免疫原性组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包含来自艰难梭菌的毒素A和/或毒素B的片段的融合蛋白，具体而言，本发明涉及包含第一片段和第二片段的蛋白，其中(v)所述第一片段是毒素A重复结构域片段；(vi)所述第二片段是毒素B重复结构域片段；(vii)所述第一片段具有第一近端；(viii)所述第二片段具有第二近端；并且其中所述第一片段和所述第二片段彼此邻近，并且其中所述多肽诱导中和毒素A或毒素B或两者的抗体。本发明还涉及包含SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33或SEQIDNO:34或SEQIDNO:35的片段或变体的组合物。
【专利说明】免疫原性组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及来自艰难梭菌iflostridium difficile)的抗原。具体而言,本发明涉及包含毒素A和/或毒素B的片段的重组蛋白抗原。本发明还涉及包含这些抗原的免疫原性组合物或疫苗，以及本发明的疫苗和免疫原性组合物在预防或治疗中的用途。本发明还涉及使用本发明的组合物的免疫方法，以及本发明的组合物在药物制造中的用途。
[0002]背景
艰难梭菌是医院肠道感染的最重要原因并且是人中假膜性结肠炎的主要原因(Bartlett 等人，J?.J.Clin.Nutr.11 suppl:2521-6 (1980))。感染艰难梭菌的个体的总体相关死亡率在诊断的3个月内计算为5.99%,并且更闻的死亡率与闻龄相关，在超过80岁的患者中为 13.5% (karas 等Jk，Journal of Infection 561:1-9 (2010))。目前对艰难梭菌感染的治疗是施用抗生素(甲硝唑和万古霉素)，然而，已经存在对这些抗生素具有抗性的菌株的证据(Shah 等人，Expert Rev.Anti Infect.Ther.8 (5) 555-564 (2010))。因此，存在对能够诱导针对艰难梭菌的抗体和/或保护性免疫应答的免疫原性组合物的需求。
[0003]发明简述
艰难梭菌的肠毒性主要由于毒素A和毒素B两种毒素的作用。这些均是有效的细胞毒素(Lyerly 等人,Current Microbiology 21:29-32 (1990)。毒素 A和毒素B 的 C末端结构域包含重复单位，例如毒素A的C末端由连续的重复单位构成(Dove等)K,Infect.1mmun.58:480-499 (1990))，由于这一原因，C末端结构域也可以称为“重复结构域”。如Ho等人在(PNAS 102:18373-18378 (2005))中描述，这些重复部分可以进一步分为短重复(SRs)和长重复(LRs)。`
[0004]已经确定了毒素A重复结构域的C末端的127-aa片段的结构(Ho等人，PNAS102:18373-18378 (2005))。该片段形成螺线管类折叠，主要由β链和低比例的α螺旋构成。
[0005]已经表明毒素A具体为C末端结构域的片段能够导致在仓鼠中的保护性免疫应答(Lyerly 等人，Current Microbiology 21:29-32 (1990))、W096/12802 和 W000/61762。
[0006]已知设计在表达过程中能够正确折叠的融合蛋白是困难的。本发明的多肽是融合蛋白，其中，保持天然β_螺线管类结构，并且发现其能够在小鼠中提供针对毒素A和毒素B 二者的免疫应答。
[0007]在本发明的第一个方面，提供包含第一片段和第二片段的多肽，其中 (i)所述第一片段是毒素A重复结构域片段；
(?)所述第二片段是毒素B重复结构域片段；
(iii)所述第一片段具有第一近端；
(iv)所述第二片段具有第二近端；并且 多肽诱导中和毒素A或毒素B或两者的抗体。
[0008]在本发明的第二个方面，提供多肽，其包括:
【权利要求】
1.一种多肽，其包含第一片段和第二片段，其中 (i)所述第一片段是毒素A重复结构域片段； (?)所述第二片段是毒素B重复结构域片段； (iii)所述第一片段具有第一近端； (iv)所述第二片段具有第二近端；并且 其中所述第一片段和所述第二片段彼此邻近，并且其中所述多肽诱导中和毒素A或毒素B或两者的抗体。
2.权利要求1的多肽，其中所述多肽在哺乳动物宿主中诱导针对艰难梭菌菌株的保护性免疫应答。
3.权利要求1-2中任一项的多肽，其中所述第一片段和/或所述第二片段包含少于25%、20%、18%或15%的α螺旋结构。
4.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述第一片段和/或所述第二片段包含多于25%、30%、35%、38% 或 40% 的 β 折叠结构。
5.前述权利要求 中任一项的多肽，其中所述第一近端在短重复内。
6.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述第二近端在短重复内。
7.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述第一近端不破坏短重复-长重复-短重复部分。
8.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述第二近端不破坏短重复-长重复-短重复部分。
9.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述第一近端和所述第二近端不破坏短重复-长重复-短重复部分。
10.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述第一近端不在毒素A的氨基酸1878-1940、2012-2074、2146-2208、2258-2322、2394-2456、2507-2569 或 2598-2660 内。
11.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述第二近端不在毒素B的氨基酸1881-1942、2012-2074、2144-2208 或 2278-2339 内。
12.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述第一片段包含至少100、250、400或450个氨基酸。
13.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述第二片段包含至少100、200、300或400个氨基酸。
14.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VIII(氨基酸 2645-2710)内。
15.权利要求1-14中任一项的多肽，其中所述第一近端在毒素A的氨基酸2700-2710或 2680-2690 内。
16.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述第二近端在毒素B的重复部分I(氨基酸1834-1926)内。
17.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述第二近端在氨基酸1860-1878、1854-1876 内。
18.权利要求1-15中任一项的多肽，其中所述第二近端在毒素B的重复部分II(氨基酸 1927-2057)内。
19.权利要求1-15或18中任一项的多肽，其中所述第二近端在毒素B的氨基酸1960-1970、1988-1998 或 1867-1877 内。
20.权利要求1-13和16-19中任一项的多肽，其中所述第一片段由整个毒素A重复结构域(氨基酸1832-2710)组成。
21.权利要求1-15和20中任一项的多肽，其中所述第二片段由整个毒素B重复结构域(氨基酸1833-2366)组成。
22.权利要求14、15、16或17中任一项的多肽，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VIII (氨基酸2645-2710)内，并且其中所述第二近端在毒素B的重复部分I (氨基酸1834-1926)内。
23.权利要求14、15、18或19中任一项的多肽，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VIII (氨基酸2645-2710)内，并且其中所述第二近端在毒素B的重复部分II (氨基酸1927-2057)内。
24.权利要求14、15、18或19中任一项的多肽，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VIII的短重复3 (氨基酸2687-2710)内，并且所述第二近端在毒素B的重复部分II的短重复4 (氨基酸1988-2007)内。
25.权利要求14、15、18或19中任一项的多肽，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VIII的短重复2 (氨基酸2665-2686)内，并且所述第二近端在毒素B的重复部分II的短重复3 (氨基酸1968-1987)内。
26.权利要求14、15、16或17中任一项的多肽，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VIII的短重复2 (氨基酸2665-2686)内，并且所述第二近端在毒素B的重复部分I的短重复3 (氨基酸1877-1896)内。
27.权利要求1-13、14、15、16、17和22中任一项的多肽，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VIII的短重复3 (氨基酸2645-2686)内，并且所述第二近端在毒素B的重复部分I的短重复I (氨基酸1834-1854)内。
28.权利要求14、15、18或19中任一项的多肽，其中所述第一近端在毒素A的重复部分VIII的短重复3 (氨基酸2687-2710)内，并且所述第二近端在毒素B的重复部分II的短重复4 (氨基酸1988-2007)内。
29.权利要求23的多肽，其中所述第一近端在毒素A的氨基酸2700-2710内，并且所述第二近端在毒素B的氨基酸1960-1970内。
30.权利要求23的多肽，其中所述第一近端在毒素A的氨基酸2680-2690内，并且所述第二近端在毒素B的氨基酸1960-1970内。
31.权利要求23的多肽，其中所述第一近端在毒素A的氨基酸2700-2710内，并且所述第二近端在毒素B的氨基酸1988-1998内。
32.权利要求23的多肽，其中所述第一近端在氨基酸2680-2690内，并且所述第二近端在氨基酸1860-1878内。
33. 前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽还包含接头。
34.权利要求33的多肽，其中所述接头包含1-19个之间的氨基酸。
35.权利要求33-34中任一项的多肽，其中所述接头是甘氨酸接头。
36.权利要求33-35中任一项的多肽，其中所述接头在所述第一片段的近端和所述第二片段的近端之间。
37.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽是更大的融合蛋白的一部分。
38.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽包含SEQID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:23,SEQ ID N0:25 或 SEQ ID N0:27 的免疫原性片段。
39.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽包含SEQID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:23,SEQ ID N0:25 或 SEQ ID N0:27 的至少500、600、700、750、800、850或900个氨基酸的免疫原性片段。
40.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽包含SEQID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQID NO:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:25 或 SEQ ID NO:27 的变体。
41.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽包含多于450、475、500、525、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825 或 850 个来自毒素 A 的氨基酸。
42.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽包含少于850、825、800、775、750、725、700、675、650、625或600个来自毒素A的氨基酸。
43.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽包含多于350、375、400、425、450、475、500或525个来自毒素B的氨基酸。
44.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述多肽包含少于525、500、475或450个来自毒素B的氨基酸。
45.一种多肽，其包含:
(i)SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33 或 SEQ ID NO:34 或SEQ ID NO:35 ；
(ii)与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34或SEQ ID NO: 35具有至少90%、95%、98%、99%或100%相似性的变体;或
(iii)SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:28、SEQID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33 或 SEQ ID NO:34 或SEQ ID NO:35 的至少 250、280、300、350、380、400、430、450、480、500、530、550、580或600个氨基酸的片段。
46.权利要求45的多肽，其中所述多肽包含多于450、475、500、525、575、600、625、650、.675、700、725、750、775、800、825 或 850 个来自毒素 A 的氨基酸。
47.权利要求45或46的多肽，其中所述多肽包含少于850、825、800、775、750、725、.700、675、650、625或600个来自毒素A的氨基酸。
48.权利要求45-47中任一项的多肽，其中所述多肽包含多于350、375、400、425、450、.475、500或525个来自毒素B的氨基酸。
49.权利要求45-48中任一项的多肽，其中所述多肽包含少于525、500、475或450个来自毒素B的氨基酸。
50.权利要求45-49中任一项的多肽，其中所述多肽诱导中和毒素A或毒素B或两者的抗体。
51.权利要求45-50中任一项的多肽，其中所述多肽在哺乳动物宿主中诱导针对艰难梭菌菌株的保护性免疫应答。
52.权利要求45-51中任一项的多肽，其中所述多肽包含少于25%、20%、18%或15%的α螺旋结构。
53.权利要求45-52中任一项的多肽，其中所述多肽包含多于25%、30%、35%、38%或40%的β折叠结构。
54.—种多核苷酸,其编码权利要求1-53中任一项的多肽。
55.—种载体，其包含与诱导型启动子连接的权利要求54的多核苷酸。
56.权利要求47的载体，其中通过加入足量的IPTG激活所述诱导型启动子。
57.—种 宿主细胞,其包含权利要求54或55的载体或权利要求46的多核苷酸。
58.权利要求57的宿主细胞，其中所述宿主细胞是革兰氏阴性细菌。
59.权利要求57的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
60.—种免疫原性组合物，其包含权利要求1-45中任一项的多肽和药学上可接受的赋形剂。
61.权利要求60的免疫原性组合物，其还包含佐剂。
62.权利要求60-61中任一项的免疫原性组合物，其还包含额外抗原。
63.权利要求62的免疫原性组合物，其中所述额外抗原是来源于选自以下的细菌的抗原:肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、大肠杆菌、卡他莫拉氏菌、破伤风、白喉、百日咳、表皮葡萄球菌、肠球菌和金黄色葡萄球菌。
64.一种疫苗，其包含权利要求60-63中任一项的免疫原性组合物。
65.权利要求60-63中任一项的免疫原性组合物或权利要求64的疫苗在治疗或预防艰难梭菌疾病中的用途。
66.权利要求60-63中任一项的免疫原性组合物或权利要求64的疫苗,其用于治疗或预防艰难梭菌疾病。
67.权利要求60-63中任一项的免疫原性组合物或权利要求64的疫苗在制备用于预防或治疗艰难梭菌疾病的药物中的用途。
预防或治疗艰难梭菌疾病的方法，其包括向患者施用权利要求60-63的免疫原性组合物或权利要求64的疫苗。
【文档编号】C12N15/62GK103717742SQ201280037472
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2012年5月25日 优先权日:2011年5月27日
【发明者】C.卡斯塔多 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司