专利名称：免疫原性组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫原性组合物和疫苗，更具体而言，但不限于初免-加 强免疫策略中使用的免疫原性组合物、疫苗和试剂盒。本发明还涉及使 用所述免疫原性组合物、疫苗或试剂盒产生免疫应答的方法。
背景技术：
疫苗传统上由减活的病原体、完全灭活的生物体或灭活的毒素构成。 在多数情况下，这些疫苗能成功诱导基于抗体介导的应答的免疫保护。
然而，很多感染和恶性疾病，例如，HIV、 HCV、 TB、癌和疟疾，需要 诱导细胞介导的免疫(CMI)。尽管研发疫苗的新方法已有进展，如重组蛋 白亚基、合成肽、蛋白多糖复合物、DNA疫苗和使用模拟传染性致病剂 的抗原性的重组病毒载体，但是普遍的问题是疫苗的免疫原性通常很差。 因此，持续需要研发增强疫苗免疫原性的方法。
初免-加强接种通常用于增强疫苗免疫原性，即，对个体接种超过一 次，以引起再次免疫应答。在初免-加强接种中，"初免"阶段，即，第一 次接种步骤，包括将抗原提呈到初始免疫细胞，并产生记忆性B细胞和 T细胞。没有后续的抗原提呈，这些记忆性细胞的数量会减少。此外， 单次免疫经常诱导很小的应答以至于还要额外免疫。因此，为了提高产 生免疫应答的能力，需要补加"加强"接种，以产生更多的记忆性B细胞 和T细胞，如果接种的个体接下来接触抗原，就可以提供增强和加速的 再次应答。
初免-加强策略已应用很多年，例如用于接种麻疹和腮腺炎疫苗。最 近，异源初免-加强接种，即在加强中使用不同抗原，显示出在诱导CMI 应答方面比使用一种载体更有效。
本发明优选实施方案的目的是，提供一种用于加强疫苗中的免疫原
7性组合物，其能提供比无论本文是否提及的本领域公开的疫苗更大的效 力，还提供一种提高初免-加强接种功效的方法。
发明内容
在第一方面，本发明提供一种用于产生对抗原的免疫应答的免疫原 性组合物，所述组合物包括抗原和对淋巴居住的树突状细胞特异性的靶 向部分。
本发明者已确定，尽管初始和记忆性杀伤(CD8+) T细胞均能应答淋 巴居住的树突状细胞(DC)提呈的病毒性抗原，但令人惊异的是，只有初 始细胞能有效应答组织来源的DC。虽然记忆性杀伤T细胞能有效应答淋 巴居住的DC提呈的抗原，但是应答组织来源的DC提呈的抗原却很差。 因此，本发明者提出，使抗原靶向淋巴居住的DC会提高加强接种的效 率。这尤其令人惊异，因为一直认为记忆性T细胞比初始T细胞对刺激 能更好应答且更敏感。
在第二方面，本发明提供一种含有根据本发明第一方面的免疫原性 组合物的加强疫苗。
在第三方面，本发明提供一种包括第一疫苗和含有根据本发明第一 方面的免疫原性组合物的加强疫苗的试剂盒。
在第四方面，本发明提供一种诱导个体中免疫应答的方法，所述方 法包括给予所述个体含有根据本发明第一方面的免疫原性组合物的加强 接种。
在第五方面，本发明提供根据本发明第一方面的免疫原性组合物在 制造用于给予个体以诱导免疫应答的药物中的用途。
在第六方面，本发明提供一种用于产生对抗原的免疫应答的免疫原 性组合物，所述组合物包括抗原和对组织来源的树突状细胞特异性的靶 向部分。
本发明者认为，只有初始细胞才能有效应答组织来源的DC，这使他 们提出，使抗原耙向组织来源的DC可针对病原体提供增强的保护。如 果病原体通常诱导不擅于识别和抵抗病原体的特异性，则通过使适当类
8型的抗原耙向组织来源的DC，即可促进新特异性的扩增，而不必由原(无 效的)特异性竞争。
在第七方面，本发明提供一种诱导个体中免疫应答的方法，所述方 法包括给予个体初免或加强接种，所述接种含有根据本发明第六方面的 免疫原性组合物。
在第八方面，本发明提供根据本发明第六方面的免疫原性组合物在 制造用于给予个体以诱导免疫应答的药物中的用途。
图la显示了表达活化标记CD25、 CD69、 CD44和CD62L的初始和 记忆性CD8+ T细胞的表型分析。
图lb显示了用对HSV糖蛋白B (gB)特异性的初始或记忆性gBT-I CD8+ CSFE-标记的转基因T细胞培养的DC亚群的T细胞增殖分析的结 果。该DC亚群来源于之前3天感染WSN-gB的小鼠。
图lc显示了用CFSE-标记的内源性记忆性CD8+ T细胞培养的DC 亚群的T细胞增殖分析的结果。记忆性T细胞来源于之前3个月感染 WSN-gB的小鼠(上图)或之前6个月感染HKx31/PR8的小鼠(下图)。
图2a显示了用对HSV糖蛋白B (gB)特异性的初始gBT-I CD8+ CSFE-标记的转基因T细胞培养的DC的T细胞增殖分析的结果。DC亚 群来源于在不同时间感染WSN-gB的小鼠。
图2b是通过直接体外分析绘制的由纯化的DC亚群提呈到T细胞的 抗原提呈程度的示意图。该图还显示了图2c和图2d中应用的方案。
图2c显示了转移到未感染的小鼠(中间图)或之前10天感染WSN-gB 的小鼠(上图)或之前3天感染WSN-gB的小鼠(下图)中的CFSE-标记的初 始或记忆性gBT-I CD8+ T细胞分化的流式细胞法分析。
图3a和图3b显示了初始和记忆性T细胞的混合培养物对肺部DC (图3a)和淋巴居住的DC(图3b)的应答。
图3c显示了病毒感染3天后，初始和记忆性T细胞对来自纵膈淋巴结(MLN)的不同DC亚型混合物的应答。
图3d显示了初始和记忆性T细胞对SSIEFARL肽涂布的来自MLN 的CD8 DC和CDllbT)C的应答。
图3e显示了初始和记忆性T细胞对SSIEFARL肽涂布的来自皮肤引 流LN的CD8+和CD8T)EC205+ (Langerhans细胞和真皮的)DC的应答。
图3f显示了初始和记忆性T细胞对SSIEFARL肽涂布的来自流感感 染小鼠的淋巴结居住的DC和肺部来源的DC的CD8+和CD8X:Dllb—DC
的应答。
每个图均显示了流式细胞法计数的增殖的gBT-ICD8+T细胞。每个 数据集的数据是两个实验的代表性数据。
图4显示了 CD8+ DC (黑线)和肺部来源的DC (CD8-CDllb'，灰色) 的流式细胞计数轮廓图，这两种DC均富集自之前3天感染流感HKx31 病毒的小鼠的纵膈LN。用抗CDllc、CDllb和CD8的抗体以及抗B7-H1、 B7-H2、 B7-DC、 B7-RP、 B7-l、 B7-2或BTLA-4的抗体对细胞进行染色。
图5显示了纯化的CD8aDC或CDllbX:D8l巿部来源的DC，它们来 自在CD70的1 mg/ml阻断性单克隆抗体(克隆体FR70)存在或不存在的 条件下用CFSE-标记的初始或记忆性gBT-I培养的WSN-gB感染小鼠的 纵膈淋巴结。60h后，通过流式细胞法来估算增殖。数据表示为相对于同 型对照增殖的降低，并从3个独立实验来收集数据。需要指出的是，因 为记忆性T细胞不应答肺部来源的DC，所以没有测定(n.d.)该值。
图6显示了在与小鼠的记忆性或初始T细胞竞争过程中增殖的记忆性 或初始T细胞的数量，该小鼠鼻内感染WSN-gB并在10天后进行组织分析 (图6a 图6c)，或静脉内感染并在8天后分析(图6d)。每个图的上方列出了 竞争群对应答群。y轴的数字示出了在实验结束时检测的应答群的数量。 x轴的数字示出了加到小鼠中的竞争细胞的数量。所示数据显示了各个实 验的结果，每个实验点至少两个小鼠。在图6e中，小鼠未经处理(左凰， 没^)或用2.2x106 CD44highCD62higH^l^ftCD8+ T细胞过继转移，该细胞 从之前至少12周感染流感HKx31的小鼠纯化得到(左房，记忆丝潘應；-
勒。24h后，使小鼠鼻内感染HKx31。
IO天后，对脾脏进行对DbNP366-374或DbpA224-233特异性的内源性(左勒或转移的记忆性(吝勒CD8+ T细胞的
数量分析。从4个实验收集数据，每个圆形代表一个小鼠。在图6f中，小 鼠未经处理(左厫，没苟或用2.2x106 0044^1^0621^记忆性008+ T细胞 过继转移，该细胞从之前至少12周感染流感HKx31的小鼠纯化得到(左
记/Z丝潘應；^席勒。24h后，使小鼠静脉内感染HKx31。 8天后， 对脾脏进行对DbNP^.^或DbpA^.^特异性的内源性(左房/玄勒或转移 的记忆性(勿坊勤CD8+T细胞的数量分析。初始未感染的小鼠的数值(吝 勒。从2个实验收集数据，每个圆形代表一个小鼠。
图7显示了用对gB特异性的gBT-I CD8+ CFSE-标记的初始CD8+ T 细胞(上排)或不同类型的记忆性转基因CD8+ T细胞(中间两排)或内源性 CD8+ T细胞(下排)共培养的纯化DC的流式细胞法分析。矩形图代表具 有相似结果的2个实验并显示了 T细胞群的增殖。每个图的增殖细胞的 百分比和数量(括号)也被示出。
具体实施例方式
参与T细胞应答的DC首先捕获外周组织的抗原，然后迁移到引流 淋巴的器官，为T细胞初免提呈抗原。DC是免疫系统所用的最有效的抗 原提呈细胞(APC)。
DC是由多个亚群构成的异源细胞类型。有些DC永久存在于淋巴器 官内(淋巴居住的)，而有些DC(组织来源的)却被发现是在非淋巴组织内 并且只有在抗原捕获过程中才迁移到局部淋巴结内。
DC是几种免疫应答的有效APC。不同发育或活化阶段的不同DC 亚群和DC表达不同的表面分子，并且分泌细胞因子，该细胞因子选择 性地决定诱导的免疫应答类型。例如，肺部感染流感病毒后，两类树突 状细胞负责活化初始病毒特异性的杀伤T细胞[Bdz, GT.等人，PNAS, vol. 101, no. 23 p 8670-8675]。这些树突状细胞经鉴定为CD205+CD1 lb-CD8oT (肺部来源的)和CD205+CDllb'CD8a+ (淋巴居住的)树突状细胞。
因为据报道，记忆性T细胞的共刺激需求比初始T细胞少，所以本 发明者研究在肺部感染流感病毒过程中，记忆性T细胞是否可以应答初
11始T细胞识别的两种类型之外的DC亚群。出乎意料的是，发现记忆性T 细胞没有初始T细胞应答的范围宽。记忆性T细胞不能应答肺部来源的 DC (CD8')的抗原提呈而增殖，但是的确应答淋巴居住的DC (CD8+)的抗 原提呈。无论通过接触病毒感染在体外或体内产生记忆性T细胞，都是 这种情形。
为定量评价肺部来源的DC对初始和记忆性T细胞剌激能力的差异 而进行了进一步实验，该实验揭示了记忆性T细胞对肺部来源的DC的 敏感性减少了大约10倍。因而，尽管肺部来源的DC在感染过程中不能 刺激记忆性T细胞对流感病毒作出应答，但却不能将此归因于DC细胞 群完全不能活化记忆性T细胞，而是因为刺激能力减少了 10倍。然而， 实际上，这种差异可能意味着当在肺部来源的DC上提呈时，大多数自 然刺激对刺激记忆性T细胞无效。
本发明者考虑过是否这些发现可扩展到肺部来源的DC之外的DC。 他们将其与皮肤来源的DC的抗原提呈相比较，再次发现，尽管淋巴居 住的DC刺激初始和记忆性细胞的程度相同，但是皮肤来源的DC刺激记 忆性T细胞的有效程度要少10倍。
本发明者还发现，当存在竞争性记忆性细胞时，迁移的(组织来源的) DC对初始T细胞刺激至关重要。这就解释了为何尽管存在预先形成的对 肺部流感病毒感染的记忆，但是还可以检测到初始T细胞应答。
因此，本发明者提出，加强疫苗应当使抗原靶向淋巴居住的DC以 便刺激记忆性T细胞。因为记忆性T细胞应答迁移的DC的能力弱，组 织来源的DC处理的抗原将不能刺激记忆性T细胞，所以任何针对非淋 巴居住的DC的抗原在加强疫苗中均被大大浪费。本发明提高了加强接 种中的效率。
研究还显示出，初始T细胞比记忆性T细胞对组织来源的DC的刺 激更敏感，与初始T细胞应答淋巴居住的DC的程度相同。这就质疑了 长久以来的观点，即记忆性T细胞的共刺激需求比初始T细胞少。
本发明者提出，本发明的相反角度也可能是正确的，即尽管之前已 产生了对抗原的初免免疫应答并且存在记忆性细胞，但是特异性地使淋巴居住的DC不附着抗原，而使抗原靶向组织来源的DC，可有效产生初
始免疫应答。如果抗原(例如病原体)通常诱导不擅于识别和抵抗病原体的 特异性，则可能特别有利。
本发明涉及一种免疫原性组合物。本文所述的免疫原性组合物是任 何能产生免疫应答的组合物或制剂。
免疫应答是机体对外来抗原的反应。这种应答可中和或消除抗原并 对未来遭遇的微生物或毒素提供保护性免疫。
本文可交替使用的术语"免疫应答"或"免疫"，指的是诱导体液的(即，
B细胞)和/或细胞的(即，T细胞)应答。适当地，可通过测量对抗原引入 宿主作出应答的、免疫动物血清内存在的抗原特异性抗体，来评价体液 免疫应答。可通过免疫哺乳动物血清的酶联免疫吸附测定，或通过免疫 动物血清的微量中和试验，来评价免疫应答。可利用CTL试验来测量从 免疫动物脾脏或其他器官分离出来的淋巴细胞的T细胞应答。
本发明的免疫原性组合物提供杀伤T细胞或CTL应答，并可任选地 提供辅助性T细胞应答。还可提供体液应答。
本领域技术人员可以理解的是，体液应答(抗体应答)是通过产生B 细胞而产生免疫保护，B细胞在应答抗原的过程中分泌抗体(与免疫细胞 的直接作用或细胞免疫应答不同)。抗体是B细胞在应答抗原过程中产生 的分子。当抗体附着抗原时，它们帮助破坏带有抗原的病原体(中和应答)。
本领域技术人员可以理解的是，细胞介导的免疫应答是免疫细胞直 接作用而提供的免疫保护。细胞介导的应答包括指导或参与免疫防御的T 细胞，SP，白血细胞(也称为T淋巴细胞)。T细胞包括细胞毒性T细胞(也 称为杀伤T细胞或Tk細胞)，其可破坏外来抗原感染的机体细胞。另一 个T细胞亚群为辅助性T细胞或TH细胞亚群。这些细胞行使信使的功能。 它们对启动抗体产生、活化细胞毒性T细胞和引发多种其他免疫功能很 重要。
本文所述的初免免疫应答是个体第一次接触外来抗原产生的适应性 应答。与第二次或再后接触产生的应答相比，初免应答的特征是动力学
相对缓慢和数量级小。
13本文所述的再次免疫应答是个体第二次接触外来抗原发生的适应性 应答。与初免应答相比，通常再次应答的特征是动力学较快和数量级较 大。
因此，通过接种对免疫系统进行初免免疫。接种是给予疫苗形式的 抗原制剂，以诱导针对带有该抗原的微生物所引起的感染的保护性免疫。
初免是给予用于诱导免疫应答和免疫记忆的初始过程疫苗；然后可 给予后期疫苗剂量，称为加强。
初免还可在免疫系统接触传染性致病剂如病毒的过程中发生。
加强是为了增强免疫应答，在初免剂量后给予的第二次或再后的疫 苗剂量。加强疫苗可与初免疫苗相同，或不同(异源初免-加强)。
初免-加强是一种疫苗方案，其中，进行初免疫苗注射之后，在某一 后面时间用相同或不同(异源初免-加强)的疫苗制剂进行加强注射。初免-加强组合可诱导比初免免疫所看到的更强的免疫应答或类型不同的免疫 应答。
初始细胞是之前没有遭遇过抗原的成熟B或T淋巴细胞，但不是抗
原剌激的成熟淋巴细胞的后代。当初始淋巴细胞受抗原剌激时，它们分
化为效应性淋巴细胞，如分泌抗体的B细胞或辅助性T细胞和杀伤性T 淋巴细胞(CTL)。初始淋巴细胞具有与之前活化的淋巴细胞不同的表面标 记和再循环模式。
记忆性细胞是B或T淋巴细胞，它们介导对第二次和再后接触抗原 的快速和增强的应答，即，记忆性(或回忆)应答。记忆性B和T细胞通 过初始淋巴细胞的抗原刺激而产生，并且在消除抗原后可以功能性静态 存活很多年。
树突状细胞是由多亚群构成的异源细胞类型。本文所述的淋巴居住 的DC是永久居住于淋巴器官内的树突状细胞，尤其是在小鼠的脾脏和 淋巴结内发现的CD8+CD205+亚群。组织来源的DC或迁移的DC是在非 淋巴组织内发现的并且在抗原捕获过程中(或自发地)迁移到淋巴结的 DC。组织来源的DC包括肺部和皮肤中存在的DC。
14在实施例中，以流感病毒作为抗原来描述本发明。本发明者提出， 本发明同样适用于增强对其他病毒性抗原的免疫应答，还适用于增强对 癌或肿瘤抗原以及来自病毒、细菌、真菌或其他来源的任何病原体的抗 原的免疫应答。
本文所述的抗原是在适当条件下使受试者产生免疫应答的任何物 质，包括但不限于多肽、肽、蛋白、糖蛋白和多糖。
可用于本发明的免疫原性组合物的抗原包括来自动物、植物、病毒、 原生动物、寄生虫、细菌的抗原，或与疾病状态如癌有关的抗原，例如 肿瘤抗原，或相同或不同来源的抗原组合。
本发明的免疫原性组合物可包括一种以上的抗原。
抗原可以是来源于病毒的任何病毒性肽、蛋白、多肽或其片段，包 括但不限于流感病毒性蛋白(例如，流感病毒神经氨糖酸苷酶、流感病毒
红血球凝集素)、呼吸道合胞体病毒(RSV)-病毒性蛋白(例如，RSVF糖蛋 白、RSVG糖蛋白)、单纯疱疹病毒(HSV)病毒性蛋白(例如，单纯疱疹病 毒糖蛋白，包括例如gB、 gC、 gD和gE)。细菌抗原的例子包括衣原体 MOMP和PorB抗原。可用于本发明的免疫原性组合物的致病性病毒的 抗原包括腺病毒科病毒(例如，哺乳动物腺病毒和禽腺病毒)、疱疹病毒科 病毒(例如，单纯疱疹病毒l型、单纯疱疹病毒2型、单纯疱疹病毒5型 和单纯疱疹病毒6型)、光滑噬菌体科病毒(例如，光滑噬菌体病毒、肠杆 菌噬菌体MS2、 allolevirus)、痘病毒科病毒(例如，脊椎动物痘病毒、副 痘病毒、禽痘病毒、山羊痘病毒、兔痘病毒、猪痘病毒、软疣痘病毒和 昆虫痘病毒)、乳多空病毒科病毒(例如，多瘤病毒和乳头瘤病毒)、副粘 病毒科病毒(例如，禽副粘病毒、副流感病毒1型)、麻疹病毒属病毒(例 如，麻疹病毒)、腮腺炎病毒属病毒(例如，腮腺炎病毒)、肺病毒亚科病 毒(例如，肺病毒属病毒、人呼吸道合胞体病毒)、偏肺病毒属病毒(例如， 鸡肺炎病毒和人偏肺病毒属病毒)、小RNA病毒科病毒(例如，肠道病毒、 鼻病毒)、肝病毒属病毒(例如，人甲肝病毒)、心病毒属病毒、鹅口疮病 毒属病毒、呼肠孤病毒科病毒(例如，正呼肠孤病毒属病毒、环状病毒属 病毒、轮状病毒、质型多角体病毒属病毒、斐济病毒属病毒、植物呼肠 孤病毒属病毒和水稻病毒属病毒)、逆转录病毒科病毒(例如，哺乳动物B型逆转录病毒、哺乳动物C型逆转录病毒、禽C型逆转录病毒、D型逆
转录病毒组、BLV-HTLV逆转录病毒)、慢病毒(例如，人类免疫缺陷病 毒1型和人类免疫缺陷病毒2型)、泡沫病毒属病毒、黄病毒科病毒(例如， 丙型肝炎病毒)、肝病毒科病毒(例如，乙型肝炎病毒)、披膜病毒科病毒(例 如，甲病毒属病毒(例如，辛德毕斯病毒)和风疹病毒属病毒(例如，风疹 病毒))、弹状病毒科病毒(例如，水疱病毒属病毒、狂犬病毒属病毒、短 暂热病毒属病毒、质型弹状病毒属病毒和核型弹状病毒属病毒)、沙粒病 毒科病毒(例如，沙状病毒属病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、爱皮 病毒和拉沙热病毒)和冠状病毒科病毒(例如，冠状病毒属病毒和曲状病毒 属病毒)。
抗原可以是传染性致病剂，包括但不限于流感病毒红血球凝集素、 人呼吸道合胞体病毒G糖蛋白、登革病毒的核心蛋白、基质蛋白或其他 蛋白、麻疹病毒红血球凝集素、单纯疱疹病毒2型糖蛋白gB、脊髓灰质 炎病毒I型VP1、 HIVI型包膜糖蛋白、乙型肝炎表面抗原、白喉毒素、 链球菌24M表位、淋球菌菌毛蛋白、伪狂犬病病毒g50 (gpD)、伪狂犬 病病毒II型(gpB)、伪狂犬病病毒gIII (gpC)、伪狂犬病病毒糖蛋白H、 伪狂犬病病毒糖蛋白E、传染性胃肠炎糖蛋白195、传染性胃肠炎基质蛋 白、猪轮状病毒糖蛋白38、猪小病毒衣壳蛋白、蛇形螺旋体保护性抗原、 牛病毒性腹泻糖蛋白55、新城疫病毒红血球凝集素-神经氨糖酸苷酶、猪 流感红血球凝集素、猪流感神经氨糖酸苷酶、口蹄疫病毒、猪霍乱病毒、 猪流感病毒、非洲猪瘟病毒、Liy叩neutiioniae支原体、牛传染性鼻气管 炎病毒(例如，牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白E或糖蛋白G)、传染性喉气 管炎病毒(例如，传染性喉气管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白1)、克罗斯病毒 糖蛋白、初生犊牛腹泻病毒、委内瑞拉马传染性脑脊髓炎病毒、庞塔托 鲁病毒、小鼠白血病病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、乙型肝炎病毒核心蛋白 和/或乙型肝炎病毒表面抗原或其片段或其衍生物、马流感病毒或马疱疹 病毒抗原(例如，马流感病毒A型/Alaska 91神经氨糖酸苷酶、马流感病 毒A型/Miami 63神经氨糖酸苷酶、马流感病毒A型/Kentucky 81神经氨 糖酸苷酶、马疱疹病毒1型糖蛋白B和马疱疹病毒1型糖蛋白D)、牛呼 吸道合胞体病毒或牛副流感病毒抗原(例如，牛呼吸道合胞体病毒附着蛋 白(BRSVG)、牛呼吸道合胞体病毒融合蛋白(BRSVF)、牛呼吸道合胞体
16病毒核衣壳蛋白(BRSVN)、牛副流感病毒3型融合蛋白和牛副流感病毒3 型红血球凝集素神经氨糖酸苷酶)、牛病毒性腹泻病毒糖蛋白48或糖蛋 白53。
抗原还可以是癌抗原或肿瘤抗原。本领域技术人员所知的任何癌或 肿瘤抗原可用于本发明中，包括但不限于KS 1/4泛-癌抗原、卵巢癌抗原 (CA125)、前列腺酸性磷酸盐、前列腺特异性抗原、黑色素瘤相关的抗原 p97、黑色素瘤抗原gp75、高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)、前列腺 特异性膜抗原、肿瘤胚抗原(CEA)、多态性上皮粘蛋白抗原、人乳脂肪球 蛋白抗原、结直肠肿瘤相关的抗原如CEA、 TAG-72、 LEA、 Burkitt的 淋巴瘤抗原-38.13、 CD19、人B-淋巴瘤抗原-CD20、 CD33、黑色素瘤特 异性抗原如神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2、神经 节苷脂GM3、肿瘤特异性移植型细胞-表面抗原(TSTA)如病毒诱导的肿 瘤抗原，包括T-抗原DNA肿瘤病毒和RNA肿瘤病毒的外被抗原、肿瘤 胚抗原-a-胎蛋白如结肠CEA、膀胱肿瘤胚抗原、分化抗原如人肺癌抗原 L6、 L20、纤维肉瘤抗原、人白血病T细胞抗原-Gp37、拟糖蛋白、神经 鞘脂类、乳腺癌抗原如EGFR (上皮细胞生长因子受体)、HER2抗原 (pl85HER2)、多态性上皮粘蛋白(PEM)、恶性人淋巴细胞抗原-APO-l、 分化抗原如胎儿性红血球、原内胚层中发现的I类抗原、成人性红血球、 植入前胚胎中发现的I类抗原、胃腺癌中发现的I(Ma)、乳腺上皮中发现 的M18、 M39、骨髓细胞中发现的SSEA-1、结直肠癌中发现的VEP8、 VEP9、 Myl、 VIM-D5、 Du56-22、 TRA-1-85 (血型H)、结肠腺癌中发现 的C14、肺腺癌中发现的F3、胃癌中发现的AH6、 Y半抗原、胚胎性癌 细胞中发现的LeY、 TL5(血型A)、 A431细胞中发现的EGF受体、胰腺 癌中发现的E1系列(血型B)、胚胎性癌细胞中发现的FC10.2、胃腺癌抗 原、腺癌中发现的CO-514(血型Lea)、腺癌中发现的NS-IO、 CO-43 (血 型Leb)、 A431细胞的EGF受体中发现的G49、结肠腺癌中发现的MH2 (血型ALeb/Ley)、结肠癌中发现的19.9、胃癌粘蛋白、骨髓细胞中发现 的TsA7、黑色素瘤中发现的R24、胚胎性癌细胞中发现的4.2、 GD3、 Dl.l、 OFA-l、 GM2、 OFA-2、 GD2禾tl Ml: 22: 25: 8、以及4~8细胞 阶段胚胎中发现的SSEA-3和SSEA-4。抗原可以包括病毒，需要免疫应答来对抗病毒。病毒可以是重组或 嵌合病毒。病毒可被减毒。使用本领域技术人员所知的标准方法可进行 重组、嵌合和减毒病毒的生产。本发明包括活的重组病毒性抗原或灭活 的重组病毒性抗原。
优选的重组病毒是对被给予的受试者呈非致病性的那些病毒。考虑 到此点，将基因工程病毒用于疫苗时，可能需要这些菌株存在减毒特征。
将适当突变(例如，缺失)引入转染所用的模板可为新病毒提供减毒 特征。例如，与温度敏感性或冷适应相关的特异性错义突变可产生缺失 突变。这些突变应该比与冷或温度敏感性突变体相关的点突变更稳定， 并且回复频率应该非常低。
可选择地，可构建具有"自杀"特征的嵌合病毒以用于本发明的免疫 原性组合物。所述病毒在宿主内只经历一轮或几轮复制。当用作疫苗时， 重组病毒经历有限的复制周期并诱导足够水平的免疫应答，但是在人宿 主内不会进一步发展并引起疾病。
可选择地，灭活的(杀死的)病毒可用作抗原。可使用常规技术"杀死" 嵌合病毒来制备灭活的疫苗制剂。灭活的疫苗是"死亡的"，指的是其传 染性已被破坏。理想的是，病毒的传染性被破坏但不影响其免疫原性。 为制备灭活的疫苗，可使嵌合病毒在细胞培养液或鸡胚胎的尿囊中生长， 通过区带超速离心法纯化，用甲醛或-丙内酯灭活，然后收集。
在某些实施方案中，可将完全外源的表位(包括源自其他病毒或非病 毒性病原体的抗原)通过工程方法用于本发明的免疫原性组合物。例如，
可将无关的病毒，如HIV(gp160、 gpl20、 gp41)寄生虫抗原(例如，疟疾)、 细菌或真菌的抗原或肿瘤抗原，工程改造成减毒的菌株。
抗原可包括经疾病控制中心鉴定的一种以上的选定病原体和毒素。 在具体实施方案中，免疫原性组合物可包括来自葡萄球菌肠毒素B、肉
毒杆菌毒素、炭疽热保护性抗原和鼠疫耶尔森氏菌的一种以上的抗原。 另外的抗原是本领域技术人员所知的抗原。
本发明的免疫原性组合物可包括来自一种菌株或来自多种菌株的抗 原。例如，如果抗原为流感病毒抗原，则免疫原性组合物可含有取自多达三种以上病毒性菌株的抗原。仅仅是作为例子，流感疫苗制剂可含有 来自甲型流感的一种以上菌株的抗原以及来自乙型流感的一种以上菌株
的抗原。流感菌株的例子是甲型流感/Texas/36/91 、甲型流感 /Nanchang/933/95和乙型流感/Harbin/7/94的菌株。
在最优选的实施方案中，免疫原性组合物包括流感病毒抗原。在一 个实施方案中，流感病毒抗原是含有嵌入神经氨酸酶茎部的HSV的 gB498-5G5K、限制性表位的重组流感WSN_gB (H1N1) (Blaney等人，1998 J.
Virol. 12:9567-74)。其他适合的抗原包括市售的流感疫苗FLUZONE , 它是减毒的流感疫苗(Connaught Laboratories, Swiftwater, Pa.)。 FLUZONE 是三价亚病毒疫苗，其含有15 pg/剂量的来自甲型流感/Texas/36/91 (NINI)、甲型流感/Beijing/32/92 (H3N2)和乙型流感/Panama, 45/90病毒的 每一种HA。使用的抗原可以是HSV (SSIEFARL)的gB498.5。5 Kb-限制性表 位。本领域技术人员会识别出用于本发明的适合的流感病毒抗原。
根据本发明的第一方面和如本文所述，对淋巴居住的树突状细胞特 异性的靶向部分是能将与之相关的抗原优先于组织来源的DC而导向淋 巴居住的DC的部分。使用术语"特异性的"不用于指靶向部分只能耙向淋 巴居住的DC,而是优先于任何其他DC，靶向淋巴居住的DC，即，靶向 部分对淋巴居住的DC具有选择性。这种部分是本领域技术人员所知的。
相比于组织来源的DC，靶向部分可2倍、4倍、5倍、8倍、10倍、15 倍、20倍、30倍、50倍或更多倍地对淋巴居住的树突状细胞优先。
淋巴居住的DC群可通过表面分子在DC上的不同表达被靶向。可使 用产生这些分子的抗体将抗原运送到淋巴居住的DC亚群。将要被靶向的 淋巴居住的DC的基本亚群是CD8+淋巴居住的DC，更尤其是 CDllc+CD8+CD205+CDllbT亚群。可利用抗体-抗原复合物来使这些亚群 被靶向，其中抗体被靶向到CD8oc或被这种亚群优先表达的其他表面抗 原。适合的靶向部分可包括Sca-l (Spangmde等人，J. Imm皿ol. 141:3697-707， 1988)、 Sca-2 (Spangrude等人，J. Immunol. 141:3697-707, 1988)、 CDldl (Renukaradhya等人,J. Immunol. 175:4301-8, 2005)、 CD36 (Belz等人，J. Immunol. 168:6066-70,2002)、 CD52、 CD8a、 Gprl05 (Moore 等人，Brain Res Mol Brain Res 118:10-23,2003)、 G-蛋白偶联受体超家族成员、Micl (Marshall等人，J Biol Chem 279:14792-802, 2004)和其他C型外 源凝集素和C型外源凝集素样分子、Igsf4 (Galibert等人，J Biol Chem 280:21955-64, 2005)、 Treml4和Ig超家族的其他成员以及含有Ig结构域的 分子。其他适合的靶向部分包括nec12 (Galibert等人，2005,同上)、Pslcl (Qin H.等人，Immunology, 117:419-30, 2006)、 synCaM (Furuno等人，J Immunol 174:6934-42, 2005)和sglgsf (Furuno等人，J Immunol 174:6934-42, 2005)。
优选地，靶向部分与淋巴居住的DC上的标记结合或与其以其他方式 关联，由此使抗原与淋巴居住的DC接近，以进行抗原处理。
淋巴居住的DC可被靶向的另一个途径是使用优先于任何其他细胞 或组织类型，而对淋巴细胞特异性的靶向部分。该方法也能实现使抗原 与淋巴居住的DC接近，以进行抗原处理。
根据本发明的第六方面和本文所述，对组织来源的树突状细胞特异 性的靶向部分是能将与之相关的抗原优先于淋巴居住的DC而导向组织 来源的DC的部分。使用术语"特异性的"不用于指耙向部分只能耙向组织 来源的DC，而是优先于任何其他DC，靶向组织来源的DC。这种耙向部 分是本领域技术人员所知的。组织来源的DC群可通过表面分子在DC上的 不同表达被靶向。可使用产生这些分子的抗体将抗原运送到组织来源的 DC亚群。将要被靶向的组织来源的DC的基本亚群是肺部的 CD8-CD205+CD1 lbT亚群或皮肤的CD8-CD205+CD1 lb+亚群(也称作真皮 树突状细胞和Langerhans细胞)。可利用抗体-抗原复合物来使这些亚群被 靶向，其中抗体被靶向组织来源的DC的特异性标记，如Langerin (Valladeau等人,Immunity 12:7181, 2000)、 CDllb (Kurzinger K等人,J. Biol. Chem 257:12412-8, 1982)、 Flrt3 (Lacy SE等人，Genomics. 1999 62:417-26)、干扰素诱导的跨膜蛋白l (Ishii K等人，Immunol Lett. 2005 98:280-90)、 G蛋白偶联受体68 (Radu CG等人,Proc Natl Acad Sci USA. 2005 102:1632-7)、趋化因子(C-X-C基元)受体4 (Okutsu M等人，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2005, 288:R591-9)。
相比于淋巴居住的DC，靶向部分可2倍、4倍、5倍、8倍、10倍、15 倍、20倍、30倍、50倍或更多倍地对组织来源的树突状细胞优先。
20靶向部分可与抗原关联或与抗原结合。
正如蛋白化学领域的技术人员能认识到的，通过很多方法可将抗原 与靶向部分结合。
这些方法的例子包括
1) 亲和偶联，如抗原-配体融合，其中配体对靶向抗体(配体的例子 可以是链球菌蛋白G、链球菌蛋白A、消化链球菌蛋白L)或特异性抗体
具有亲和性，从而使抗原与靶向部分交联。
2) 化学交联。有很多公知的交联方法，包括高碘酸盐-硼氢化物法、 碳二酰亚胺法、戊二醛法、光亲和标记法、环氧乙烷法和各种琥珀酰亚 胺酯法(如马来酰亚胺苯甲酰基-琥珀酰亚胺酯法)。这些物质中很多易于
商购得到，例如从Pierce, Rockford,IL, USA等商购得到。交联技术有很 多参考资料，包括Hermanson GT "Bioconjugate Techniques" Academic Press, San Diego 1996; Lee YC, Lee RT. Conjugation of glycopeptides to proteins. Methods Enzymol. 1989;179:253-7; Wong SS "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking" CRC Press 1991; Harlow E & Lane D "Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Marriott G, Ottl J. Synthesis and applications of heterobifunctional photocleavable cross-linking reagents. Methods Enzymol. 1998;291:155-75 。
3) 基因融合。这些可被制成重组抗体-抗原融合蛋白(在细菌、酵母、 昆虫或哺乳动物体系内)，或用于DNA免疫，在抗体和抗原之间可以有 连接子或者没有。关于免疫球蛋白与其他分子的融合有很多出版物。与 抗原如流感血凝素的融合已为本领域所知，参见，例如，Deliyannis G， Boyle JS, Brady JL, Brown LE, Lew AM. "A fusion DNA vaccine that targets antigen-presenting cells increases protection from viral challenge." Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2000 97:6676-80。还可将短序列插入免疫球蛋白分子本 身[Lunde E， Western KH, Rasmussen IB, Sandlie I, Bogen B. "Efficient delivery of T cell epitopes to APC by use of MHC class 11-specific Troybodies." J Immunol. 2002 168:2154-62]。抗体分子的縮短形式(例如Fv片段)也可 用于基因融合[Reiter Y, Pastan I. "Antibody engineering of recombinant Fvimmunotoxins for improved targeting of cancer : disulfide-stabilized Fv immunotoxins." Clin. Cancer Res. 1996 2:245-52]。
靶向部分和抗原可直接结合或通过连接子接合到构建体中。连接子 可以是合成的连接子。连接子可以是共价键。可以融合蛋白的形式提供 抗原和耙向部分(及可选的连接子)。
在另一个实施方案中，可以核酸构建体的形式提供免疫原性组合物。
在另一个实施方案中，分别但彼此关联地提供靶向部分和抗原，以 使抗原靶向适当的DC。
根据本发明第一方面的免疫原性组合物可用于加强疫苗，并且可任 选地连同初免疫苗一起以试剂盒的形式提供。尽管优选使用相同的抗原， 但是初免疫苗和加强疫苗可含有不同抗原。
疫苗可以是活疫苗、减毒疫苗、灭活或"杀死的"疫苗、亚单位疫苗、 类毒素疫苗、组合疫苗、DNA疫苗或重组载体疫苗。疫苗研发领域的技 术人员将易于理解这些术语中每一个的含义。
在有些优选的实施方案中，以下列形式制备本发明的疫苗以给予哺 乳动物受试者，例如，液体、粉末、气雾剂、片剂、胶囊、肠溶包衣片 或肠溶包衣胶囊、或栓剂。给予途径包括但不限于胃肠外给予、腹膜内 给予、静脉内给予、肌内给予、皮下给予、皮内给予、口服给予、局部 给予、鼻内给予、肺内给予、直肠给予、阴道给予等。所有这些途径均 适于给予这些组合物，并可取决于受治患者和病情以及相似因素，由主 治医师来选择途径。
治疗使用的疫苗有效剂量取决于，例如，治疗目的、给予途径和受 试者病情。因此，治疗专家必须根据需要滴定剂量和更改给予途径以获 得最佳治疗效果。取决于输送模式，通常的日剂量可为约l mcg/kg至l mg/kg以上。
疫苗的剂量水平通常为约50 mcg 约5 mg/kg体重，优选剂量为约 0.1 mg 约1 mg/kg体重/天(约0.5 g 约3 g/患者/天)。取决于受治的宿主 和给予的特定模式，与载体材料组合而产生单剂型的活性成分的用量各 有不同。剂型单位形式通常含有约5mg 500 mg的活性成分。
22然而，可以理解的是，任意特定患者的具体剂量水平取决于多种因 素，包括使用的具体化合物的活性、年龄、体重、 一般健康情况、性别、 饮食情况、给予时间、给予途径、排泄率、联合用药和进行治疗的特定 疾病的严重程度。
在本领域技术人员所知范围内选择和上调或下调有效剂量。第一方 面的本发明允许耙向加强接种，因此希望，只需较低剂量的加强接种即 能达到与使用非靶向的抗原所能获得的相同水平的免疫应答。
优选在给予初免疫苗约4周~约32周后，将任意加强疫苗给予患者。
可以经由与初免疫苗步骤相同的途径和相同的剂量给予加强疫苗，或以 不同剂量或经由不同途径给予加强疫苗。
优选将疫苗配制为药物制剂。这种制剂包括与药学上可接受的载体 组合的抗原和/或耙向部分，该载体例如是无菌水或灭菌等渗压盐水。适 合的载体对本领域技术人员来说是显而易见的，并且在很大程度上取决 于给予途径。这种制剂包括但不限于混悬剂、溶液、油或水介质中的乳 液、糊剂和可植入的缓释或可生物降解的制剂。这种制剂可进一步包括 一种以上的额外成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于 胃肠外给予的制剂的一个实施方案中，在胃肠外给予复水组合物之前，
以干燥(s卩，粉末或颗粒)形式提供活性成分，以便用适合的介质(例如，
灭菌的无热原质的水)进行复水。其他有用的可胃肠外给予的制剂包括含 有微晶形式、脂质体制剂形式活性成分的那些制剂，或含有作为可生物 降解的聚合物体系组分的活性成分的那些制剂。用于缓释或植入的制剂 可包括药学上可接受的聚合或疏水材料，如乳液、离子交换树脂、微溶 聚合物或微溶盐。
还可存在于制剂中的额外成分是佐剂、防腐剂、化学稳定剂或其他 抗原蛋白。通常，对稳定剂、佐剂和防腐剂进行优化以确定对靶向的人 或动物有效的最好制剂。适合的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、 山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯类、乙基香草醛、 甘油、苯酚和对氯苯酚。可使用的适合的稳定成分包括，例如，酸水解
酪蛋白、蔗糖、凝胶、酚红、N-Z胺、二磷酸一钾、乳糖、乳白蛋白水 解物和干乳。常规的佐剂被用于吸引白细胞或增强免疫应答。这些佐剂包括MPL.TM. (3-0-去酰基单磷酰基脂质A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.)、矿物油和水、氢氧化铝、爱菲金(Amphigen)、阿夫 立定(Awidine)、 L121/角鲨烯、D-丙交酯-聚丙交酯/葡萄糖苷、复合多元 醇、胞壁酰二肽、灭活的博德特氏菌、皂角苷(如Quil A或Stimulon.TM. QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass.))以及霍乱毒素 (野生型或突变体形式，例如，其中，在氨基酸位置29处的谷氨酸被另 一个氨基酸，优选被组氨酸取代，根据国际专利申请No. PCT/US99/22520)。
在一个实施方案中，药物制剂，如果被注射，则在注射位置几乎没 有或没有不良的或不希望的反应，例如，皮肤刺激、肿胀、皮疹、坏疽、 皮肤过敏。
此外，本发明预期了一种制备药物制剂的方法，其包括使本发明的 免疫原性组合物与药学上可接受的赋形剂、介质或载体和任选的其他成 分混合。
本发明还包括用于诱导增强的加强免疫应答的试剂盒。这种试剂盒 优选包括初免疫苗组分和加强疫苗组分。
试剂盒的其他组件包括用于给予各组合物的施药器。作为本文所用 的术语，术语"施药器"指的是任何装置，包括但不限于皮下注射器、基 因枪、喷雾器、滴管、气管镜、栓剂、用于给予药物组合物的很多公知 类型的装置，即用于通过任何适合的途径将DNA疫苗成分和/或蛋白疫 苗成分给予人或兽患者的装置。另一个组件包括试剂盒的使用说明书。
可将本发明的免疫原性组合物给予个体以诱导免疫应答。优选地， 相对于只给予抗原(没有耙向部分)所得到的免疫应答，免疫应答被增强 (即，更大)。
通过本领域技术人员所知的方法可测定免疫应答水平，并因此可测 定免疫原性组合物或疫苗的效力。这些可包括测量CTL应答、抗体应答 或辅助性T细胞应答。通过体内杀伤T细胞分析(ColesRM等人，J Immunol. 2002;168:834-8)、特异性CTL的四聚体染色(Altaian J.D.等人， Science.l996;274:94-6)、体外重刺激和51-Cr释放分析(Bennett， S.R.等人，J.
24Exp. Med. 1997;186:65-70)、酶联免疫斑点分析(ELISpot) (Yamamoto M. 等人，J. Immunol. 1993;150:106-14)或通过细胞内细胞因子染色(Smith等 人，Nat. Immunol. 2004;5:1143-8)可测量CTL应答。通过酶联免疫斑点分析 (Czerkinsky CC等人，J Immunol Methods.l983;65:109-21)、或酶联免疫吸 附分析(ELISA) (Engvall E和Perlmann R J Immunol. 1972; 109:129-35)可测 量抗体应答。通过酶联免疫斑点分析(Taguchi T.等人，J Immunol Methods. 1990;128:65-73)、细胞内细胞因子染色(Andersson U.和Matsuda T. Eur J Immunol. 1989 Jun;19(6):l 157-60)或细胞因子的酶联免疫吸附分析 (Mosmann T. J Immunol Methods.l983;65:55-63)可测量辅助性T细胞应答。
本文所用的术语"个体"指的是人和非人灵长类(例如大猩猩、短尾猴、 狨猴)、家畜动物(例如绵羊、牛、马、驴、猪)、宠物(例如狗、猫)、实验 室试验动物(例如小鼠、兔、大鼠、天竺鼠、大颊鼠)、圈养野生动物(例 如狐狸、鹿)和可受益于本发明的免疫原性组合物的任何其他生物体。可 受益于本发明描述的免疫原性组合物的动物类型不受限制。本发明最优 选的受试者为家畜动物和人。无论个体是否为人或非人，个体均可以称 作患者、受试者、个体、动物、宿主或接受者。
在本说明书中，除非上下文另有需要，措词"包括"或其变型如"含有 "或"包含"，可理解为暗示包含所述要素或整数或一组要素或整数，但不 排除任何其他要素或整数或一组要素或整数。
应该理解的是，除非另有说明，本发明不限于具体治疗组分、制造 方法、剂量方案等，这些均可改变。还应该理解的是，本文所用的术语 只是用于描述具体实施方案而不用于限制本发明。
还必须指出的是，除非上下文另外清楚地说明，在本说明书中所用 的单数形式"一种"、"一个"和"这种"包括复数情况。
实施例
通过以下实验例，进一步详细描述本发明。除非另有说明，本发明 只是为了说明才提供这些实施例，而不是用于限制本发明。因此，本发 明包括由本文提供的教导所得到的任何和所有明显的变型。
25实施例1:
因为据报道，记忆性T细胞的共刺激需求比初始T细胞少(Croft,M. 等人，J. Immunol. 1994;152:2675-85) (Byrne, J.A.等人，J. Immunol. 1988;141:3249-57)，所以我们质疑在肺部感染流感病毒过程中，记忆性T 细胞是否可应答被初始T细胞识别的两种类型之外的DC亚群。为检验 这一点，我们通过用抗原体外剌激初始TCR转基因CD8+ T细胞并与 IL-15 —起培养至少14天来产生记忆性T细胞(图la)。
然后，我们使用这些细胞作为从病毒感染小鼠的肺部-引流淋巴结体 外分离得到的DC的应答子。在这些实验中，将表达单纯疱疹病毒糖蛋 白B (gB)的MHC I-限制性表位的重组WSN流感病毒用作传染性致病剂， 命名为WSN-gB，将来自gB特异性TCR转基因小鼠的T细胞gBT-I用 作应答CTL。鼻内感染3天后，在抗原提呈高峰时，从纵膈淋巴结中将 CDll+cDC分离出来，去除包括浆细胞样DC(pDC)在内的各种细胞，通 过表达CDllb和CD8a来分离。肺部来源的DC是CDllb'CD8— (CDllb— DC)，而负责将病毒性抗原提呈到初始T细胞的那些淋巴居住的DC是 CDllb'CD8+(CD8+DC)。剩余的CDllb+DC不好界定，但是极有可能代 表其他类型的淋巴居住的DC。
出乎意料的是，发现记忆性T细胞没有初始T细胞应答的范围宽， 虽然对淋巴居住的CD8+ DC保持活性，但不能针对肺部来源的DC提呈 抗原而增殖(图lb)。值得注意的是，当我们在至少6个月前使宿主接触 病毒感染，然后从正常T细胞库体内产生真正的记忆性T细胞时，也出 现这种情形(图lb)，这说明，该发现显示了记忆性CD8+T细胞的一致性 质，与它们的产生方法无关。在其后的实验中，基于CD45RA和CD8的 表达来分离DC，双阴性组(DNDC)内含有肺部来源的DC， CD45RA+DC 代表pDC。
方法
V、嵐由The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research的动物研究 院获得C57BL/6 (H-2b)、 B6.SJL-PtprcaPep3b/BoyJ (Ly5.1)、 gBT-I (H-2b) (Mueller, S.等人，Immunol. Cell Biol. 80:156-63, 2002)小鼠，并在无特异性 病原体的条件下保存它们。根据墨尔本董事会动物伦理委员会(Melboume Directorate Animal Ethics Committee)的规定，当所有小鼠为5~ 10周龄时， 才能开始用它们进行实验。
疯毒感染
用甲氧基荧烷麻醉小鼠，然后用含有嵌入神经氨酸酶茎部的HSV (SSIEFARL)的gB498.505 Kb-限制性表位的重组流感WSN-gB (H1N1) (Blaney, J.E.等人，J. Virol. 72:9567-74,1998)的非致命性致敏感染小鼠。对 于鼻内感染，小鼠接受稀释于25 plPBS中的10"PFU WSN-gB，而对于 静脉内感染，小鼠接受稀释于100 ^ PBS中的102'95 WSN-gB 。
DC分薯、分桥浙潜荞
如前所述，进行由脾脏或LN纯化DC、分析和制备性流式细胞法和 体外DC培养(Belz, G.T.等人，J.Exp.Med. 196:1099-104， 2002; Belz, G.T.等 人，J. Immunol. 172:1996-2000, 2004; Belz, G.T.等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:8670-5， 2004; Allan, R.等人，Science 301:1925-8, 2003; Smith, C.M.等人，Nature Immunol. 5:1143-8, 2004)。
<^^五-标记游0^+ r潘應游劍备
如前所述，通过去除非008+ T细胞，由收集的淋巴结(腹股沟的、 腋窝的、臂的、浅颈的和肠系膜的淋巴结)纯化初始。08+ gBT-I (H-2Kb-限制性anti-gB495.505)转基因T细胞(Belz， GT.等人,J.Exp.Med. 196:1099-104， 2002; Belz, G.T.等人,J. Immunol. 172:1996-2000, 2004)。根 据流式细胞法测定，T细胞群常规上为85-95% CD8+Vot2+。用5,6-CFSE 来标记初始和记忆性CD8+ T细胞(Belz, G.T.等人，J.Exp.Med. 196:1099-104， 2002; Belz, G.T.等人，J. Immunol. 172:1996-2000, 2004)，或 不标记就使用。培养60h后，对增殖进行定量。用CD8特异性mAb来
27标记gBT-I细胞，并重悬于含有2><104空白校正粒子的100 pL平衡盐溶 液(BSS)/30/。 v/v FCS中(BD Biosciences Pharmingen)。在LSR (Beckton Dickinson)上通过流式细胞法分析样品，由每5xl03颗珠的分裂细胞数来 计算活的分裂的淋巴细胞(Pr"CFSE'。w)总数。
记忆丝CX>S+ r潘應荐游产主
使用中枢记忆性T细胞体外分化的建立模型来产生记忆性CD8+ T 细胞(Belz, G.T.等人，Eur. J. Immunol. 36:327-35， 2006; Manjunath， N.等人, J. Clin. Invest. 108:871-8, 2001; Klebanoff, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102:9571-6， 2005; Klebanoff, C.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:1969-74, 2004; Wong, P.禾口 Palmer E.G. Immunity 18:499-511, 2003)。在 37。C下，使初始gBT-I转基因CD8+T细胞涂布lpMgB肽1小时。然后， 在用小鼠渗张性RPMI 1640完全培养基(RPMI 1640含有10%FCS、50 pM 2ME、 2mML-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100叫/ml链霉素，完全培 养基)于1.7xl()S细胞/ml下培养之前，将细胞在含有2.5% FCS的Hepes Earl培养基中洗涤两次。2天后，洗涤细胞并补充重组hlL15 (20 ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis,画55413 USA)。每3-4天更换一次含有 WL15的完全培养基，开始培养14~20天后使用细胞。
结果
图1示出了初始而不是记忆性CD8+ T细胞在应答来自流感病毒感染 的小鼠纵膈LN的肺部来源的(CD8'CDllb.) DC的过程中增殖。图la示 出了初始和记忆性CD8+T细胞的表型。初始gBT-I细胞在体外直接分离， 对体外活化17天的细胞(记忆性)分析活化标记CD25、 CD69、 CD44和 CD62L的表达，从而证实细胞的发育表型为活化的效应性细胞或记忆性 细胞。
鼻内感染400 PFU WSN-gB 3天后，由小鼠纵膈LN分离常规的 CD8+CDllb-DC、 CD8-CDllb-DC禾n CD8-CDllb+DC。在使用流式细胞 法分析之前，将纯化的0(3与对§8特异性的€08+ CFSE-标记的初始或 记忆性转基因CD8+ T细胞共培养60h。图lb示出的矩形图是具有相似结果的4个实验的代表。
流感病毒感染后，DC对初始T细胞的体外抗原提呈随时间变化的 检验显示出，尽管淋巴居住的CD8 DC只在前7大提呈病毒性抗原，但 是肺部来源的DC (图lc所用的DN DC组中也含有)可提呈抗原至少9天 (图2a)。在感染后的不同时间(每个时间点20个供体小鼠)，进行由MLN 分离DC、对CD8和CD45RA染色和将其分类为CD45RA+ DC (pDC)或 CD45RA- DC，艮卩CD8+ (CD8 DC)或CD8- (DN DC)。将这些DC与对单 纯疱疹病毒性糖蛋白B (gB)特异性的初始gBT-I CD8+ CFSE-标记的转基 因T细胞一起培养。60h后，对培养物进行T细胞增殖分析，通过稀释 CFSE来测量。在同一实验内完成感染3、 5、 7和9天后的分析。进行两 次该实验得到相似的发现，如图2a所示。在该实验中，通过表达CD45RA 和CD8来分离DC,双阴性组(DNDC)内含有肺部来源的DC， CD45RA+ DC代表pDC。如果，如以上数据所揭示的，记忆性T细胞只能应答淋 巴居住的CD8+DC，则当只有肺部来源的DC提呈病毒性抗原时，初始T 细胞，而不是记忆性T细胞，应该在7天后的时间点进行体内应答。为 检验这一点，使小鼠鼻内感染WSN-gB，然后10天后注射CFSE-标记的 初始或记忆性gBT-I细胞，从而在60h后体内检验增殖(图2b、图2c)。 作为阳性对照，当淋巴居住的DC应该能剌激初始和记忆性T细胞时， 在感染的第3天也注射CFSE-标记的T细胞(图2b、图2d)。与我们的看 法一致的是，当在第3天注射时，两种T细胞群均作出应答(图2c，下图)， 但是在第10天，只有初始T细胞增殖(图2c，上图)。这些数据证实了我 们的体外发现，显示出在体内，虽然肺部来源的DC能活化初始T细胞， 但是它们不能刺激记忆性T细胞。记忆性T细胞在第3天的应答能力(图 2c，下图)，以及第IO天转移后在LN中能检测到这些细胞(图2c，中间 图)，均证实了该细胞群能返回到淋巴结。
因此，肺部来源的DC延长的抗原提呈使初始而不是记忆性的抗原 特异性CD8+T细胞在感染后体内扩增。
对此观察的一个一般解释是，记忆性T细胞杀死肺部来源的DC或 抑制它们的功能，避免它们诱导增殖。这可通过共培养肺部来源的DC 与初始和记忆性T细胞的混合物而得到检验(图3a)。这显示出，尽管如所期望的，记忆性T细胞不能应答，但是初始T细胞仍能增殖。与之对
比，当一起培养时，淋巴居住的CD8+DC既刺激初始T细胞也刺激记忆 性T细胞(图3b)。
相反，为确定是否可通过DC本身提供的抑制因子来解释记忆性T 细胞对肺部来源的DC的较差应答，我们将记忆性T细胞在肺部来源的 DC存在或不存在时对淋巴结居住的DC的应答进行了比较(图3c)。
图3示出了 DC亚型剌激初始和记忆性CD8+T细胞的能力。图3a、 图3b示出了初始和记忆性T细胞的混合培养物对不同DC亚型的应答。 图3c示出了初始和记忆性T细胞对来自MLN的CD8 DC和CDllb' DC 的混合物的应答。图3d示出了初始和记忆性T细胞对肽涂布的来自MLN 的CD8 DC和CDllb'DC的应答。图3e示出了初始和记忆性T细胞对肽 涂布的来自皮肤引流LN的CD8+和CD8T)EC205+ (Langerhans细胞和真 皮的)DC的应答。在图3d、图3e中，用滴定浓度的SSIEFARL肽涂布 DC (5xl03) 60min，洗涤3次，然后与5xl04 CFSE-标记的CD8+ gBT-I转 基因T细胞一起培养60。通过流式细胞法对增殖的gBT-I CD8+ T细胞计 数。每个数据集的数据均是两个实验的代表性数据。肺部来源的DC没 有削弱对淋巴结居住的DC的应答，这揭示了明显的抑制机制并没有被 启动。
为了能更加定量地评价肺部来源的DC对初始和记忆性T细胞刺激 能力的差异，我们从未感染的小鼠分离淋巴居住的CD8 DC和肺部来源 的DC，用各种浓度的gB肽对其进行涂布，并检验其刺激初始和记忆性 gBT-IT细胞的能力(图3d)。这揭示了初始和记忆性T细胞对淋巴居住的 DC同等程度的应答，但是记忆性T细胞对肺部来源的DC的敏感性减少 了大约10倍。当使用来自病毒感染的小鼠的DC时，很明显有相似的结 果(图3f)。因此，尽管肺部来源的DC在感染过程中不能剌激记忆性T 细胞对流感病毒作出应答，但却不能将此归因于DC细胞群完全不能活 化记忆性T细胞，而应该归因于刺激能力减少了 IO倍。然而，实际上， 这种差异可能意味着当在肺部来源的DC上提呈时，大多数自然刺激对 刺激记忆性T细胞无效。
可将这些发现扩展到肺部来源的DC之外的DC,通过与皮肤来源的
30DC的肽提呈相比较，可再现该发现(图3e)。此外，尽管淋巴居住的DC 刺激初始和记忆性细胞的程度相同，但是皮肤来源的DC (由真皮的DC 和Langerhans细胞的混合物组成)刺激记忆性T细胞的有效程度要少10 倍。
实施例2:
既然已经确定组织来源的DC (来自肺部或皮肤)刺激初始T细胞可 比记忆性T细胞更有效，于是我们提出，当存在大量竞争性记忆性细胞 时，它们是否可引发初始应答。如果，例如来源于交叉-反应感染的预先 存在的记忆性群没有特别的保护性，则这种情形可能是有利的。通过以 下方法对此进行检验，艮卩，注射少量(5xl0"的初始gBT-IT细胞(应答群)， 并在滴定量的记忆性gBT-I细胞(竞争子群)存在下检验它们在应答 WSN-gB感染过程中的体内扩增(图4a-图4d)。肺部感染WSN-gB之后， 在初始竞争子和初始应答子CD8+T细胞之间(图4a)、初始竞争子和记忆 性应答子CD8+T细胞之间存在竞争(图4b)，但在记忆性竞争子和初始应 答子CD8+T细胞之间不存在竞争(图4c)。在静脉内感染WSN-gB之后， 在记忆性竞争子和初始应答子CD8+T细胞之间可观察到竞争，其中，没 有组织来源的DC提呈抗原。在这些实验中，滴定量的初始或记忆性CD8+ T细胞(竞争子)连同5><104初始或记忆性应答子CD8+ T细胞一起过继转 移到初始宿主中。使小鼠鼻内感染(图4a-图4c) WSN-gB并在10天后分 析它们的组织，或者使它们静脉内感染(图4d)并在8天后分析，通过流 式细胞法分析在感染过程中产生的gB特异性CD8+应答子细胞的数量。 所示数据显示了各个实验的结果，每个实验点至少两个小鼠。
通过Ly5同种异型标记来鉴定应答群，并在第8-10天估算在应答感 染过程中产生的细胞数量。作为对照，我们首先显示了初始T细胞与其 他初始T细胞的激烈竞争(图4a)。作为第二对照，我们显示了初始T细 胞与记忆性T细胞应答群更为激烈的竞争，避免它们过量时还扩增(图 4b)。这正是所期望的，因为记忆性T细胞应该只能识别DC上的抗原， 该DC还可提呈抗原到初始T细胞，即淋巴居住的DC。然而，重要的是， 当我们对数量增加的记忆性T细胞与初始应答群的竞争能力进行比较时，发现记忆性T细胞尽管明显存在，但是它们却不能竞争(图4c)。
为支持此观点，S卩，这是因为迁移的DC提呈病毒性抗原到初始T细胞而不是记忆性T细胞，我们检验了迁移的DC不参与情况下的竞争。静脉内病毒性感染导致了只淋巴居住的CD8+DC进行提呈，同等程度地刺激了记忆性和初始T细胞(图3)。与肺部感染对比(图4c)，当小鼠静脉内感染WSN-gB时(图4d)，数量增加的记忆性T细胞能避免初始应答。总之，这些数据说明，当存在竞争性记忆性细胞时，迁移的DC对初始T细胞刺激至关重要。这就解释了为何尽管存在对肺部感染流感病毒的已形成的记忆，仍可检测到初始T细胞应答。
为了使用真正的(而不是转基因的)T细胞验证这些发现，我们从感染HKx31流感病毒至少12周后的B6丄y5.1小鼠分离CD44hiCD62Lhi中枢记忆性T细胞，并且通过过继转移到B6小鼠，将它们用作竞争子。随后使这些小鼠鼻内(图6e)或静脉内(图6f)感染流感病毒，然后我们通过对病毒性NP和PA特异性的内源性的和转移的细胞来检验应答。与使用转基因T细胞的研究一致的是，研究显示出记忆性CD8 T细胞在静脉内感染后避免了初始内源性T细胞对流感病毒的应答，但在肺部感染后却不如此。总之，这些数据说明，当存在竞争性记忆性细胞时，组织来源的DC为初始T细胞刺激提供了优先途径。
这些数据提供了其他重要结论。初始008+ T细胞显示出比记忆性CD8+ T细胞对组织来源的DC的刺激更敏感，而与初始T细胞应答淋巴居住的DC的程度相同(图3)。这就质疑了长久以来的观点，即记忆性T细胞的共刺激需求比初始T细胞少，至少是在组织来源的DC被用作抗原提呈细胞时。虽然我们排除了在表达包括B7-H1、 B7-H2、 B7-DC、 B7-RP、B7-l、 B7-2和BTLA-4在内的各种共刺激分子上的明显差异，但是仍不清楚是如何在分子水平上实现这一点(图4)。基于DC亚群在其使用CD70中的差异，我们检验了该分子在我们研究中的作用。有趣的是，淋巴居住的CD8ot DC诱导的应答对初始和记忆性T细胞来说均取决于CD70，而肺部来源的DC对初始T细胞的刺激不取决于CD70 (图5)。这暗示了肺部来源的DC使用了可供选择的但仍未确定的共刺激分子来有效地刺激初始T细胞，但是该信号不能有效地刺激记忆性T细胞。实施例3:
体内和体外来源的记忆性T细胞的应答与内源性记忆性T细胞相似(图7)。在鼻内感染400 PFU WSN-gB 3天后，从小鼠的纵膈1^分离008+DC、 CD11K DC^BCDllb+ DC。在通过流式细胞法分析之前，将纯化的DC与对gB特异性的gBT-I CD8+ 0 8￡-标记的初始或记忆性转基因〔08+T细胞共培养60h。通过3种不同方法来产生记忆性T细胞。简言之，(第二排)将初始§8丁-1细胞转移到鼻内感染\^^88的1^￡1-/-小鼠体内，8~10周后，收集它们的脾脏，纯化记忆性gBT-ICD8+T细胞。第三排，如以上方法所述，通过体外肽抗原刺激和使用重组人IL-15维持，来制备记忆性gBT-I细胞。下排，使B6小鼠鼻内感染WSN-gB， 8~10周后，纯化内源性非转基因008+ T细胞。
结果如图7所示。矩形图是具有相似结果的2个实验，显示了T细胞群的增殖(1/3是孔收集的)。每个图的增殖细胞的百分比和数量(括号)也被示出。
我们的发现暗示了，因为记忆性T细胞应答迁移的DC的能力削弱，所以它们高度取决于淋巴居住的DC的提呈。当可用的是针对早期病毒而产生的弱交叉-反应性和无效的记忆性T细胞时，这种不同的应答可能很重要。因为能抵抗感染的初始T细胞也有机会受到刺激，所以我们这里描述的机制提供了一种使支配性而不是无效的记忆性T细胞竞争的方法。交联-反应性对于两种不同类的病原体来说可能很少见，但是对于能使T细胞表位变异的病毒来说可能是常见的，如流感病毒(Voeten, J.T.等人，J. Virol. 74:6800-07, 2000)、 HIV (Phillips, R.E.等人，Nature 354:453-9,1991)和丙型肝炎病毒(Weiner, A.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.92:2755-9, 1995)，虽然这两种情形均已有文献记载。
我们研究的重点在于记忆性和初始CD8+ T细胞与DC亚群相互作用的方式上的差异，从而提供了对照性证据，即，初始T细胞的活化需求可能比记忆性T细胞少。这些发现不仅证明了进一步详细研究个体DC亚群确切功能的必要性，而且为疫苗发展的新策略提供了见解。很明显，
在初免-加强策略中，使加强抗原靶向淋巴居住的DC会很有益处。
权利要求
1. 一种用于产生对抗原的免疫应答的免疫原性组合物，所述组合物包括抗原和对淋巴居住的树突状细胞特异性的靶向部分。
2. 如权利要求l所述的免疫原性组合物，其中所述抗原是病毒性抗原、癌或肿瘤抗原、或来自病毒、细菌、真菌或其他来源的任何病原体 的抗原。
3. 如权利要求l所述的免疫原性组合物，其中所述抗原是病毒、来 源于病毒的病毒性肽、蛋白、多肽或其片段。
4. 如权利要求3所述的免疫原性组合物，其中所述病毒选自流感病 毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、衣原体、腺病毒科病毒、哺乳动物腺病毒、 禽腺病毒、疱疹病毒科病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、 单纯疱疹病毒5型、单纯疱疹病毒6型、光滑噬菌体科病毒、光滑噬菌 体病毒、肠杆菌噬菌体MS2、 allolevirus、痘病毒科病毒、脊椎动物痘病 毒、副痘病毒、禽痘病毒、山羊痘病毒、兔痘病毒、猪痘病毒、软疣痘 病毒、昆虫痘病毒、乳多空病毒科病毒、多瘤病毒、乳头瘤病毒、副粘 病毒科病毒、禽副粘病毒、副流感病毒1型、麻疹病毒属病毒、麻疹病 毒、腮腺炎病毒属病毒、腮腺炎病毒、肺病毒亚科病毒、肺病毒属病毒、 偏肺病毒属病毒、鸡肺炎病毒、人偏肺病毒属病毒、小RNA病毒科病毒、 肠道病毒、鼻病毒、肝病毒属病毒、人甲肝病毒、心病毒属病毒、鹅口 疮病毒属病毒、呼肠孤病毒科病毒、正呼肠孤病毒属病毒、环状病毒属 病毒、轮状病毒、质型多角体病毒属病毒、斐济病毒属病毒、植物呼肠 孤病毒属病毒、水稻病毒属病毒、逆转录病毒科病毒、哺乳动物B型逆 转录病毒、哺乳动物C型逆转录病毒、禽C型逆转录病毒、D型逆转录 病毒组、BLV-HTLV逆转录病毒、慢病毒、人类免疫缺陷病毒l型、人 类免疫缺陷病毒2型、泡沫病毒属病毒、黄病毒科病毒、丙型肝炎病毒、 肝病毒科病毒、乙型肝炎病毒、披膜病毒科病毒、甲病毒属病毒、辛德 毕斯病毒、风疹病毒属病毒、风疹病毒、弹状病毒科病毒、水疱病毒属病毒、狂犬病毒属病毒、短暂热病毒属病毒、质型弹状病毒属病毒、核 型弹状病毒属病毒、沙粒病毒科病毒、沙状病毒属病毒、淋巴细胞性脉 络丛脑膜炎病毒、爱皮病毒、拉沙热病毒、冠状病毒科病毒、冠状病毒 属病毒和曲状病毒属病毒。
5. 如权利要求3所述的免疫原性组合物，其中所述病毒性肽、蛋白、 多肽或其片段选自流感病毒神经氨糖酸苷酶、流感病毒红血球凝集素、 呼吸道合胞体病毒(RSV)-病毒性蛋白、RSVF糖蛋白、RSVG糖蛋白、 单纯疱疹病毒(HSV)病毒性蛋白、单纯疱疹病毒糖蛋白gB、 gC、 gD和 gE、以及衣原体MOMP和PorB抗原。
6. 如权利要求l所述的免疫原性组合物，其中所述抗原是传染性致 病剂，选自流感病毒红血球凝集素、人呼吸道合胞体病毒G糖蛋白、登 革病毒的核心蛋白、基质蛋白或其他蛋白、麻疹病毒红血球凝集素、单 纯疱疹病毒2型糖蛋白gB、脊髓灰质炎病毒I型VP1、 HIV I型包膜糖 蛋白、乙型肝炎表面抗原、白喉毒素、链球菌24M表位、淋球菌菌毛蛋 白、伪狂犬病病毒g50 (gpD)、伪狂犬病病毒II型(gpB)、伪狂犬病病毒 gIII (gpC)、伪狂犬病病毒糖蛋白H、伪狂犬病病毒糖蛋白E、传染性胃 肠炎糖蛋白195、传染性胃肠炎基质蛋白、猪轮状病毒糖蛋白38、猪小 病毒衣壳蛋白、蛇形螺旋体保护性抗原、牛病毒性腹泻糖蛋白55、新城 疫病毒红血球凝集素-神经氨糖酸苷酶、猪流感红血球凝集素、猪流感神 经氨糖酸苷酶、口蹄疫病毒、猪霍乱病毒、猪流感病毒、非洲猪瘟病毒、 Liyopneutiioniae支原体、牛传染性鼻气管炎病毒、牛传染性鼻气管炎病 毒糖蛋白E、糖蛋白G、传染性喉气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒糖 蛋白G或糖蛋白I、克罗斯病毒糖蛋白、初生犊牛腹泻病毒、委内瑞拉 马传染性脑脊髓炎病毒、庞塔托鲁病毒、小鼠白血病病毒、小鼠乳腺肿 瘤病毒、乙型肝炎病毒核心蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原或其片段或其 衍生物、马流感病毒或马疱疹病毒抗原，包括马流感病毒A型/Alaska91 神经氨糖酸苷酶、马流感病毒A型/Miami63神经氨糖酸苷酶、马流感病 毒A型/Kentucky 81神经氨糖酸苷酶、马疱疹病毒1型糖蛋白B和马疱 疹病毒1型糖蛋白D，牛呼吸道合胞体病毒或牛副流感病毒抗原、牛呼吸道合胞体病毒附着蛋白(BRSV G)、牛呼吸道合胞体病毒融合蛋白 (BRSV F)、牛呼吸道合胞体病毒核衣壳蛋白(BRSVN)、牛副流感病毒3 型融合蛋白、牛副流感病毒3型红血球凝集素神经氨糖酸苷酶、牛病毒 性腹泻病毒糖蛋白48和糖蛋白53。
7. 如权利要求l所述的免疫原性组合物，其中所述抗原是癌抗原或 肿瘤抗原。
8. 如权利要求7所述的免疫原性组合物，其中所述癌或肿瘤抗原选 自KSl/4泛-癌抗原、卵巢癌抗原(CA125)、前列腺酸性磷酸盐、前列腺 特异性抗原、黑色素瘤相关的抗原p97、黑色素瘤抗原gp75、高分子量 黑色素瘤抗原(HMW-MAA)、前列腺特异性膜抗原、肿瘤胚抗原(CEA)、 多态性上皮粘蛋白抗原、人乳脂肪球蛋白抗原、结直肠肿瘤相关的抗原、 CEA、 TAG-72、 LEA、 Burkitt的淋巴瘤抗原-38.13、 CD19、人B-淋巴瘤 抗原-CD20、 CD33、黑色素瘤特异性抗原、神经节苷脂GD2、神经节苷 脂GD3、神经节苷脂GM2、神经节苷脂GM3、肿瘤特异性移植型细胞-表面抗原(TSTA)、病毒诱导的肿瘤抗原、T-抗原DNA肿瘤病毒、RNA 肿瘤病毒的外被抗原、肿瘤胚抗原-a-胎蛋白、结肠CEA、膀胱肿瘤胚抗 原、分化抗原、人肺癌抗原L6、 L20、纤维肉瘤抗原、人白血病T细胞 抗原-Gp37、拟糖蛋白、神经鞘脂类、乳腺癌抗原、EGFR(上皮细胞生长 因子受体)、HER2抗原(pl85HER2)、多态性上皮粘蛋白(PEM)、恶性人淋 巴细胞抗原-APO-l、分化抗原，包括胎儿性红血球，原内胚层中发现的 I类抗原、成人性红血球、植入前胚胎中发现的I类抗原、胃腺癌中发现 的I(Ma)、乳腺上皮中发现的M18、 M39、骨髓细胞中发现的SSEA-1、 结直肠癌中发现的VEP8、 VEP9、 Myl、 VIM-D5、 Du56-22、 TRA-1-85 (血 型H)、结肠腺癌中发现的C14、肺腺癌中发现的F3、胃癌中发现的AH6、 Y半抗原、胚胎性癌细胞中发现的LeY、 TL5 (血型A)、 A431细胞中发 现的EGF受体、胰腺癌中发现的E1系列(血型B)、胚胎性癌细胞中发现 的FC10.2、胃腺癌抗原、腺癌中发现的CO-514(血型Lea)、腺癌中发现 的NS-IO、 CO-43 (血型Leb)、 A431细胞的EGF受体中发现的G49、结 肠腺癌中发现的MH2(血型ALeb/Ley)、结肠癌中发现的19.9、胃癌粘蛋白、骨髓细胞中发现的TsA7、黑色素瘤中发现的R24、胚胎性癌细胞中 发现的4.2、 GD3、 Dl.l、 OFA-l、 GM2、 OFA-2、 GD2禾QM1: 22: 25: 8、以及4~8细胞阶段胚胎中发现的SSEA-3和SSEA-4。
9. 如权利要求3所述的免疫原性组合物，其包括重组或嵌合病毒。
10. 如权利要求9所述的免疫原性组合物，其中所述病毒包括活的 重组病毒性抗原或灭活的重组病毒性抗原。
11. 如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述抗原包括来自 葡萄球菌肠毒素B、肉毒杆菌毒素、炭疽热保护性抗原和鼠疫耶尔森氏 菌的一种以上的抗原。
12. 如权利要求3所述的免疫原性组合物，其包括来自一种病毒菌 株或来自多种菌株的抗原。
13. 如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述抗原包括流感 病毒抗原。
14. 如权利要求13所述的免疫原性组合物，其中所述抗原是含有嵌 入神经氨酸酶茎部的HSV的gB^'^Kb-限制性表位的重组流感WSN-gB (H1N1)，或含有来自甲型流感/Texas/36/91 (NINI)、甲型流感/Beijing/32/92 (H3N2)和乙型流感/Panama, 45/90病毒的HA。
15. 如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述抗原是HSV (SSIEFARL)的gB498-5()5 &-限制性表位。
16. 如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述靶向部分选自 Sca-l、 Sca-2、 CDldl、 CD36、 CD52、 CD8a、 Gprl05、 G-蛋白偶联受体 超家族成员、Micl和其他C型外源凝集素和C型外源凝集素样分子、 Igsf4、 Treml4和Ig超家族的其他成员以及含有Ig结构域的分子、necl2、Pslcl、 synCaM禾卩sglgsf。
17. —种加强疫苗，其含有如权利要求1~16中任一项所述的免疫原 性组合物。
18. —种试剂盒，其包括第一疫苗和加强疫苗，所述加强疫苗含有 如权利要求1~16中任一项所述的免疫原性组合物。
19. 一种诱导个体中免疫应答的方法，包括给予所述个体如权利要 求17所述的加强疫苗。
20. 如权利要求19所述的方法，其中所述免疫应答包括杀伤T细胞 应答。
21. 含有抗原的免疫原性组合物中对淋巴居住的树突状细胞特异性 的靶向部分的用途，所述用途用于提高含有所述免疫原性组合物的加强 接种的效率，从而与只使用所述抗原相比在加强接种中产生再次免疫应答。
22. —种用于产生对抗原的免疫应答的免疫原性组合物，所述组合 物包括抗原和对组织来源的树突状细胞特异性的靶向部分。
23. 如权利要求22所述的免疫原性组合物，其中对组织来源的树突 状细胞特异性的靶向部分选自Langerin、 CDllb、 Flrt3、干扰素诱导的跨 膜蛋白1、 G蛋白偶联受体和趋化因子(C-X-C基元)受体4。
24. —种疫苗，其含有如权利要求22或23所述的免疫原性组合物。
全文摘要
本发明涉及一种用于产生对抗原的免疫应答的免疫原性组合物，该组合物包括抗原和对淋巴居住的树突状细胞特异性的靶向部分。本发明还提供该免疫原性组合物在疫苗中的应用和使用该组合物加强免疫应答的方法。另一方面，本发明还涉及用于产生对抗原的免疫应答的免疫原性组合物，该组合物包括抗原和对组织来源的树突状细胞特异性的靶向部分，还涉及含有所述组合物的疫苗。
文档编号A61K39/395GK101489589SQ200780026608
公开日2009年7月22日 申请日期2007年5月18日 优先权日2006年5月19日
发明者加布里埃勒·特雷泽·贝尔兹, 威廉·罗斯·希思 申请人:沃尔特及伊莱萨霍尔医学研究院