专利名称：运用复合荧光pcr技术检测食源性病原微生物的方法
技术领域：
本发明涉及细菌检验技术，具体地说是运用荧光PCR反应来检测致病细菌，特别是食源 性病原微生物的技术.
背景技术：
食品中常见的致病菌是引起食物中毒的主要原因之一，可导致多种疾病发生，严重威胁 着人们的健康。快速、准确的检测食品中的致病菌是有效预防和控制病原菌感染的前提条件。 随着分子生物学的发展，食品检验检疫工作中的细菌鉴定方法已经从传统的简单生化实验水 平上向分子生物学的方法如PCR、探针杂交等技术发展，但是分子生物学的检測方法在短期 内仍然难以代替传统的生化鉴定，目前分子生物学方法主要用于大量样品的初筛。需要检测 的食源性病原微生物主要包括以下几种金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、副溶血弧 菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、志贺氏菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、出血性大肠杆菌 和大肠杆菌0157: H7等。
发明内容
针对上述目标菌，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种运用复合荧光PCR技术快 速低成本的检测金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、肠杆菌科细菌和弧菌属细菌的方法。
该方法包括应用该方法检测食源性病原微生物的所使用的引物组和与之配套的PCR反 应条件，其中引物、探针的全部序列如下
引物
弓I物序列一5 'TTTCTGACATAAGAAATACAAATAATCATA 引物序列二 5'GTTTTGAATGTTTGTTCATTCAAATTAAT 弓l物序列三5TGGTGGAGCCTAGCGGGATC 弓I物序列四5' CCGTGTACGCTTAGTCGCTTAACCTC 引物序列五5'GCTCTTTAACAATTTGGAAAGCTGA 引物序列六5'TTCCCAAGAACACTTGAATGTGTT
本发明提供了更加快速和低成本通过荧光PCR方法检测食源性病原微生物的方法。 本发明是通过以下技术方案实现的
(1) 设计特异性寡核苷酸引物用于荧光染料嵌合荧光PCR技术检测；
(2) 整合各引物使之不相互干扰.
(3) 以引物序列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增
(4) 扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度測量并在PCR反应结束后进行所
合成DNA片段的熔解曲线的測定，并将数据传输至电脑通过配套软件进行分析可以观察到 各种病原微生物的特异性熔解曲线的峰值.
本发明用特异性的引物组扩增金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、15种肠杆菌和5 种弧菌的基因组均产生荧光信号，并生成相应的熔解曲线峰值，均未发现假阳性和假阴性的 结果，
本发明中荧光PCR反应体系中各组分构成比例如下:
成分浓度加样量
PCR体系预混合物2倍12.5fiL
荧光嵌合法所用引物序列一:10,oI/L0.3pL
荧光嵌合法所用引物序列二:0舉
荧光嵌合法所用引物序列三:10拜I/L0.6^L
荧光嵌合法所用引物序列四:10^mol/L0.34
荧光嵌合法所用引物序列五:10拜ol/L0.3nL
荧光嵌合法所用引物序列六:10拜ol/L0单
DNA样品
双蒸水9.1nL
总体积25jiL
荧光PCR扩增程序及测定扩增片段的熔解温度程序为
(1) 95*C IO分钟
(2) 95*C15秒；
(3) 30秒
(4) 回到第(2)步，重复40次
(5) 95"C 2分
(6) 梯度升温60"C至95*0每秒上升0.2"。
荧光PCR结果在扩增过程中使用荧光PCR仪进行实时荧光光强度测量，并在PCR扩增 程序结束后进行梯度升温测定扩增片段的熔解温度。将数据传输至电脑通过配套软件进行分 析可以观察到进行特异性扩增产生的荧光，并得到对金黄色葡萄球菌的特异性片段所特有的 熔解曲线(761C士0.3iC):单核增生李斯特氏菌的特异性片段所特有的熔解曲线(79"C士0.3t:); 弧菌属细菌的特异性片段所特有的熔解曲线(74X:i03"C):肠杆菌科细菌的特异片段所特 有的溶解曲线(85TC=t0.3TC),
如果得到对金黄色葡萄球菌的特异性片段所特有的熔解曲线(76TC±0.3"C)则证明待测
样品中存在金黄色葡萄球菌；如果得到对单核增生李斯特氏菌的特异性片段所特有的熔解曲 线(791C±0.31C)则证明待测样品中存在单核增生李斯特氏菌如果得到对弧菌属的特异性 片段所特有的熔解曲线(741C±0.31C)则证明待测样品中存在弧菌如果得到对肠杆菌科的 特异性片段所特有的熔解曲线(85"C±0.3r)则证明待测样品中存在肠杆菌如出现其他结 果则表明此次检验失败不能确定是否存在金黄色葡萄球菌，单核增生李斯特氏菌，弧菌和肠 杆菌，霜重新检验.
与现有技术相比，本发明的有益效果是基于荧光PCR的鉴定方法适用于直接从患者 含菌体液、食品和体液培养物等临床样品中扩增靶基因，从而细菌，而且使用本方法只需要 一次一管荧光PCR反应就能够检測出金黄色葡萄球菌，单核增生李斯特氏菌，弧菌和肠杆 菌是否存在，能够节约检溯成本和时间.荧光PCR方法具有检測准确、特异性强、灵敏度 高的特点，可以快速、准确地鉴定特异的目标细菌.它用PCR的方法扩增细菌耙基因，避 免了反复培养，节约时间；PCR鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化 鉴定方法更为准确。
图1某待测鲜牛肉样品中复合荧光PCR技术检测待测样品DNA， SYBRGreen荧光信号 强度。
图2某待测鲜牛肉样品中复合荧光PCR技术检测待测样品DNA,扩增产物熔解温度峰值。
图3某待渊鲜猪肉样品中复合荧光PCR技术检测待测样品DNA, SYBR Green荧光信号 强度.
图4某待测鲜猪肉样品中复合荧光PCR技术检测待测样品DNA,扩增产物熔解温度峰值.
图5某待测饼干样品中复合荧光PCR技术检测待测样品DNA, SYBR Green荧光信号强度。
图6某待测饼干样品中复合荧光PCR技术检测待测样品DNA,扩增产物熔解温度峰值。 图7某待测带鱼样品中复合荧光PCR技术检测待测样品DNA, SYBR Green荧光信号强
度，
图8某待测带鱼肉样品中复合荧光PCR技术检测待測样品DNA,扩增产物熔解温度峰值。
图9某待測萝卜样品中复合荧光PCR技术检测待测样品DNA, SYBR Green荧光信号强度。
图IO某待測萝卜样品中复合荧光PCR技术检測待測样品DNA,扩增产物熔解温度峰值。 图11某待測嬰儿米粉样品中复合荧光PCR技术检拥待測样品DNA, SYBR Green荧光
信号强度.
图12某待测嬰儿米粉样品中复合荧光PCR技术检測待測样品DNA,扩增产物熔解温度 峰值。
具体实施例方式
下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细描述， 实施例1
样本某处出口鲜牛肉。
用常规生理、生化方法检測出金黄色葡萄球菌疑似菌落，然后进行如下复合荧光PCR技 术检测食源性致病菌的检测
1. 样品处理
(1) 取100克待检样品，粉碎。
(2) 溶解于1升营养肉汤中37"C培养8小时，
2. DNA抽提
取营养肉汤lmL在冰浴中静置5分钟，然后在室温下12000转/分钟，离心5分钟，弃 上清液，加入100nL溶菌酶溶液，37"C保温10分钟，补加TE缓冲液500nL，振荡混匀。加 同体积Tris饱和酚(pH8.0),强烈振荡，12000转/分钟离心3分钟，取上清液，重复酚抽提。 取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(2mol/L),混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静 置30分钟，12000转/分钟，离心5分钟，弃上清，加70%冷乙醇洗涤一次，室温下12000转 /分钟，离心5分钟，弃上清,加入50nLTE溶液，置-20r保存，
3. PCR扩增
PCR反应体系中各组分构成比例如下
成分浓度加样量
PCR体系预混合物2倍12.5jiL
荧光嵌合法所用引物序列一0舉
荧光嵌合法所用引物序列二1O拜ol/L0.3hL
荧光嵌合法所用引物序列三0.6|iL
荧光嵌合法所用引物序列四0.3}iL
荧光嵌合法所用引物序列五10阿ol/L0.3jiL
荧光嵌合法所用引物序列六10萍ol/L0.6(iL
DNA样品
双蒸水 9.1jiL 总体积 25 jiL
荧光PCR扩增程序及测定扩增片段的熔解温度程序为
(1) 951C IO分钟；
(2) 95^015秒；
(3) 65"C30秒
(4) 回到第(2)步，重复40次
(5) 951C 2分
(6) 梯度升温601C至95TC每秒上升0.210,
PCR共进行2管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为本待測样品DNA:无样 品的阴性对照，
4.被检測样品荧光PCR图谱观察
荧光PCR过程中可以观察到本待测样品产生了明显的SYBR Green荧光，结果如图1。 阴性对照在PCR过程中没有产生SYBR Green荧光结果，在通过观测扩增产物熔解温度的荧 光曲线，可以发现金黄色葡萄球菌的特征峰值76.210如图2*
图1中的曲线所代表的SYBR Green荧光强度信号是样品中DNA扩增结果，
图2中的曲线所代表的熔解温度峰值是样品中金黄色葡萄球菌的特征峰值76.21C*
实验表明样品中含有金黄色葡萄球菌，
3天后，通过常规微生物培养和生化检测证明，所检验的目的菌落为金黄色葡萄球菌， 将其中一个菌株命名为CIQ061011*荧光PCR检验结果与生化检测结果一致。 实施例2
样本某处出口鲜猪肉。
用常规生理、生化方法检测出金黄色葡萄球菌疑似菌落，然后进行如下复合荧光PCR技 术检測食源性致病菌的检测
1. 样品处理
(1) 取100克待检样品，粉碎，
(2) 溶解于1升营养肉汤中37"C培养8小时，
2. DNA抽提
取营养肉汤lmL在冰浴中静置5分钟，然后在室温下12000转/分钟，离心5分钟，弃 上清液，加入100^L溶菌酶溶液，37"C保温10分钟，补加TE缓冲液500^L,振荡混匀*加
同体积Tris饱和酚(pH8.0),强烈振荡，12000转/分钟离心3分钟，取上清液，重复酚抽提。 取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(2mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静 置30分钟，12000转/分钟，离心5分钟,弃上清，加70%冷乙醉洗涤一次，室温下12000转 /分钟，离心5分钟，弃上清,加入5(HiLTE溶液，置-20lC保存， 3. PCR扩增
PCR反应体系中各组分构成比例如下
成分浓度加样量
PCR体系预混合物2倍12早
荧光嵌合法所用引物序列一10拜1/L0.3nL
荧光嵌合法所用引物序列二1O萍ol/L0早
荧光嵌合法所用引物序列三1O拜ol/L0.6fiL
荧光嵌合法所用引物序列四(UjiL
荧光嵌合法所用引物序列五10阿ol/L0早
荧光嵌合法所用引物序列六-0单
DNA样品l^iL
双蒸水
总体积25 nL
荧光PCR扩增程序及测定扩增片段的熔解温度程序为
(1) 951C IO分钟；
(2) 95"C15秒；
(3) 30秒；
(4) 回到第(2)步，重复40次 (5〉 951C 2分
(6〉梯度升温60*0至95"每秒上升0.2*0* PCR共进行2管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为本待溯样品DNA:无样 品的阴性对照，
4.被检測样品荧光PCR图谱观察
荧光PCR过程中可以观察到本待测样品产生了明显的SYBR Green荧光，结果如图3。 阴性对照在PCR过程中没有产生SYBRGreen荧光结果，在通过观測扩增产物熔解温度的荧 光曲线，可以发现金黄色葡萄球菌的特征峰值76.210如图4.
图3中的曲线所代表的SYBR Green荧光强度信号是样品中DNA扩增结果，
图4中的曲线所代表的熔解温度峰值是样品中金黄色葡萄球菌的特征峰值76.2*0。 实验表明样品中含有金黄色葡萄球菌，
3天后，通过常规微生物培养和生化检测证明，所检验的目的菌落为金黄色葡萄球菌， 将其中一个菌株命名为CIQ061018。荧光PCR检验结果与生化检测结果一致. 实施例3
样本某处进口饼干.
用常规生理、生化方法检测出单核增生李斯特氏菌疑似菌落，然后进行如下复合荧光PCR 技术检測食源性致病菌的检测
1. 样品处理
(1) 取100克待检样品，粉碎，
(2) 溶解于1升营养肉汤中37'C培养8小时.
2. DNA抽提
取营养肉汤lmL在冰浴中静置5分钟，然后在室温下12000转/分钟，离心5分钟，弃 上清液，加入100jiL溶菌酶溶液，37"保温10分钟，补加TE缓冲液500jiL，振荡混匀。加 同体积Tris饱和酚(pH8.0),强烈振荡，12000转/分钟离心3分钟，取上清液，重复酚抽提。 取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(2mol/L),混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静 置30分钟，12000转/分钟，离心5分钟,弃上清，加70%冷乙醇洗涤一次，室温下12000转 /分钟，离心5分钟，弃上清,加入50jiLTE溶液，置-2(TC保存，
3. PCR扩增
PCR反应体系中各组分构成比例如下
成分浓度加样量
PCR体系预混合物2倍12.5^
荧光嵌合法所用引物序列一10拜ol/L
荧光嵌合法所用引物序列二0.3 iL
荧光嵌合法所用引物序列三10拜I/L0单
荧光嵌合法所用引物序列四1Opmol/L0.3jiL
荧光嵌合法所用引物序列五10[unol/L0.3nL
荧光嵌合法所用引物序列六10pmol/L0单
DNA样品l^L
双蒸水9.1^L
总体积25 nL
荧光PCR扩增程序及测定扩增片段的熔解温度程序为
(1) 95*C IO分钟
(2) 15秒；
(3) 65"30秒；
(4) 回到第(2)步，重复40次；
(5) 951C 2分
(6) 梯度升温601C至95"每秒上升0.2*0.
PCR共进行2管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为本待测样品DNA;无样 品的阴性对照，
4.被检測样品荧光PCR图谱观察
荧光PCR过程中可以观察到本待测样品产生了明显的SYBR Green荧光，结果如图5, 阴性对照在PCR过程中没有产生SYBRGreen荧光结果，在通过观测扩增产物熔解温度的荧 光曲线，可以发现单核增生李斯特氏菌的特征峰值78.9"C如图6,
图5中的曲线所代表的SYBR Green荧光强度信号是样品中DNA扩增结果.
图6中的曲线所代表的熔解温度峰值是样品中单核增生李斯特氏菌的特征峰值76.2*C,
实验表明样品中含有单核增生李斯特氏菌，
5天后，通过常规微生物培养和生化检測证明，所检验的目的菌落为单核增生李斯特氏 菌，将其中一个菌株命名为CIQ061007,荧光PCR检验结果与生化检測结果一致， 实施例4
样本某处出口带鱼。
用常规生理、生化方法检测出副溶血弧菌疑似菌落，然后进行如下复合荧光PCR技术检 测食源性致病菌的检测
1. 样品处理
(1) 取100克待检样品，粉碎。
(2) 溶解于1升营养肉汤中37"C培养8小时。
2. DNA抽提
取营养肉汤lmL在冰浴中静置5分钟，然后在室温下12000转/分钟，离心5分钟，弃 上清液，加入100nL溶菌酶溶液，37^C保温10分钟，补加TE缓冲液500jiL,振荡混匀.加 同体积Tris饱和酚(pH8.0),强烈振荡，12000转/分钟离心3分钟，取上清液，重复酚抽提。 取上清液，加入O.l倍体积的乙酸钠(2mol/L),混匀，再加等体积的冰乙醇，泡匀后低温静 置30分钟，12000转/分钟，离心5分钟,弃上清，加70%冷乙醇洗涤一次，室温下12000转
/分钟，离心5分钟，弃上清,加入50nLTE溶液，置-201C保存。 3.PCR扩增
PCR反应体系中各组分构成比例如下
成分浓度加样量
PCR体系预混合物2倍12单
荧光嵌合法所用引物序列一0.3jiL
荧光嵌合法所用引物序列二t10拜ol/L0.3jiL
荧光嵌合法所用引物序列三10pmol/L0早
荧光嵌合法所用引物序列四10拜ol/L0.3^L
荧光嵌合法所用引物序列五10拜1/L0舉
荧光嵌合法所用引物序列六0単
DNA样品 ljtL 双蒸水 9.1jiL 总体积 25 jiL
荧光PCR扩增程序及测定扩增片段的熔解温度程序为
(1) 951C IO分钟；
(2) 15秒
(3) 30秒；
(4) 回到第(2)步，重复40次；
(5) 951C 2分,
(6) 梯度升温6(TC至95*0每秒上升0.2卩。
PCR共进行2管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为本待测样品DNA:无样 品的阴性对照.
4.被检測样品荧光PCR图谱观察
荧光PCR过程中可以观察到本待測样品产生了明显的SYBR Green荧光，结果如图7. 阴性对照在PCR过程中没有产生SYBR Green荧光结果，在通过观测扩增产物熔解温度的荧 光曲线，可以发现弧菌的特征峰值73.810如图8。
图7中的曲线所代表的SYBR Green荧光强度信号是样品中DNA扩增结果*
图8中的曲线所代表的熔解温度峰值是样品中弧菌的特征峰值73.81C.
实验表明样品中含有弧菌，
3天后，通过常规微生物培养和生化检測证明，所检验的目的菌落为副溶血弧菌，将其
中一个菌株命名为CIQ060卯3.荧光PCR检验结果与生化检測结果一致. 实施例5
样本某处出口萝卜.
用常规生理、生化方法检测出大肠杆菌疑似菌落，然后进行如下复合荧光PCR技术检测 食源性致病菌的检測
1. 样品处理
(1) 取100克待检样品，粉碎.
(2) 溶解于1升营养肉汤中371C培养8小时.
2. DNA抽提
取营养肉汤lmL在冰浴中静置5分钟，然后在室温下12000转/分钟，离心5分钟，弃 上清液，加入10(HiL溶菌酶溶液，37C保温10分钟，补加TE缓冲液500jiL,振荡混匀。加 同体积Tris饱和酚(pH8.0),强烈振荡，12000转/分钟离心3分钟，取上清液，重复酚抽提* 取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(2mol/L),混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静 置30分钟，12000转/分钟，离心5分钟，弃上清，加70%冷乙醇洗涤一次，室温下12000转 /分钟，离心5分钟，弃上清,加入50nLTE溶液，置-20"C保存，
3. PCR扩增
PCR反应体系中各组分构成比例如下
成分浓度加样量
PCR体系预混合物2倍12.5jiL
荧光嵌合法所用引物序列一10拜ol/L
荧光嵌合法所用引物序列二10pmol/L0.3jiL
荧光嵌合法所用引物序列三10拜1/L0.6pL
荧光嵌合法所用引物序列四0.3^L
荧光嵌合法所用引物序列五0.3jiL
荧光嵌合法所用引物序列六
DNA样品14
双蒸水9.1jiL
总体积25 nL
荧光PCR扩增程序及测定扩增片段的熔解温度程序为:
(1) 95*C IO分钟；
(2) 95"C15秒(3) 65XJ30秒
(4) 回到第(2)步，重复40次
(5) 2分
(6) 梯度升温至每秒上升0.210,
PCR共进行2管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为本待測样品DNA;无样 品的阴性对照。
4.被检測样品荧光PCR图谱观察
荧光PCR过程中可以观察到本待测样品产生了明显的SYBR Green荧光，结果如图9。 阴性对照在PCR过程中没有产生SYBR Green荧光结果，在通过观測扩增产物熔解温度的荧 光曲线，可以发现肠杆菌的特征峰值85"C如图10。
图9中的曲线所代表的SYBR Green荧光强度信号是样品中DNA扩增结果.
图10中的曲线所代表的熔解温度峰值是样品中肠杆菌的特征峰值851C.
实验表明样品中含有肠杆菌.
2天后，通过常规微生物培养和生化检測证明，所检验的目的菌落为大肠杆菌，将其中 一个菌株命名为CIQ061101.荧光PCR检验结果与生化检测结果一致， 实施例6
样本某处进口嬰儿米粉，
用常规生理、生化方法发现变形杆菌疑似菌落，然后进行如下复合荧光PCR技术检测食 源性致病菌的检测
1. 样品处理
(1) 取100克待检样品，
(2) 溶解于1升营养肉汤中371C培养8小时.
2. DNA抽提
取营养肉汤lmL在冰浴中静置5分钟，然后在室温下12000转/分钟，离心5分钟，弃 上清液，加入100jiL溶菌酵溶液，37X:保温10分钟，补加TE缓冲液5(KHiL，振荡混匀，加 同体积Tris饱和酚(pH8.0),强烈振荡，12000转/分钟离心3分钟，取上清液，重复酚抽提. 取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(2mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醉，混匀后低温静 置30分钟，12000转/分钟，离心5分钟,弃上清，加70%冷乙醇洗涤一次，室温下12000转 /分钟，离心5分钟，弃上清，加入5(HiLTE溶液，置-2(TC保存.
3. PCR扩增
PCR反应体系中各组分构成比例如下
成分浓度加样量
PCR体系预混合物2倍12单
荧光嵌合法所用引物序列一10pmol/L0.3^L
荧光嵌合法所用引物序列二10pmol/L0.3tiL
荧光嵌合法所用引物序列三10拜ol/L0単
荧光嵌合法所用引物序列四10拜ol/L0.3jiL
荧光嵌合法所用引物序列五10拜ol/L0.3jiL
荧光嵌合法所用引物序列六lOpmol/L0单
DNA样品叫
双蒸水9.14
总体积25
荧光PCR扩增程序及測定扩增片段的熔解温度程序为
(1) 95" IO分钟
(2) 951C15秒
(3) 65*C30秒
(4) 回到第(2)步，重复40次
(5) 95"C 2分；
(6) 梯度升温60"C至每秒上升0.2*€。
PCR共进行2管PCR实验，其中DNA样品所加入的分别为本待测样品DNA:无样 品的阴性对照.
4.被检測样品荧光PCR图谱观察
荧光PCR过程中观察到本待测样品产生了明显的SYBRGreen荧光，结果如图11.阴性 对照在PCR过程中没有产生SYBR Green荧光结果，在通过观测扩增产物熔解温度的荧光曲 线，发现肠杆菌特征峰值各种细菌的特征峰值85.1如图12,
图11中的曲线所代表的SYBR Green荧光强度信号是样品中DNA扩增结果。
图12中的曲线所代表的熔解温度曲线是样品DNA扩增的结果，
实验表明样品中不含有肠杆菌.
3天后，通过常规微生物培养和生化检测证明，所检验的目的菌落为普通变形杆菌，将 其中一个菌株命名为CIQ060810.荧光PCR检验结果与生化检测结果一致， 序列列表
SEQUENCE LISTING
<110>中华人民共和国天津出入境检验检疫局 <120>运用复合荧光PCR技术检測食源性病原微生物的方法
<130> 2007112
<160> 6
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213>人工合成
<220>
， ifco* ix>a一、tM J
a ^ P泰uiivi 口inu
<222> (1)..(30)
<400> 1
tttotgacat aagaaataca祖taatcata 30
<210> 2
<211> 29
<212> DNA <213>人工合成 <220>
<221> primer一bind
<222> (1)..(29)
<400> 2
gttttgaatg tttgttcatt caaattaat 29
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213>人工合成
<220>
<221> primet一bind
<222> (1)..(20)
<400> 3
tggtggagcc tagc鹏atc<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>primer—bind
<222>(1)..(20)
<220>
<221>primer_bind
<222>(""(26)
<400>4
ccgtgtacgc ttagtogctt aacctc<210>
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>primer一bind
<222>(1).(25)
<400>
gctctttaac aatttggaaa gctga<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>protein—bind
<222>(""(24)
<400>6
ttcccaagaa cacttgaatg tgtt
权利要求
1.一种运用复合荧光PCR技术检测食源性病原微生物的方法，其特征在于，所使用的引物组序列如下引物引物序列一5’TTTCTGACATAAGAAATACAAATAATCATA引物序列二5’GTTTTGAATGTTTGTTCATTCAAATTAAT引物序列三5’TGGTGGAGCCTAGCGGGATC引物序列四5’CCGTGTACGCTTAGTCGCTTAACCTC引物序列五5’GCTCTTTAACAATTTGGAAAGCTGA引物序列六5’TTCCCAAGAACACTTGAATGTGTT。
2. 根据权利要求1所述的一种运用复合荧光PCR技术检测食源性病原微生物的方法,其 特征在于，PCR反应体系中各组分构成比例如下成分 浓度 加样量PCR体系预混合物2倍引物序列一10拜1/L0.3nL引物序列二1O拜ol/L引物序列三10,ol/L0単引物序列四10拜ol/L0.3^L引物序列五10junol/L0.3ftL引物序列六0.64DNA样品双蒸水9.1jiL总体积25fiL 。
3.根据权利要求1所述的一种运用复合荧光PCR技术检测食源性病原微生物的方法， 其特征在于，荧光PCR扩增程序及测定扩增片段的熔解温度程序为(1) 951C IO分钟(2) 95匸15秒；(3) 65*030秒；(4) 回到第(2)步，重复40次；(5) 95"C 2分(6) 梯度升温60"至95*C每秒上升0,2"C,
4.权利要求1所述的一种运用复合荧光PCR技术在检測食源性病原微生物方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种运用复合荧光PCR技术检测食源性病原微生物的方法，属于细菌检验技术领域，主要的技术方案是设计了引物组序列。食品中常见的致病菌严重威胁着人们的健康。快速、准确的检测食品中的致病菌是有效预防和控制病原菌感染的前提条件。需要检测的食源性病原微生物主要包括以下几种金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、以及弧菌包括和肠杆菌。针对上述目标菌，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种运用复合荧光PCR技术快速低成本的检测金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、肠杆菌科细菌和弧菌属细菌的方法。该方法可以使用一管PCR反应，能够初筛出上述几种病原微生物。
文档编号G01N33/52GK101113472SQ200710057579
公开日2008年1月30日 申请日期2007年6月7日 优先权日2007年6月7日
发明者佳 于, 寅 刘, 叶露萌, 唐丹舟, 张宏伟, 李永君, 郑文杰, 魏亚东, 黄熙泰 申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心;南开大学