Ct2值在32-35之间， 或所述Ct 2值和Ct i值之差Λ Ct大于1并且小于3个Ct值（1〈 Λ Ct〈3)时，则需要重复所 述步骤⑴的扩增。
[0030] 本发明通过采用具体的Ct值来进行结果分析，使得结果分析更加方便和直观，而 且，通过本发明所设定的Ct标准，可以有效避免检测结果中假阳性和假阴性结果的出现， 保证了检测结果的高准确性。
[0031] 本发明中可以选用不同的特异性引物和特异荧光标记探针实现同时定量检测多 种致病菌。
[0032] 本发明中所述食品为乳制品、肉制品、?制品或罐头食品中的任意一种，不作特别 限制。
[0033] 作为本发明优选的技术方案，所述检测方法具体包括以下步骤：
[0034] (1)扩增步骤：将疑似含有目标致病菌的样品通过非特异性培养进行致病菌的扩 增；
[0035] (2)实时定量取样步骤：在步骤（1)所述扩增过程中取样两次，第一次取样是在培 养阶段的零时刻进行，第二次取样是在培养阶段的第8_24h时进行；并将取样所得样品中 的致病菌迅速灭活或冻存；
[0036] (3)特异性实时定量PCR鉴定步骤：对步骤（2)中实时定量取样所得样品进行直 接特异性实时定量PCR或DNA提取后，对提取出的DNA进行特异性实时定量PCR鉴定分析； 和
[0037] (4)根据特异性实时定量PCR鉴定分析所得Ct值进行数据处理并分析结果的 步骤；所述Ct值用来分析样品中某种活性目标致病菌的初始浓度及扩增过程的状态；和 /或，所述Ct值用来分析样品中某种目标致病菌初始浓度中死亡致病菌和活性致病菌的 比例；其中，所述Ct值有两个，分别为培养阶段的零时刻所对应的Ct 1值和培养阶段的第 8-24h所对应的Ct2值。
[0038] 当所述以2值>35时为阴性，表示未检出所述致病菌；当所述Ct 2值〈32时为阳性， 表示检出所述致病菌。
[0039] 当所述(^2值〈32并且所述Ct 2值和Ct i值之差Λ Ct大于4个Ct值时，表示检出 所述致病菌为活性菌。
[0040] 当所述Ct2值在32-35之间，或所述Ct 2值和Ct i值之差Λ Ct大于1并且小于3个 Ct值时，则需要重复所述步骤（1)的扩增。
[0041] 本发明所述检测方法可用于具体分析样品中某种目标致病菌初始浓度中死亡致 病菌和活性致病菌的情况。具体方法为：对于以 2值〈32的阳性样品，还需进行以下检测： (1)测定其零时刻的Ct1值；如果零时刻的Ct ^直>35,则说明该致病菌为活菌；(2)如果其 零时刻的Ct1值也〈35,说明该致病菌中有死菌污染；（3)对于含有死菌污染样品的Ct 2值， 如果Ct2值和零时刻的Ct i值之差Λ Ct大于4时，说明同时也有活菌污染；(4)对于含有死 菌污染样品的以2值，如果Ct 2值和零时刻的Ct i值之差Λ Ct不大于4时，要做2次增菌比 较；如果2次增菌样品8-24h时刻的Ct2值比2次增菌前Ct i值降低4个Ct值，表明有活菌 污染。
[0042] 第二方面，本发明还提供了一种用于第一方面所述方法的试剂盒，其包括：非特异 性培养基；目标致病菌的DNA提取试剂；能够与目标致病菌DNA相结合的特异性引物对；能 够与目标致病菌DNA扩增产物相结合的特异性荧光标记探针；和实时定量PCR鉴定试验用 试剂；
[0043] 其中，所述非特异性培养基为巯基乙酸盐培养基、LB液体培养基或月桂基硫酸盐 胰蛋白胨（LST)肉汤中的任意一种，所述非特异性培养基的组成优选为：蛋白胨、牛肉浸粉 和氯化钠；其中所述蛋白胨浓度为5-20g/L，所述牛肉浸粉浓度为2-5g/L，所述氯化钠浓度 为5-20g/L ;所述目标致病菌为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌、 铜绿假单胞菌或粪便链球菌中的任意一种或至少两种的组合。
[0044] 与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
[0045] (1)本发明通过精确选取2个实时定量取样时刻并与特异性实时定量PCR结合，通 过所得Ct值可以测定出致病菌初始浓度及增长过程，并提供活性致病菌与死亡致病菌在 初始样品中的比例，因此能够精确高效的在短时间内判断出食品污染程度、活菌比例、污染 微生物的活性状况及污染历史，其准确度和特异性都在99%以上，为进一步的毒素测定提 供指导作用；
[0046] (2)本发明是以实际的待测食品为样本，有效针对致病菌为下列但不限定为下列 致病菌，包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌或粪 便链球菌等，实现了对其中一种甚至一种以上的致病菌的同时检测，实现了高通量化，准确 度由目前的生理生化标准提高至分子水平；灵敏度可以达到单个菌；
[0047] (3)本发明的检测方法可由目前的7天的细菌培养方法缩短至24小时，该检测方 法简单、快速，成本低，可以用于工业化生产。
【附图说明】
[0048] 图1为实施例1中的沙门氏菌培养时间和PCR的Ct值的相关曲线。
[0049] 图2为实施例1中根据致病菌培养到达特定Ct值的时间和食品中含有的致病菌 的初始浓度所制定的食品中致病菌最初浓度的标准曲线。
【具体实施方式】
[0050] 下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明 了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0051] 本发明所述食品中致病菌定量检测方法中，所述Ct值有两个，分别为培养阶段的 零时刻所对应的Ct 1值和培养阶段的第8-24h所对应的Ct 2值。
[0052] 当所述以2值>35时为阴性，表示未检出所述致病菌；当所述Ct 2值〈32时为阳性， 表示检出所述致病菌。
[0053] 当所述(^2值〈32并且所述Ct 2值和Ct i值之差Λ Ct大于4个Ct值时，表示检出 所述致病菌为活性菌。
[0054] 当所述Ct2值在32-35之间，或所述Ct 2值和Ct i值之差Λ Ct大于1并且小于3个 Ct值时，则需要重复所述步骤（1)的扩增。
[0055] 对于(^2值〈32的阳性样品，还需进行以下检测：（1)测定其零时刻的Ct i值；如果 零时刻的(^值>35,则说明该致病菌为活菌；（2)如果其零时刻的Ct i值也〈35,说明该致 病菌中有死菌污染；（3)对于含有死菌污染样品的以2值，如果Ct 2值和零时刻的Ct i值之差 Λ Ct大于4时，说明同时也有活菌污染；(4)对于含有死菌污染样品的以2值，如果Ct 2值 和零时刻的Ct1值之差Λ Ct不大于4时，要做2次增菌比较；如果2次增菌样品8-24h时 刻的Ct2值比2次增菌前Ct i值降低4个Ct值，表明有活菌污染。
[0056] 实施例1
[0057] 通过非特异性扩增培养、多点实时定量采样及特异性实时定量PCR鉴定技术测定 沙门氏菌的生长情况及其初始浓度下活菌和死菌的比例，其具体步骤如下所示：
[0058] 分别取25mL含沙门氏菌3cfu、33cuf和333cfu/25mL的样品放入分别盛有225mL 的非特异培养基中，每升非特异培养基的组成为：5g蛋白胨，5g牛肉浸粉，5g氯化钠，进行 均质2min，用Imol/mL无菌NaOH溶液