及其多态性变异位点的示意图，附图中包含有7个外显子，rs3025018T>G位点标在 VEGF-A基因图中第6内含子区的相应位置。
[0013] 本发明提供了一组检测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的特异性引物，具 有SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示的碱基序列，长度均为20bp，而且可以特异性地扩增出 包含有SEQ ID No. 1所示序列中+501位置的产物。
[0014] 本发明提供了一种检测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的诊断试剂盒，其 中含有本发明特异性扩增VEGF-A基因+501位点的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的 常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。本发明试剂盒 中的全部组分、含量、来源和使用方法如下：
[0015] -种检测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的诊断试剂盒，含有SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示的特异性引物。
[0016] -种检测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的诊断试剂盒，由以下试剂组 成：
[0017] 30 μ L 10 X PCR 缓冲液；
[0018] 5 μ L浓度为IOmM的dNTP混合液；
[0019] 5 μ L浓度为2U/ μ L的TaqDNA聚合酶；
[0020] 2. 5 μ L 浓度为 IOpM/ μ L 的 Fl 引物；
[0021] 2. 5 yL浓度为 IOpM/yL 的 Rl 引物；
[0022] 235 μ L 纯水。
[0023] 所述Fl引物具有SEQ ID No. 2所示的碱基序列；Rl引物具有SEQ ID No. 3所示 的碱基序列。
[0024] 使用方法：
[0025] 1)PCR扩增：通过PCR扩增VEGF-A基因的第6内含子区部分片段，制备混合液： 10XPCR 反应缓冲液 3 μ L，10mM/L dNTP 0· 5 μ L，TaqDNA 聚合酶 0· 5 μ L，10pM/L 上游引物 0. 5yL，10pM/L下游引物0. 5yL，基因组DNA 2yL，加纯水至30yL。PCR反应条件为95°C 预变性5min，95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸25s，总共35个循环，72°C总延伸2min。 PCR前于每一体系中加入20 μ L的石蜡油，以防止液体挥发。
[0026] 2)基因型判定：将PCR产物直接测序，根据荧光信号的差异判定基因型。
[0027] 本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品来源无限制，如：体液（血 液、腹水及尿液等）、组织细胞（如肝组织）等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组 DNA。调整基因组DNA的浓度，使其尽可能的一致。以基因组DNA为模板，可扩增出含VEGF-A 基因突变位点的核酸片段，以获取测定的大量样本。这种通过扩增含VEGF-A基因变异点的 DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。
[0028] 在进行基因辅助诊断时，本发明优先适用于测定根据VEGF-A基因的突变类型 存在的辅助诊断试剂，辅助诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定 VEGF-A基因突变类型的方法。按采用的测定方法来选择适当的特定试剂，如DNA片段和/ 或用于PCR扩增步骤的引物。
[0029] 本发明的优点是：本发明首次阐明了 VEGF-A基因多态性位点与雷珠单抗治疗年 龄相关性黄斑变性疗效相关性，提供了一种预测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的 方法，该方法可用于指导年龄相关性黄斑变性雷珠单抗的个体化治疗。
[0030] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步叙述，以便公众对
【发明内容】
有更 深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换， 均属于本发明的保护范围。
【附图说明】
[0031] 图1为VEGF-A基因结构