一种库蚊沃尔巴克氏体的检测引物及其检测方法和检测试剂盒的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种库蚊沃尔巴克氏体的检测引物及其检 测方法和检测试剂盒。
【背景技术】：
[0002] 沃尔巴克氏体（Wolbachia)是广泛分布于节肢动物体内的共生微生物，它可能是 昆虫共生微生物中最为丰富的类群。它分布于鞘翅目、双翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鳞 翅目等昆虫种类中。它以垂直传播作为其在宿主世代间传递的基本模式。它稳定地存在于 宿主的生殖细胞内，通过卵细胞传递给宿主子代，并可通过多种方式如细胞质不亲和、雌性 化和杀雄性等调控宿主的生殖活动。通过这些调控作用促进其在宿主种群内广泛传播。
[0003] 在沃尔巴克氏体（Wolbachia)引起的宿主生殖行为改变中，细胞质不亲和 (Cytoplasmic Incompatibility，Cl)是最常见的一种类型。它表现为当被沃尔巴克氏 体（Wolbachia)感染的雄蚊与未感染雌蚊或感染不同种类Wolbachia的雌雄蚊交配时，精 子和卵子结合后胚胎无法发育。沃尔巴克氏体（Wolbachia)的胞质不亲和的特性可导致 Wolbachia感染的蚊能侵入未感染或感染不同种Wolbachia的蚊群进行种群压制和种群替 代。它的应用对蚊媒病防治具有巨大的价值。近期研宄发现，沃尔巴克氏体（Wolbachia) 不仅具有上述的特性外，同时它还能在蚊子体内与蚊子携带的一些重要的病原生物（如 登革病毒，疟原虫等）相互作用，抑制它们在蚊子体内的增值和扩散从而在阻断这些病原 生物传播于人类。沃尔巴克氏体（Wolbachia)的这种抑制作用与它在蚊子体内组织的分 布相关，所以，了解沃尔巴克氏体（Wolbachia)在蚊子体内组织分布有助于快速筛选出传 播阻断效果最好的沃尔巴克氏体（Wolbachia)感染的蚊子，也有助于监测沃尔巴克氏体 (Wolbachia)在蚊群中的垂直传播，同时也有利于高效率地监测大规模大地域范围的沃尔 巴克氏体（Wolbachia)在蚊子组织中的感染情况。
[0004] 在自然界中，蚊子的种类有很多，常见的有伊蚊和库蚊两种。伊蚊分为白纹伊蚊和 埃及伊蚊，其中埃及伊蚊不携带沃尔巴克氏体。由于沃尔巴克氏菌只能存活于宿主体内，不 能在体外自由生活，因而如何有效特异地检测沃尔巴克氏菌是对该细菌研宄的必备工具。 比较常用的检测手段有聚合酶链反应法（PCR法）和免疫染色法。免疫染色法耗时耗力，而 且特异性不好。随着PCR方法的普及，针对沃尔巴克氏体的检测有了很大的进步。不同蚊 种携带不同的沃尔巴克氏体，通过PCR结果能够直观的看出蚊子携带的不同沃尔巴克氏体 类型，这样为我们的日常检测提供了很大的便利。目前针对不同沃尔巴克氏体PCR检测的 方法还不完善。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的是提供一种专一性强、特异性高和灵敏度高的库蚊沃尔巴克氏体的 检测引物。
[0006] 本发明的库蚊沃尔巴克氏体的检测引物，其特征在于，包括：
[0007] WPipF :5' -GTGCAGCTAATAGCAAGGAACA-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示）；
[0008] wPipR :5' -CCTATCTTTTCTGGCATCTTCG-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示）。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的库蚊沃尔巴克氏体 的检测方法，其特征在于，提取样品DNA，以该样品DNA为模板，以上述库蚊沃尔巴克氏体的 检测引物wPipF和wPipR作为PCR引物，进行PCR扩增，扩增反应完成后，判断是否扩增到 扩增产物来判断样品中是否含有库蚊沃尔巴克氏体。
[0010] 所述的进行PCR扩增，其反应条件优选为：94°C预变性5分钟；95°C变性5秒、60°C 退火30秒、72 °C延伸30秒，30个循环；72 °C最后延伸5分钟。
[0011] 本发明的第三个目的是提供一种库蚊沃尔巴克氏体的检测试剂盒，包括检测引物 和PCR试剂，其特征在于，所述的检测引物为：
[0012] wPipF :5' -GTGCAGCTAATAGCAAGGAACA-3' ；
[0013] wPipR :5' -CCTATCTTTTCTGGCATCTTCG-3'。
[0014] 利用本发明的检测引物按照本发明的检测方法能够快速高效专一的检测出库蚊 沃尔巴克氏体，具有专一性强，特异性高（只检测出库蚊沃尔巴克氏体，而伊蚊沃尔巴克氏 体不发生扩增），灵敏度高，其最低检测限为855 X l(T5ng/ μ 1。
[0015] 因此，本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便等优点。
【附图说明】：
[0016] 图1是特异性实验结果，其中M为Marker，1-3为广州致倦库蚊的沃尔巴克氏体， 4-6为广州白纹伊蚊的沃尔巴克氏体。
[0017] 图2是灵敏度实验结果，其中M为Marker，1为原始浓度的DNA样品，2、3、4、5、6分 别是 10、100、1000、10000、100000 倍稀释的 DNA 样品。
【具体实施方式】：
[0018] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0019] 实施例1 :特异性
[0020] 1、取6个分别装有20 μ I DNA提取液（DNA提取液的配方为：30mM Na0H、0. 25mM EDTA、15mMTris-HCl，溶剂为水，下同）的 0· 2ml EP 管；
[0021] 2、三只广州致倦库蚊（含有库蚊沃尔巴克氏体）和三只白纹伊蚊（含有伊蚊沃尔 巴克氏体）经二氧化碳熏晕后，解剖腹部，分别放入上述6个EP管中；
[0022] 3、瞬时离心后，95°C温浴10分钟；
[0023] 4、瞬时离心后，得到DNA抽提液，_20°C保存，即分别获得六只蚊子的沃尔巴克氏 体的基因组DNA(具体为：三份库蚊沃尔巴克氏体的基因组DNA，三份伊蚊沃尔巴克氏体的 基因组DNA)，分别以六只蚊子的沃尔巴克氏体的基因组DNA为模板进行PCR反应。
[0024] 5、PCR扩增体系：
[0025]
【主权项】
1. 一种库蚊沃尔巴克氏体的检测引物，其特征在于，包括： wPipF :5' -GTGCAGCTAATAGCAAGGAACA-3'； wPipR :5' -CCTATCTTTTCTGGCATCTTCG-3'。
2. -种非疾病的诊断和治疗目的的库蚊沃尔巴克氏体的检测方法，其特征在于，提取 样品DNA，以该样品DNA为模板，以权利要求1所述的库蚊沃尔巴克氏体的检测引物wPipF 和wPipR作为PCR引物，进行PCR扩增，扩增反应完成后，判断是否扩增到扩增产物来判断 样品中是否含有库蚊沃尔巴克氏体。
3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的进行PCR扩增，其反应条件为： 94°C预变性5分钟；95°C变性5秒、60°C退火30秒、72°C延伸30秒，30个循环。
4. 一种库蚊沃尔巴克氏体的检测试剂盒，包括检测引物和PCR试剂，其特征在于，所述 的检测引物为： wPipF :5' -GTGCAGCTAATAGCAAGGAACA-3'；wPipR :5' -CCTATCTTTTCTGGCATCTTCG-3'。
【专利摘要】本发明公开了一种库蚊沃尔巴克氏体的检测引物及其检测方法和检测试剂盒。库蚊沃尔巴克氏体的检测引物，wPipF：5’-GTGCAGCTAATAGCAAGGAACA-3’；wPipR：5’-CCTATCTTTTCTGGCATCTTCG-3’。利用本发明的检测引物按照本发明的检测方法能够快速高效专一的检测出库蚊沃尔巴克氏体，具有专一性强，特异性高(只检测出库蚊沃尔巴克氏体，而伊蚊沃尔巴克氏体不发生扩增)，灵敏度高，其最低检测限为855×10-5ng/μl。因此，本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便等优点。
【IPC分类】C12Q1-04, C12N15-11, C12Q1-68, C12R1-01
【公开号】CN104878109
【申请号】CN201510318826
【发明人】杨翠, 奚志勇, 朱俭, 罗永平
【申请人】奚志勇
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年6月11日