专利名称：基于多重pcr的水中13种病原微生物同步快速检测方法
技术领域：
本发明属于环境科学与工程、环境保护技术领域。
背景技术：
现阶段国内外常用于检测和鉴定致病微生物的方法主要有传统生化鉴定法、免疫学检测技术、常规PCR等一些简单的分子生物学和免疫学方法。传统生化鉴定法(如分离培养、生化鉴定等)应用最广泛，是《食品卫生微生物学检验(GB/T 4789-2003 )等国标检测程序，该方法能够得到样品中细菌数量和特性等方面的定性及定量结果，由于操作简单、经济且准确性好而被广泛采用，但是大都需要经过前增菌、增菌、选择性平板分离、生物化学试验和血清学分型鉴定4个步骤，整个过程通常需要3^7天，检测周期长，并且要求所要检测的细菌增殖为可见菌落，另外，培养基制备、细菌培 养、菌落计数和生化指标的检测都增加了实验室的工作量，并且检测灵敏度低，不能实现有效的实时快速监测和防控。免疫学检测技术主要是采用酶联免疫分析(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay, ELISA), ELISA是把抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机地结合起来的一种检测技术，既可测抗原，也可测抗体，可进行定性和定量测定，基本原理是预先结合在固相载体上的抗体或抗原分子与样品中的抗原或抗体分子在一定条件下进行免疫学反应。该方法可检测沙门氏菌、军团菌、大肠杆菌0157等致病微生物。免疫学检测技术简单、方便，较传统检测技术迅速，但存在交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等不足之处。聚合酶链式反应(Ploymerase Chain Reaction, PCR)是一种体外核酸扩增技术，其基本原理是在体外适宜的条件(如镁离子浓度)和Taq DNA聚合酶的作用下，利用游离的脱氧核糖核苷酸(dNTP)，以目标基因组DNA上正、反相两引物间的特定的双链DNA片段(或称靶DNA)进行高效扩增，故又称基因体外扩增法。一般的PCR需要经过预变性，变性、退火、延伸的25 35次循环，可将靶DNA序列扩增近百万倍，经琼脂糖或聚丙烯酰氨凝胶电泳和染色剂如溴化乙锭(EB)染色后在紫外光下观测到相应的条带。常规PCR虽为一种特异灵敏、简便快速的检测技术，但该方法需要较长时间的样品纯化处理过程，且一旦有极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果；多对引物同时扩增，各种实验条件控制不当，很容易导致扩增失败或非特异性产物；引物的设计及靶序列的选择不当等都可能降低其灵敏度和特异性；同时，一次一般只能检测一种致病微生物。
发明内容
本发明的目的是针对现有检测和鉴定致病微生物方法存在的以上不足，提出一种基于多重PCR的水中13种病原微生物同步快速检测方法。本发明的技术方案如下
一种基于多重PCR的水中13种病原微生物同步快速检测方法，采用多重PCR —次性同时扩增13种致病微生物的特异性基因片段大肠埃希菌、肠出血性大肠杆菌0157:H7、嗜肺军团菌、肠炎沙门菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、幽门螺旋杆菌、结核分枝杆菌、肺炎克雷伯菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌和鼠疫耶尔森菌，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。所述方法具体包括以下步骤
(1)水样处理
采集水样，用无菌塑料瓶封装，室温静置，取上清液加入浓缩仪进行浓缩集菌(浓缩仪采用Milliflex Plus浓缩仪)，然后抽干滤膜，取出放入离心管内，剪成细末状；(2)DNA模板提取
采用E. Z. N. A. Bacterial DNA Kit (D3350-01)试剂盒或者与之有同等作用的其他商业化DNA提取试剂盒进行核酸提取，取IOuL样本DNA进行下一步程序；
(3)多重PCR扩增目的片段
采用15 ii L的PCR体系，包括10 X PCR Taq酶缓冲液I. 0 — 2. Oii L，浓度为2. 5 mmol/L dNTP 0. I - 0.3 UL,浓度为10 - 20 u mo I/L的各种(即13种病原微生物)引物混合液0. 4 - 0. 8 u L, 50 X T-Taq DNA 聚合酶 0. I — 0. 5 y L，DNA 模板 0. 5 — I. 5 y L，双蒸水补至15u L ；
PCR循环参数95°C预变性3 min，接着作30个循环，每个循环包括94°C变性30s，68°C退火并延伸30s ;循环结束后68°C延伸5 min ;4°C保存备用；
(4)电泳检测
对三组多重PCR反应产物进行电泳观察，第一组产物的电泳图中含有5个不同长度的产物片段，分别为志贺菌113bp ;金黄色葡萄球菌283bp ;肠出血性大肠杆菌0157:H7 366bp ;大肠埃希菌471bp ;肠炎沙门氏菌679bp ;第二组产物的电泳图中含有4个不同长度的产物片段，分别为单核细胞增生李斯特菌155bp ;嗜肺军团菌252bp，肺炎克雷伯菌319bp ;幽门螺旋杆菌364bp ;第三组产物的电泳图中含有5个不同长度的产物片段，分别为结合分枝杆菌135bp ;鼠疫耶尔森菌184bp ;炭疽芽孢杆菌275bp ;霍乱弧菌465bp ；16S:370bp。其中16S做为检测结果的阳性质控。发明的优点及积极效果
本检测方法采用的多重PCR技术，具有较强的特异性、灵敏度和实际检测的适用性，本方法多重基因组DNA检测灵敏度为2 X 10_2 ng/yL。用常规的方法检测上述13种致病菌，需要的时间至少为两天，而对于李斯特菌的常规检测方法全过程至少需要四至七天，本检测方法可将整个检测时间缩短至8小时以内，比现有的细菌学诊断更快速、简便、经济和实用，并且同时检测多种致病菌。通常水体中的致病微生物含量相对较少，尤其是水源水体，有时部分致病微生物处于亚致死状态，这就需要一个前增菌过程以达到系统的检测限。本检测方法采用Milliflex Plus微生物过滤系统对水样进彳丁如期浓缩集囷后，就可以快速地完成微量致病微生物的快速检测。通过对水样的浓缩集菌，多重PCR对致病菌的检出率达到103cfu/mL，较原来提高了 100倍。因此，本检测方法具备重复性好、稳定性强、灵敏度及特异性高、操作简单、高通量及快速检测等诸多优点，为水体致病菌检测技术的发展提供了良好的理论和实践基础。
图I同时进行13中病原微生物检测的电泳 图2肠炎沙门氏菌菌液梯度稀释提取DNA的多重PCR结果；
图3肠炎沙门氏菌菌液梯度稀释，浓缩富集后提取DNA的多重PCR结果。
具体实施例方式I、检测对象
本方法主要针对水中可能存在的和突发公共事件发生时可能进入水中的13种致病微生物，分别是大肠埃希菌、肠出血性大肠杆菌0157:H7、嗜肺军团菌、肠炎沙门菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、幽门螺旋杆菌、结核分枝杆菌、肺炎克雷伯菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌。2、检测过程
2.I水样处理
采集适量水样，用无菌塑料瓶封装，当日送往实验室。室温静置Ihlh后，取上清液加AMilliflex Plus微生物过滤系统滤清漏斗装置的漏斗内。开启浓缩仪进行浓缩集菌，时间3分钟。浓缩完成后，抽干滤膜，将整个漏斗开口放入4°C冰柜，30mirT60min后待滤膜表面完全干燥后取出，用镊子将含有细菌的滤膜从浓缩仪滤瓶内取下，放入1.5mL离心管内，用已经灭菌过的手术剪剪成细末状。采用E. Z. N. A. Bacterial DNA Kit (D3350-01)试剂盒进行核酸提取，按试剂盒说明书所述的试剂量的3倍进行加样和提取，DNA最后溶解于50uL ddH20中。取每份水样中提取的核酸IOyL分别进行1%琼脂糖电泳，观察核酸提取质量；取IOuL样本DNA进行下一步程序。2. 2多重PCR扩增目的片段
采用15 ii L的PCR体系，包括10XPCR Taq酶缓冲液I. 5 ii L，浓度为2. 5 mmol/L dNTP
0.L，浓度为20iimol/L的各种(13种致病微生物)引物混合液0. 6 y L (每对引物各加入
0.6u L),50 XT-Taq DNA 聚合酶 0. 2 y L，DNA 模板 I. 0 y L，ddH20 11. 5u L0 PCR 循环参数:95°C预变性3 min,接着作30个循环，每个循环包括94°C变性30s，68°C退火并延伸30s ;循环结束后68°C延伸5 min ;4°C保存备用。2.3样本检测
所有多重PCR反应产物都要经过3%琼脂糖凝胶电泳观察结果。从每个多重PCR样品中取出2iiL PCR扩增产物，加入5 ii L 2 X Loading Buffer上样缓冲液混合均匀，用I X TAE作为缓冲溶液，150 V电压下电泳20 min，通过紫外成像系统拍摄电泳图，参见图1，从左至右
1.金葡菌，2.0157菌,3.志贺菌,4.大肠杆菌,5.沙门菌,6.第I组多重,7. Marker, 8.军团菌，9.克雷伯菌，10.李斯特菌，11.幽门菌，12.第2组多重，13.结核，14.霍乱，15.炭疽，16.鼠疫，17. 16S，18.第3组多重，19. Marker。根据电泳图上产物条带大小，判断样本中所含有的微生物种类。3实施例
以肠炎沙门氏菌为例，标准菌株培养液经10倍梯度稀释后，提取DNA进行多重PCR，所 得结果如图2所示。电泳结果显示，在I泳道至5泳道均出现明显的条带，6泳道以后没有条带出现，说明该方法可检测细菌的量为IO5 cfu/mL。图中每个泳道的细菌量分别为A: IO9cfu/mL; B: IO8 cfu/mL; C: IO7 cfu/mL; D: IO6 cfu/mL; E: IO5 cfu/mL; F: IO4 cfu/mL; G: IO3 cfu/mL; H: IO2 cfu/mL; I: water; M: Marker。为提高检测水平，通过Milliflex Plus浓缩仪对稀释后的菌液进行浓缩富集后再提取DNA,试验结果见图3。由电泳图可以看出，使用Milliflex Plus浓缩仪浓缩集菌后，可以显著提高多重PCR的检测水平，可检测肠炎沙门氏菌的量达到IO3 cfu/mL。图中每个泳道的菌液浓度分别为M: Marker ;A: IO7 cfu/mL; B: IO6 cfu/mL; C: IO5 cfu/mL; D:IO4 cfu/mL; E: IO3 cfu/mL; F: IO2 cfu/mL。本发明中，13种细菌的引物和探针序列见《水体中致病菌快速检测的 基因芯片技术研究》(解放军医学杂志，2010年第9期，1117-1120)
用于检测13种细菌的引物和探针序列
权利要求
1.一种基于多重PCR的水中13种病原微生物同步快速检测方法，所述方法是采用多重PCR同时扩增13种病原微生物的特异性基因片段大肠埃希菌、肠出血性大肠杆菌0157:H7、嗜肺军团菌、肠炎沙门菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、幽门螺旋杆菌、结核分枝杆菌、肺炎克雷伯菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌和鼠疫耶尔森菌，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，实现对13种病原微生物同步快速检测。
2.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤 (1)水样处理 采集水样，用无菌塑料瓶封装，室温静置，取上清液加入浓缩仪进行浓缩集菌，然后抽干滤膜，取出放入离心管内，剪成细末状；(2)DNA模板提取 采用E. Z. N. A. Bacterial DNA Kit (D3350-01)试剂盒或者与之有同等作用的其他商业化DNA提取试剂盒进行核酸提取，取IOuL样本DNA进行下一步程序； (3)多重PCR扩增目的片段 采用15 ii L的PCR体系，包括10 X PCR Taq酶缓冲液I. 0 — 2. Oii L，浓度为2. 5 mmol/L 的 dNTP 0. I — 0. L，浓度为 10 — 20iimol/L 的引物各 0. 4 — 0. 8 u L, 50 X T-Taq DNA聚合酶0. I - 0. L，DNA模板0. 5 — I. 5 y L，双蒸水补至15 y L ;多重PCR循环参数95°C预变性3 min,接着作30个循环，每个循环包括94°C变性30s，68°C退火并延伸30s ;循环结束后68°C延伸5 min ;4°C保存备用；13种病原微生物的检测分为三组多重PCR进行；上述引物是指权利要求I的13种病原微生物的引物； (4)电泳检测 对三组多重PCR反应产物进行电泳观察，第一组产物的电泳图中含有5个不同长度的产物片段，分别为志贺菌113bp ;金黄色葡萄球菌283bp ;肠出血性大肠杆菌0157:H7 366bp ;大肠埃希菌471bp ;肠炎沙门氏菌679bp ;第二组产物的电泳图中含有4个不同长度的产物片段，分别为单核细胞增生李斯特菌155bp ;嗜肺军团菌252bp，肺炎克雷伯菌319bp ;幽门螺旋杆菌364bp ;第三组产物的电泳图中含有5个不同长度的产物片段，分别为结合分枝杆菌135bp ;鼠疫耶尔森菌184bp ;炭疽芽孢杆菌275bp ;霍乱弧菌465bp ；16S 370bp ;其中16S做为检测结果的阳性质控。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述步骤(4)中的电泳检测使用3%琼脂糖凝胶。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述步骤(I)的浓缩仪采用Milliflex Plus微生物过滤系统。
全文摘要
一种基于多重PCR的水中13种病原微生物同步快速检测方法，所述方法是采用多重PCR同时扩增13种病原微生物的特异性基因片段大肠埃希菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、嗜肺军团菌、肠炎沙门菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、幽门螺旋杆菌、结核分枝杆菌、肺炎克雷伯菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌和鼠疫耶尔森菌，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，实现对13种病原微生物同步快速检测。
文档编号C12Q1/68GK102703588SQ201210172849
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月30日 优先权日2011年8月9日
发明者张春秀, 敖漉, 方振东, 王大勇, 谢朝新, 陈金丝, 马颖 申请人:上海生物芯片有限公司, 中国人民解放军后勤工程学院