改进的杆状病毒表达系统的制作方法

改进的杆状病毒表达系统的制作方法【专利摘要】本发明涉及优化的杆状病毒构建物，其可用于生产病毒（样）粒子或病毒载体，特别是用于基因治疗的病毒载体。【专利说明】改进的杆状病毒表达系统[0001]本发明涉及优化的杆状病毒构建物，其可用于生产病毒(样)粒子或病毒载体，特别是用于基因治疗的病毒载体。【
背景技术：
】[0002]杆状病毒表达载体系统(BEV)被用于在昆虫细胞中生产高水平的重组蛋白。它一般是基于杆状病毒多角体蛋白基因(Polh)的缺失，所述基因被待表达的基因替换，所述待表达的基因在Polh启动子的控制下。将细菌复制原点、抗生素抗性基因和受体Tn7重组位点整合到杆状病毒基因组中(即杆粒)极大地改进了这种系统，使其能够快得多地产生重组病毒(Luckow等，1993)。大多数可商购的杆状病毒载体缺少polh基因并除此之外具有完整的基因组，但是OxfordExpressionbTechnologies公司以商品名fIashBACGOLD发售几丁质酶基因和组织蛋白酶基因阴性的杆状病毒载体。因此，预期这种表达系统可以进行改进。已显示，从AcMNPV基因组缺失几丁质酶基因和组织蛋白酶基因对细胞内和分泌的重组蛋白的稳定性具有积极的影响(Kaba等,2004)。还已显示,几丁质酶、组织蛋白酶、p26、pl0和P74缺陷的BEV允许生产与使用非缺失病毒获得的重组蛋白相比更高水平的重组蛋白(Hitchman等，2009)。然而，在这后一项研究中获得的表达数据仅涉及单一重组蛋白。为了生产复杂的结构例如病毒载体和病毒样粒子，必需生产一种或多种蛋白，并且在病毒载体的情况下，还必需生产病毒基因组。根据Hitchman等的结果，没有证据表明当几丁质酶基因、组织蛋白酶基因、p26基因、plO基因和p74基因缺失时，可以在蛋白质质量方面改善这样的复杂结构的生产。[0003]本研究的目的是提供用于生产病毒载体和/或病毒样粒子的优化的杆状病毒表达系统。【
发明内容】[0004]本发明的一个方面涉及一种重组杆状病毒基因组，其包含p26和p74杆状病毒基因的0RF，同时杆状病毒的组织蛋白酶基因、几丁质酶基因和plO基因被破坏。在一种优选实施方式中，PlO基因被破坏而没有缺失plO启动子。在另一种实施方式中，重组杆状病毒基因组包含一个或多个异源目的序列。[0005]本发明的另一方面涉及一种重组杆状病毒基因组，其中杆状病毒的组织蛋白酶基因、几丁质酶基因、P26基因、p74基因和plO基因被破坏，并且其中所述重组杆状病毒基因组包含编码病毒载体或病毒样粒子的一部分的异源序列。[0006]在另一方面，本发明提供了一种重组杆状病毒，其包含如上所述的重组杆状病毒基因组。[0007]在另一方面，本发明提供了一种用于生产重组杆状病毒的方法，所述方法包括将含有本发明的重组杆状病毒基因组的原核细胞在允许生产杆状病毒的条件下进行培养。[0008]在另一方面，提供了包含本发明的重组杆状病毒基因组的宿主细胞。[0009]另一方面提供了一种用于生产重组蛋白或核酸(例如RNA或DNA分子或重组基因组，所述重组基因组是例如RNA或DNA基因组)的方法，所述方法包括将带有一种或数种本发明的重组杆状病毒的宿主细胞进行培养的步骤，其中异源目的序列编码重组蛋白或核酸。[0010]在另一方面,本发明提供了一种用于生产病毒载体或病毒样粒子的方法,所述方法包括将带有一种或数种重组杆状病毒的宿主细胞进行培养的步骤，每种所述重组杆状病毒包含带有可用于生产所述病毒载体或病毒样粒子的异源目的序列的重组杆状病毒基因组，其中所有重组杆状病毒包含具有完整的P26和P74杆状病毒基因的ORF的重组杆状病毒基因组，其中杆状病毒的组织蛋白酶基因、几丁质酶基因和PlO基因的ORF被破坏，并且其中plO基因的启动子未被破坏。[0011]在另一方面，本发明提供了一种用于生产病毒载体或病毒样粒子的方法，所述方法包括将带有一种或数种重组杆状病毒的宿主细胞进行培养的步骤，每种所述重组杆状病毒包含带有可用于生产所述病毒载体或病毒样粒子的异源目的序列的重组杆状病毒基因组，[0012]其中所有重组杆状病毒包含其中杆状病毒的组织蛋白酶基因、几丁质酶基因、p26基因、p74基因和plO基因被破坏的重组杆状病毒基因组。[0013]在一种实施方式中,执行上述方法来生产重组AAV载体。[0014]本发明涉及优化的重组杆状病毒基因组及其使用方法。令人吃惊地发现，组织蛋白酶基因、几丁质酶基因和plO基因的破坏不提闻昆虫细胞中广生的重组AAVCrAAV)粒子的水平，但允许产生对哺乳动物细胞具有提高的感染性的rAAV粒子。这一结果是非常出人意料的，因为Hitchman等(同上)报道了从组织蛋白酶_、几丁质酶-、p26_、pl0_和p74_缺失的杆状病毒产生的单个重组蛋白具有更高的表达水平，尽管这一研究没有报道病毒载体的产生。本文所示的结果具体表明，使用上述杆状病毒基因被破坏的杆状病毒，没有提高编码VP1、VP2和VP3的AAVcap基因的表达水`平(该结果不同于从Hitchman等的公开内容所预期的结果)。相反，VPl和VP2的降解水平降低，并且使用这种缺失杆状病毒产生的rAAV粒子与从野生型杆状病毒生产系统杆粒(即没有对几丁质酶、组织蛋白酶、p26、plO和/或P74基因座进行修饰)产生的rAAV粒子相比，显示出感染性提高4倍。[0015]本发明的重组杆状病毒基因组优先能够在昆虫细胞中和原核细胞例如大肠杆菌(E.coli)中进行复制。具体来说，可以使用含有BAC复制子的任何病毒杆状病毒基因组。在特定实施方式中，重组杆状病毒基因组是杆粒。适合的杆状病毒序列包括苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)(Ac)MNPV杆粒。[0016]杆状病毒常用于感染昆虫细胞以表达重组蛋白。具体来说，可以按例如下述文献中所描述的来实现异源基因在昆虫中的表达:u.S.4，745，051；Friesen等，1986；EP127,839；EP155,476；Vlak等，1988;Miller等，1988;Carbonell等，1988;Maeda等，1985；Lebacq-Verheyden等，1988；Smith等，1985；Miyajima等，1987;和Martin等，1988。Luckow等，1988；Miller等，1986；Maeda等，1985；McKenna,1989；vanOers,2011和Lynn,2007中描述了可用于蛋白质生产的多种杆状病毒株和变体以及相应的许可性昆虫宿主细胞。[0017]根据本发明，可以使用源自于常用于蛋白质和生物药品的重组表达的杆状病毒的任何杆状病毒基因组。例如，杆状病毒基因组可以源自于例如AcMNPV、家蚕(Bombyxmori)(Bm)NPV、棉铃虫(Helicoverpaarmigera)(Hear)NPV或甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)(Se)MNPV,优选源自于AcMNPV。具体来说，杆状病毒基因组可以源自于AcMNPV克隆C6(基因组序列:Genbank登记号NC_001623.1)或E2(Smith和Summers,1979)。[0018]本发明实施了杆状病毒基因的破坏。为此目的可以实施数种策略，特别是突变，例如通过从(重组)杆状病毒基因组缺失所选基因。用于研究基因功能的公知和已建立的方法是通过同源重组在细菌中操纵杆状病毒基因组，所述同源重组使用针对单一基因或一段侧翼基因的基于ET(大肠杆菌RecE和RecT蛋白)或λred的重组，所述单一基因或一段侧翼基因随后被抗生素选择标志物替换(Datsenko和Wanner,2000；ffesternberg等,2010)。为了在同一基因组中制备多个缺失，需要使用数种不同的选择标志物，或者选择标志物需要在侧翼带有独特的限制性位点，允许在每次基因缺失后通过消化和重新连接来移除。源自于在细菌基因组中制造连续缺失/插入的方法(Suzuki等,2007；Suzuki等,2005)的一种策略已被改造成用于杆粒技术(Marek等，2011)，并且已被有效地用在本研究中。它利用改良的cre-lox重组酶系统，该系统使用修饰的1xP位点来做出连续突变。在通过同源重组用选择标志物例如氯霉素乙酰基转移酶抗生素标志物替换第一基因后，由于在标志物两端处存在1xP位点，可以将所述标志物移除。在所使用的设置中，使用两个修饰的1xP位点(1x66和1x71),每个位点具有不同的突变。在通过ere-重组酶重组后，1οχ72位点被留下(Lambert等,2007),该位点于是具有两个突变而不是一个,并且不再能够被ere-重组酶识别。这允许随后缺失第二靶基因。[0019]在特定实施方式中，chi/v-cath(根据AcMNPV遗传图谱(Ayres等，1994),第105282-107954位核苷酸)和plO(第118839-119121位核苷酸)基因被破坏。[0020]在特定实施方式中，在破坏p26和/或p74基因、优选地p26和p74基因(第118044-121072位核苷酸)的编码序列的全部或一部分的同时，进行plO基因的破坏。[0021]在另一种特定实施方式中，对plO进行破坏而不破坏相邻的p26和p74基因的0RF。在这种实施方式的一种优选变化形式中，本发明的重组杆状病毒基因组仍包含plO启动子(因此，plO编码序列被破坏而不缺失其启动子,根据AcMNPV遗传图谱,所述启动子对应于第118739-118836位核苷酸)。在另一种实施方式中，plO启动子也被缺失。下面显示，破坏PlO基因的ORF同时保留其完整的启动子并且不破坏p26和p74基因的0RF，与重组杆状病毒基因组中这三个基因都被破坏时相比，允许产生更有效的rAAV病毒粒子。[0022]本发明的重组杆状病毒基因组可用于按照基于杆状病毒的表达系统领域中公知的方法生产重组蛋白或核酸。因此，重组杆状病毒基因组还可以带有可用于生产重组蛋白、核酸或用于生产复杂结构例如病毒载体和病毒样粒子的异源核苷酸序列。[0023]根据本发明，异源核苷酸序列是可用于生产目的产物(例如蛋白质、核酸例如mRNA、siRNA、反义核苷酸序列、发夹序列、病毒基因组例如用于基因治疗的重组病毒基因组)的序列。[0024]因此，本发明还涉及如上定义的包含异源序列的重组杆状病毒基因组(以及包含所述重组杆状病毒基因组的重组杆状病毒和宿主细胞)。[0025]可以将异源序列插入到杆状病毒中已知的位点或基因座中，以允许表达插入序列。例如，经典地，多角体蛋白基因座被用作异源核苷酸序列的插入位点(尤其是经由杆粒的Tn7重组位点)。[0026]本发明还涉及包含本发明的重组杆状病毒基因组的重组杆状病毒和宿主细胞。[0027]本发明的重组杆状病毒非常适用于生产复杂结构例如病毒载体或病毒样粒子。在后一种情况下，可以从数种重组杆状病毒基因组表达所述复杂结构的组分，每种所述基因组携带所述复杂结构的至少一种组分，并且每种所述组分由被包含在本发明的不同重组杆状病毒中的异源核苷酸序列编码。当使用这样的一组重组杆状病毒来生产数种重组组分时，优选地所有杆状病毒载体应该在几丁质酶基因、组织蛋白酶基因、P26基因、p74基因和PlO基因中具有相同的修饰。[0028]例如，为了生产重组AAV，可以使用包含三种杆状病毒的系统:编码AAVRep蛋白的杆状病毒，编码AAVCap蛋白的杆状病毒和编码在两个AAVITR之间包含目的基因(例如治疗性基因)的AAV-1TR基因组的杆状病毒(Manno等，2006；Mendell等，2010；Simonelli等，2010)。包含两种杆状病毒的系统(双重感染系统)现在也是可用的，其中编码AAVRep蛋白和AAVCap蛋白的DNA序列由一种杆状病毒提供。在实施例中使用后一种双重感染系统。[0029]因此，本发明还涉及如上定义的重组杆状病毒基因组(以及包含所述重组杆状病毒基因组的重组杆状病毒和宿主细胞)，所述重组杆状病毒基因组包含编码病毒载体或病毒样粒子的一部分的异源序列。[0030]在特定实施方式中，杆状病毒载体编码:[0031]-rAAV基因组，或[0032]-AAVR印蛋白，或[0033]-AAVCap蛋白，或[0034]-AAV组装活化蛋白(AAP)。[0035]在特定实施方式中，所述重组杆状病毒基因组包含优选地以相反取向包含AAVrep和cap基因的表达盒。[0036]宿主细胞可以是用于生产重组蛋白、核酸、病毒或病毒样粒子的生产细胞，所述生产细胞已被一种或多种本发明的杆状病毒感染。当然，控制重组杆状病毒基因组中存在的异源核苷酸序列的表达的启动子以及5’和3’非翻译区例如多腺苷酸化信号或miCToRNA靶区域最终取决于用于表达所述异源序列的产物的宿主细胞。如果宿主细胞是昆虫细胞，则需要使用在昆虫细胞中有效的启动子(例如PlO和多角体蛋白极晚期杆状病毒启动子或其组合)。在哺乳动物生产宿主细胞的情况下，启动子可以是哺乳动物启动子，例如人类巨细胞病毒(CMV)启动子。[0037]本发明的细胞可以选自哺乳动物细胞、优选为人类细胞，秀丽隐杆线虫(C.elegans)细胞，酵母细胞，昆虫细胞和原核细胞例如大肠杆菌细胞。[0038]用于实践本发明的优选的酵母细胞是酿酒酵母(S.cervisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、白假丝酵母(C.albicans)和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)。[0039]用于实践本发明的优选的大肠杆菌细胞是ToplO、DH5a、DHlOβ、TG1、BW23473、BW23474.MW003和MW005细胞(Westernberg等，2010)。[0040]用于实践本发明的优选的昆虫细胞是草地贪夜蛾(S.frugiperda)细胞，优选为Sf9、Sf21、ExpressSf+,或粉纹夜蛾(Trichoplusiani)HighFive细胞和黑腹果蚬(D.melanogaster)、优选为S2Schneider细胞。[0041]用于实践本发明的优选的人类细胞选自HeLa、Huh7、HEK293、H印G2、KATO-1II,MR32、MT-2、胰腺β-细胞、角化细胞、骨髓成纤维细胞、CHP212、原代神经细胞、W12、SK-N-MC,Saos-2、WI38、原代肝细胞、FLC4、143TK_、DLD-1、胚胎肺成纤维细胞、原代包皮成纤维细胞、Saos-2骨肉瘤、MRC5和MG63细胞。[0042]现在将结合下面的实施例和附图对本发明进行描述。【专利附图】【附图说明】[0043]图1.缺失几丁质酶、组织蛋白酶和plOORF而留下完整的plO启动子(ΛCCAplO)或与p26、plO和ρ74基因缺失相组合(ACCAp26pl0p74)的AcMNPV杆粒的示意性图谱。[0044]AcMNPV杆粒的几丁质酶、组织蛋白酶和plO或p26、plO、p74基因已被失活。将AAVrep2/cap8表达盒插入到所述杆粒的Tn7位点处。在同一杆粒骨架上，将rAAV基因(在本实施例中为mSeAP)转移到Tn7位点处。[0045]图2.总样品和纯化样品中的rAAV病毒基因组测定。[0046]在源自于使用野生型、ACCAplO-、ΛCCΛρ26ρ10ρ74_杆状病毒骨架进行的生产的总样品或纯化产物样品中，评估rAAV生产率。通过QPCR来定量rAAV滴度并将其表示为病毒基因组/mL(vg/mL)/mL(蓝色条),通过QPCR来定量污染的杆状病毒滴度,单位为vg/ml(红色点)。(a)rAAV总样品(b)免疫亲和纯化的rAAV。[0047]图3.纯化的rAAV载体的表征。[0048]通过SDS-PAGE，然后进行考马斯蓝染色(a)或AAVVP蛋白的Western印迹(b)，来分析免疫亲和纯化的rAAV载体。[0049]1:使用野生型杆状病毒生产的AAV-mSeAP(5xl010vg)`[0050]2:使用杆状病毒Λ(ΧΛρ26ρ10ρ74生产的AAV8_mSeAP(5xl010vg)[0051]3:使用杆状病毒ACCAplO生产的AAV8_mSeAP(5xl010vg)[0052]图4.rAAV载体的体内评估。[0053]将使用野生型或ΛCCΛρ26ρ10ρ74或ΛCCΛρ10杆状病毒生产的rAAV8_mSeAP以IO9Vg的量肌内注射到小鼠中(n=4)。(a)测定血清mSeAP随时间过程的表达。(b)mSeAP表达的组织学分析。制备肌肉切片(8μM)并分析mSeAP的定位。(C)转导的肌肉中rAAV基因组的定量。实施例[0054]材料和方法:[0055]杆状病毒基因组的缺失[0056]在含有AcMNPV杆粒(Luckow等，I"3)并用质粒pKD46(Datsenko和Wanner,2000)转化的大肠杆菌DHlOBac菌株中进行从野生型AcMNPV杆粒缺失组织蛋白酶和几丁质酶。使用pCRTopo-lox-CAT-lox作为模板(Marek等，2011)，利用引物CC-K0-F和CC-KO-R(表I)来产生组织蛋白酶/几丁质酶基因失活所必需的PCR产物。基因失活按照Marek等，2011来进行，并使用引物几丁质酶-105625F和组织蛋白酶-107849R(表1)来评估。按照以前所描述的(Marek等,2011)来进行从组织蛋白酶/几丁质酶缺失的杆粒(AcbacΔCCAcat)移除CAT基因标志物，并使用前面描述的引物通过PCR和测序进行验证。以相同的方式，使用利用引物对plO-KO-F/plO-KO-R(表1)产生的PCR产物，来进行第二基因的失活以从AcbacΛCCΛcat移除plO编码序列。利用引物对pl0-118725-F/pl0_119259-R(表1)，使用PCR和测序来进行正确基因失活的验证。该第二基因失活产生具有完整plO启动子的组织蛋白酶/几丁质酶/PlO缺失的杆粒(AcbacACCAplO)。或者，以类似的方式，利用使用引物对p26-K0-F/p74-K0_R(表1)产生的PCR产物，来进行AcbacΛCCΛcat中邻近基因p26-、pl0和p74的第二基因失活。利用引物对p26-117989-F/p74-121176-R(表1)，使用PCR和测序来进行正确基因失活的验证。后一种基因失活产生组织蛋白酶/几丁质酶/p26/pl0/p74缺失的杆粒(AcbacΛCCΛρ26ρ10ρ74)。[0057]通过转座将AAVrep/cap基因和重组AAV基因组插入到杆粒中[0058]用质粒pM0N7124(Luckow等，1993)转化含有野生型杆粒的大肠杆菌DHlOBac细胞和含有AcbacΛCCΛplO或AcbacACCAρ26ρ10ρ74的大肠杆菌DHlOP细胞。然后按照Bac-to-Bac系统手册(Invitrogen),使用质粒pFBD-mSeAP对所有这三种杆粒进行转座，所述质粒编码受CMV启动子控制并在侧翼带有AAV2的反向末端重复序列(ITR)的鼠类分泌型碱性磷酸酶报告基因(mSeAP)。还使用质粒pSR660进行转座，所述质粒编码受多角体蛋白极晚期启动子控制的AAV2r印78/52基因和受plO极晚期启动子控制的AAV8cap基因(Smith等，2009)。在杆粒基因组中的有效重组按照Bac-to-Bac方案来验证。这产生了用于生产携带ITR-mSeAPDNA的rAAV粒子的三组双杆粒，每组具有不同的杆状病毒基因组骨架(野生型，AcbacΔCCΔplO或AcbacΔCCΔρ26ρ10ρ74)。[0059]细胞系、杆状病毒和rAAV生产[0060]在ILBellco转瓶中，将悬浮培养物中的Sf9细胞在SF900II培养基(Invitrogen)中在27°C下进行生长。按照Bac-to-Bac方案的指导,从上面描述的缺失杆粒和重组杆粒产生杆状病毒，并将所述杆状病毒在IOOmLBellco转瓶中在Sf9细胞的悬浮培养物中进行扩增。rAAV的生产通过以下方式来进行:在IOOmLBellco转瓶中，在以IO6个细胞/mL的密度接种的70mLSf9细胞培养物中，用带有重组AAV基因组(ITR-mSeAP)和AAVrep2/cap8基因的杆状病毒以各自1.6的MOI对Sf9细胞进行双重感染。在感染后72h，回收ImL总培养物，用于在纯化前对rAAV生产进行直接定量，然后储存在_80°C。[0061]rAAV的纯化和表征[0062]按照(Smith等，2009)，在免疫亲和AVB琼脂糖介质(GEHealthcare)上从总样品纯化rAAV。将纯化的rAAV载体的5xl01Q病毒基因组(vg)在SDS-PAGEBis-Tris4_12%(Nu-PAGE，Invitrogen)上运行，并直接进行考马斯染色或转移至硝酸纤维素膜(iBlot凝胶转移硝酸纤维素堆叠体(iBlotgeltransferstacknitrocellulose),Invitrogen),然后进行免疫检测(参见下面Western印迹)。[0063]rAAV基因组滴度的测定[0064]直接在总培养物样品或纯化的rAAV样品上进行定量PCR测定法，以测定rAAV滴度(每mL产物的病毒基因组)。使用MagNAPureDNA和病毒RNA小量试剂盒(MagNAPure96，Roche),从总样品或纯化的样品直接提取病毒DNA。用作参比的质粒含有AAV2的两个ITR和杆状病毒DNA聚合酶基因。进行连续稀释以计算所分析的样品的最终拷贝数，并使用阳性对照来评估有效的滴定。由独立的操作人员在同一块板上同时进行滴定。[0065]Western印迹[0066]通过Western印迹分析杆状病毒总样品或纯化的rAAV8样品的AAVVP和Rep蛋白。[0067]抗VP第一抗体是以1/250稀释度使用的小鼠IgGl克隆BI(Progen)。抗R印第一抗体是以1/100稀释度使用的小鼠IgGl克隆303.9(Progen)。第二抗体是以1/5000稀释度使用的山羊抗小鼠Dye680(L1-C0R)。在红外成像系统阻断缓冲液(L1-COR)中进行温育，在Odyssey系统(L1-COR)上进行结果显示。使用0dySSey2.1软件来定量荧光强度。[0068]体内注射、样品收集和mSeAP定量[0069]将25μL磷酸盐缓冲盐水中IO9Vg的rAAV载体肌内注射到6周龄C57black6小鼠的左胫骨前(TA)肌中(每种载体n=4)。在注射后第3、7、14、21、28、35天，从注射的小鼠收集血样，用于mSeAP血清定量。在第35天，将动物处死，收集左侧和右侧TA肌并冷冻，然后进行组织学测定和酶法测定。[0070]按照关于科学目的用动物的保护的指令2010/63/EU来对待所有小鼠。使用12.5μL小鼠血清来进行mSeAP剂量测定。使用Phospha-LightSystem试剂盒(AppliedBiosytems)来实现mSeAP定量。在VictorII照度计仪器上对样品进行读数。使用纯化的人类胎盘碱性磷酸酶(AppliedBiosystems)的标准曲线,将表达水平表示成每mL血清中mSeAP的ng数。[0071]mSeAP表达的组织学分析[0072]制备肌肉切片(8μΜ)，并且使用如前所述(Riviere等，2006)的硝基蓝四氮唑/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐方法来分析mSeAP的定位。用核固红复染肌肉切片，并通过苏木精-伊红染色和光学显微镜分析来评估炎症和肌肉完整性。[0073]rAAV基因组的体内检测[0074]使用FastDNA试剂盒(QBIOgene),在FastPrep装置(QBIOgene)上，从小鼠肌肉提取总DNA样品。如前面部分中所述，使用QPCR进行rAAV基因组的滴定。使用titin基因的定量来进行归一化。[0075]统计分析[0076]对rAAV注射后35天时血清mSeAP表达的统计学显著性进行评估。进行组群比较。通过Fischer检验(α=0.05),然后使用Excel程序通过Student检验(α=0.05)来进行方差分析。[0077]结果[0078]几丁质酶、组织蛋白酶与plO或p26、plO和ρ74基因一起缺失的杆状病毒的产生[0079]为了移除多个基因，需要将连续缺失引入到AcMNPV杆粒中。用于研究基因功能的公知和已建立的方法是通过同源重组在细菌中操纵杆状病毒基因组，所述同源重组使用针对单一基因的基于ET(大肠杆菌RecE和RecT蛋白)或λred的重组，所述单一基因随后被抗生素选择标志物替换(Datsenko和Wanner,2000)。为了在同一基因组中制备多个缺失，需要使用数种不同的选择标志物，或者选择标志物需要在侧翼带有独特的限制性位点，允许在每次基因缺失后通过消化和重新连接来移除。源自于在细菌基因组中制造缺失/插入的方法(Suzuki等,2007；Suzuki等,2005)的一种策略已被改造成用于杆粒技术(Marek等，2011)。在通过同源重组用氯霉素乙酰基转移酶抗生素标志物替换第一基因后，由于在标志物两端处存在1xP位点，可以将所述标志物移除。在所使用的设置中，使用两个修饰的1xP位点(1οχ66和1οχ71),每个位点具有不同的突变。在通过ere-重组酶重组后，1οχ72位点被留下(Lambert等,2007),该位点于是具有两个突变而不是一个,并且不再能够被ere-重组酶识别。这允许随后缺失第二靶基因。在杆粒设置中测试了这种方法，以分两步连续移除chi/v-cath(按照AcMNPV遗传图谱(Ayres等，1994)，缺失第105282-107954位核苷酸)和ρ10(缺失第118839-119121位核苷酸)或p26/pl0/p74(缺失第118044-121072位核苷酸)基因。通过PCR和测序来评估这些缺失。用每种缺失杆粒DNA成功地转染Sf9细胞。感染后96h，观察到杆状病毒感染的可见征兆(细胞层的破坏，更大的Sf9细胞直径和死亡率)，表明AcΛCCΛplO和AcΛCCΛρ26ρ10ρ74杆状病毒两者的感染性。[0080]在将受polh启动子控制的AAV2rep基因和受plO启动子控制的AAV8cap基因以及AAV-mSeAP序列转座到AcΛCCAplO中之前，将含有不同的杆粒构建物的大肠杆菌DHlOβ细胞用质粒ΡΜ0Ν7124(Luckow等，1993)进行转化，以介导从含有目的构建物的转移载体有效重组到杆粒的Τη7位点中(图1)。[0081]在重组后并在杆粒DNA转染到Sf9细胞中之前，验证不存在非重组杆粒。[0082]对杆状病毒进行噬斑纯化并扩增两代。在重组的野生型、ACCAplO和ΛCCΛρ26ρ10ρ74杆状病毒之间，在杆状病毒滴度(pfu/ml)或AAVVP和Rep蛋白水平方面没有观察到差异。然后使用所述杆状病毒来进行rAAV生产。[0083]几丁质酶、组织蛋白酶和plO基因的缺失不提高Sf9细胞中的rAAV生产率[0084]在转瓶培养中进行标准的rAAV载体生产，清楚地表明，野生型或ACCAplO型或ACCAp26pl0p74型重组杆状病毒的生产是相当的，分别产生2.09χ10η、1.30χ10η和2.llxlOnvg/mL的滴度。同样地，当使用两种杆状病毒时，AAV的生产(模型转基因:mSeAP)事实上也相似，分别产生1.27x10'1.32xl010和1.40xl010vg/mL的滴度(图2A)。使用AVB层析法纯化AAV，导致滴度分别增加至Ij4.25χ1012、2.47χ1012和3.52xl012vg/mL(图2B)。[0085]这些结果表明，从杆状病毒骨架移除一些非必需杆状病毒基因，对AAV载体的生产和纯化没有影响。[0086]几丁质酶、组织蛋白酶和plO或p26、plO、p74基因缺失的杆状病毒的使用减少rAAV粒子降解。[0087]几丁质酶、组织蛋白酶的不存在，与plOORF缺失或者p26、plO和p74基因的缺失相组合，对AAV载体的完整性具有有益影响。最可能的是，源自于杆状病毒的蛋白酶活性(组织蛋白酶)的不存在，导致载体粒子降解的减少，如SDS-PAGE和Western印迹(WB)分析所示(图3)。这些分析方法清楚地表明至少三条VP特异性“污染降解带”的消失。三条带中主要的污染降解带位于VP3附近(图3)。因此，使用八0^?10或八0^?26?10?74杆状病毒代替野生型杆状病毒，导致rAAV载体降解的减少和数种VP降解产物的消失。[0088]使用几丁质酶、组织蛋白酶和plO或p26、plO、p74基因缺失的杆状病毒生产的rAAV粒子表现出更高的体内感染性。[0089]当使用ACCAplO或ACCAp26pl0p74杆状病毒时，WB中某些小尺寸蛋白带的消失表明rAAV载体粒子的降解减少并可能具有更好的完整性，提示体内感染性/效能可能提高。事实上，当将使用三种不同的杆状病毒骨架(野生型、ΛCCΛρ10和ACCAp26pl0p74)生产的纯化的rAAV-mSeAP粒子肌内注射到小鼠(C57Black6)中时，在注射后约I周在血清中观察到mSeAP活性。当使用野生型骨架、ΛCCΛρ10_和ΛCCΛρ26ρ10ρ74_骨架进行AAV生产时，在注射后3周，活性分别增加到约5.8ng/mL、23.2ng/mL和9.3ng/mL的平台水平(图4A)。当使用ACCAplO-杆状病毒骨架进行rAAV生产时，与野生型杆状病毒骨架相比，差异在4倍的量级上(p=0.01)。当使用ACCAp26pl0p74-骨架代替野生型骨架时，差异在2倍的量级上(ρ=0.05)。[0090]在注射后35天，将小鼠处死并对注射的肌肉进行组织学分析。对于mSeAP活性的血清水平的增加来说，与用使用野生型杆状病毒系统生产的rAAV注射的小鼠相比，用使用ΛCCAplO杆状病毒生产的rAAV注射的小鼠显示出转导的肌肉组织中mSeAP活性明显提高。已发现，与使用两种其他杆状病毒骨架生产的rAAV相比，用使用ACCAp26pl0p74生产的rAAV转导的肌肉组织中的mSeAP活性在中间范围内(图4B)。如定量PCR(图4C)所示，用使用ΛCCΛρ10杆状病毒生产的rAAV观察到的mSeAP活性的增加，与被递送至TA肌肉细胞的rAAV基因组拷贝数的增加相关，表明与野生型生产系统相比，递送了超过3.25个基因组拷贝。类似地，与使用用野生型杆状病毒骨架生产的rAAV相比，在使用ACCAp26pl0p74杆状病毒生产后对被递送到TA肌肉细胞的rAAV基因组拷贝数进行的评估产生2倍的增加(图4C)。这些值与使用各种杆状病毒载体获得的mSeAP活性水平非常一致。[0091]参考文献[0092]AyresMD,HowardSC,KuzioJ,Lopez-FerberM,PosseeRD(1994).苜猜银纹夜蛾核多角体病毒的完整DNA序列(ThecompleteDNAsequenceofAutographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus),Virology202(2):586-605.[0093]CarbonellLF,HodgeMR,TomalskiMD,MillerLK(1988).编码昆虫特异性蝎神经毒素的基因的合成以及使用杆状病毒载体表达它的尝试(Synthesisofagenecodingforaninsect-specificscorpionneurotoxinandattemptstoexpressitusingbaculovirusvectors),Gene73,409-18.[0094]DatsenkoKA,WannerBL(2000).使用PCR产物在大肠杆菌K-12中一步法失活染色体基因(One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts)，PNAS97(12):6640-6645.[0095]FriesenF1D和MillerLK(1986).杆状病毒基因表达的调控(Theregulationofbaculovirusgeneexpression)`,在《杆状病毒的分子生物学》(TheMolecularBiologyofbaculoviruses)中(ff.Doerfler和P.Boehm主编)，Springer-Verlag,Berlin,pp.31-49.[0096]HitchmanRB,PosseeRD,CrombieAT,ChambersA,HoK,SiaterliE,Lissina0,SternardH,NovyR,LoomisK,BirdLE,OwensRJ,KingLA(Epub2009Aug5)用于提高昆虫细胞中的表达的杆状病毒载体遗传修饰(Geneticmodificationofabaculovirusvectorforincreasedexpressionininsectcells),CellBiolToxicol.[0097]KabaSA,SalcedoAM,WafulaPO,VlakJM,vanOersMM(2004).用于提高分泌型重组蛋白的完整性的几丁质酶和v-组织蛋白酶阴性杆粒的开发(Developmentofachitinaseandv—cathepsinnegativebacmidforimprovedintegrityofsecretedrecombinantproteins),JVirolMethodsl22(I):113-118.[0098]LambertJM,BongersRS,KleerebezemM(2007).用于在植物乳杆菌中进行多基因缺失和可选择标志物移除的基于Cre-lox的系统(Cre-lox-BasedSystemforMultipleGeneDeletionsandSelectable-MarkerRemovalinLactobacilluspiantarum),ApplEnvironMicrobioI73(4):1126-1135.[0099]Lebacq-VerheydenAM,KasprzykPG，RaumMG,VanWykeCoelinghK，LebacqJAjBatteyJF.(1988).内源和杆状病毒表达的人类胃泌素释放肽前体的翻译后加工(Posttranslationalprocessingofendogenousandofbaculovirus-expressedhumangastrin-releasingpeptideprecursor)，MolecularandCellBiology8,3129-35.[0100]LuckowVAjSummersMD(1988).杆状病毒表达系统的发展趋势(Trendsinthedevelopmentofbaculovirusexpressionvectors),BioTechnology6,47-55.[0101]LuckowVAjLeeSC，BarryGFjOlinsP0(1993).通过将外来基因以位点特异性的转座子介导的方式插入到在大肠杆菌中繁殖的杆状病毒基因组中可有效地产生感染性重组杆状病毒(Efficientgenerationofinfectiousrecombinantbaculovirusesbysite-specifictransposon—mediatedinsertionofforeigngenesintoabaculovirusgenomepropagatedinEscherichiacoli),JVirol67(8):4566-4579.[0102]LynnDE(2007).可用的鱗翅目昆虫细胞系(Availablelepidopteraninsectcelllines)，InMethodsMolBiol,pp.117-137.[0103]MaedaSjKawaiT，ObinataMjFujiwaraH，HoriuchiT，SaekiY，SatoYjFurusawaM.(1985).使用杆状病毒载体在家蚕中生产人类α-干扰素(Productionofhumanalpha-1nterferoninsilkwormusingabaculovirusvector),Nature315,592-4.[0104]MannoCS,PierceGFjArrudaVRjGladerB，RagniM等(2006).通过AAV-因子IX在血友病患者中成功转换肝脏以及由宿主免疫应答施加的限制(SuccessfultransductionofliverinhemophiliabyAAV-FactorIXandlimitationsimposedbythehostimmuneresponse)，NatMedl2(3):342-347.[0105]MarekMjvanOersMM，DevarajFFjVlakJMjMertenOW(2011).用于制造无毒粒生物药物的杆状病毒载体的工程化改造(Engineeringofbaculovirusvectorsforthemanufactureofvirion-freebiopharmaceuticals)，BiotechnolBioengl08(5):1056-1067.[0106]MartinBM，TsujiSjLaMarcaME,MaysakK，EliasonWjGinnsEI(1988).使用杆状病毒表达载体在无脊椎动物中对高水平的活性人类葡萄糖脑苷脂酶进行糖基化和加工(Glycosylationandprocessingofhighlevelsofactivehumanglucocerebrosidaseininvertebratecellsusingabaculovirusexpressionvector),DNA7,99-106.[0107]McKennaKAjHongH，vanNunenjGranadosRR(1989).在无血清培养基中建立用于杆状病毒和重组蛋白生产的新的粉纹夜蛾细胞系(EstablishmentofnewTrichoplusianicelllines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