鞘磷脂的测定方法和测定用试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供用于简便并且准确地测定样本中的鞘磷脂的方法和试剂盒。一种样本中的鞘磷脂的测定方法，其特征在于，使样本与不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、以及胆碱氧化酶反应，并消去生成的过氧化氢，接着，使样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D、以及胆碱氧化酶反应，并测定生成的过氧化氢。
【专利说明】鞘磷脂的测定方法和测定用试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及鞘磷脂的测定方法和测定用试剂盒。
【背景技术】
[0002]在血液中含有高密度脂蛋白(以下简记为HDL)、低密度脂蛋白(以下简记为LDL)、极低密度脂蛋白(以下简记为VLDL)、乳糜微粒(以下简记为CM)等脂蛋白。各脂蛋白的胆固醇、甘油三酯、磷脂、蛋白质等构成成分的比例不同，在生物体内具有不同的作用。在脂蛋白中主要含有三种磷脂，即，磷脂酰胆碱(以下简记为PC)、溶血磷脂酰胆碱(以下简记为LPC)、鞘磷脂(以下简记为SM)。
[0003]在这三种磷脂中，PC和SM为主要的磷脂，分别占全部磷脂的约7成和约2成。已知SM蓄积在人和动物模型的粥样斑块(Atheroma)中。存在于人的动脉硬化斑块中的LDL，与血浆中的LDL相比，含有更多的SM(非专利文献I)。
[0004]另一方面，在人的临床研究中也显示出血浆中的SM和SM/PC比率是相对于缺血性心脏病而言独立的危险因素(非专利文献2~4)。
[0005]至今，作为SM的测定方法，报道了使用薄层色谱的方法和使用高效液相色谱的方法(非专利文献5)，但具有操作烦杂且测定需要长时间等缺点。另外，也报道了利用来源于细菌的鞘磷脂酶的酶测定法(专利文献1、非专利文献2)。本测定法为如下方法:将鞘磷脂通过细菌的鞘磷脂酶水解成磷酸胆碱和N-酰基鞘氨醇，将生成的磷酸胆碱通过碱性磷酸酶水解成胆碱，使生成的胆碱与胆碱氧化酶反应，测定生成的过氧化氢，由此，测定鞘磷脂。但是，本测定法具有因使用碱性磷酸酶而产生的对其他测定项目的测定的影响、鞘磷脂酶与SM —起同LPC反应的特异性等问 题(非专利文献6)。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1:日本特表2009-519713号公报
[0009]非专利文献
[0010]非专利文献I Circulation, Vol.110 (22)，ρ.3465-3471 (2004).[0011]非专利文献2:Arterioscler Thromb Vasc Biol., Vol.20, p.2614-2618 (2000).[0012]非专利文献3:Nutrition&Metabolism, Vol.3, p.5 (2006).[0013]非专利文献4:Am.J.Epidemiol., Vol.163，p.903-912 (2006).[0014]非专利文献5:Dairy Sc1.，Vol.88，p.482-488 (2005).[0015]非专利文献6:Biol.Pharm.Bull.Vol.27, p.1725-1729(2004).
【发明内容】
[0016]发明要解决的问题
[0017]本发明的目的在于，提供用于简 便并且准确地测定样本中的SM的方法和试剂盒。
[0018]用于解决问题的方法[0019]本发明人为了解决上述问题而进行了深入的研究，发现，在选择性地测定含有PC、LPC和SM的样本中的SM的方法中，通过使用不与使LPC与溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶反应而生成的甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应但与SM反应的磷脂酶D，能够特异性地测定SM，从而完成了本发明。即，本发明涉及以下的[I]~[17]。
[0020][I] 一种样本中的SM的测定方法，其特征在于，使样本与不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、以及胆碱氧化酶反应，并消去生成的过氧化氢，接着，使样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、以及胆碱氧化酶反应，并测定生成的过氧化氢。
[0021][2] 一种样本中的SM的测定方法，其特征在于，使样本与不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶反应，并消去生成的过氧化氢，接着，使样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶反应，并测定生成的过氧化氢。
[0022][3]如[I]所述的方法，其中，在过氧化氢酶存在下进行样本与不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、以及胆碱氧化酶的反应，在过氧化氢酶抑制剂存在下进行样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、以及胆碱氧化酶的反应。
[0023][4]如[2]所述的方法，其中，在过氧化氢酶存在下进行样本与不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶的反应，在过氧化氢酶抑制剂存在下进行样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的 磷脂酶D、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶的反应。
[0024][5]如[3]或[4]所述的方法，其中，过氧化氢酶抑制剂为叠氮化物。
[0025][6]如[I]或[2]记载的方法，其中，在过氧化物酶和一对氧化偶合发色型色原体中的一个存在下进行过氧化氢的消去，在过氧化物酶和一对氧化偶合发色型色原体存在下进行过氧化氢的测定。
[0026][7]如[I]~[5]中任一项所述的方法，在过氧化物酶和无色型色原体存在下进行过氧化氢的测定。
[0027][8]如[I]~[7]中任一项所述的方法，其中，不与SM和LPC反应而是与PC反应的磷脂酶D为来源于链霉菌(Streptomyces sp.)的磷脂酶D。
[0028][9]如[I]~[8]中任一项所述的方法，其中，不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D为来源于色褐链霉菌(Streptomyces chromofuscus)的磷脂酶D。
[0029][10] 一种样本中的SM测定用试剂盒，其特征在于，包含:含有不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱氧化酶和过氧化氢酶的第一试剂；以及含有不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D和过氧化氢酶抑制剂的第二试剂。
[0030][11] 一种样本中的鞘磷脂测定用试剂盒，其特征在于，包含:含有不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶和一对氧化偶合发色型色原体中的一个的第一试剂；以及含有不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D和氧化偶合发色型色原体中的另一个的第二试剂。
[0031][12] 一种样本中的鞘磷脂测定用试剂盒，其特征在于，包含:含有不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶和过氧化氢酶的第一试剂；以及含有不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D和过氧化氢酶抑制剂的第二试剂。
[0032][13] 一种样本中的SM测定用试剂盒，其特征在于，包含:含有不与SM和LPC反应而是与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化物酶和一对氧化偶合发色型色原体中的一个的第一试剂；以及含有不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D和氧化偶合发色型色原体中的另一个的第二试剂。
[0033][14]如[10]或[12]所述的试剂盒，其中，过氧化氢酶抑制剂为叠氮化物。
[0034][15]如[10]、[12]或[14]所述的试剂盒，其中，过氧化物酶和无色型色原体分别
包含在第一试剂和第二试剂中。
[0035][16]如[10]~[15]中任一项所述的试剂盒，其中，不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D为来源于链霉菌(Streptomyces sp.)的磷脂酶D。
[0036][17]如[10]~[16]中任一项所述的试剂盒，其中，不与甘油_3_磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D为来源于色褐链霉菌(Streptomyces chromofuscus)的磷脂酶D。
[0037]发明效果
[0038]根据本发明，能提供用于简便并且准确地测定样本中的SM的方法和试剂盒。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1是表示实施例1的试剂盒(试剂盒A~F)的对SM、LPC和PC各磷脂的标准溶液的“吸光度”的图。纵轴表示吸光度(HiAbs)，横轴表示各试剂盒(试剂盒A~F)。口表示SM, 表示PC,包围虚线表示LPC。
[0040]图2表示使用实施例2的试剂盒的测定与使用对照试剂盒的测定之间的相关图。纵轴表示通过使用实施例2的测定确定的样本中的SM浓度(mg/dL)，横轴表示通过使用对照试剂盒的测定确定的样本中的SM浓度(mg/dL)。
[0041]图3是表示使用实施例2的试剂盒的测定中的SM浓度与吸光度之间的关系的图。纵轴表不吸光度(mAbs),横轴表不SM浓度(mg/dL)。【具体实施方式】
[0042]〈SM的测定方法>
[0043]本发明的SM测定方法为不需要SM的分离操作的方法。
[0044]本发明的SM的测定方法为一种样本中的SM的测定方法，其特征在于，使样本与不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、以及胆碱氧化酶反应，并消去生成的过氧化氢，接着，使样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、以及胆碱氧化酶反应，并测定生成的过氧化氢。具体而言，可以列举包括下述步骤的方法。
[0045](I)使样本与不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、以及胆碱氧化酶反应而生成过氧化氢、甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸的步骤；
[0046](2)消去步骤(1)中生成的过氧化氢的步骤；
[0047](3)使步骤(2)后的反应液中的SM与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、以及胆碱氧化酶反应而生成过氧化氢的步骤；和
[0048](4)测定步骤(3)中生成的过氧化氢的步骤。
[0049]作为上述步骤(1)中的样本，使用SM浓度已知的标准品，通过上述步骤进行测定，制作表示SM浓度与测定值之间的关系的标准曲线后，使用实际的样本，通过上述步骤进行测定，将所得到的测定值与预先制作的标准曲线进行对照，由此，能够确定样本中的SM浓度。
[0050]另外，作为步骤(3)中使用的胆碱氧化酶，可以为步骤(1)中使用的胆碱氧化酶，也可以为新添加的胆碱氧化酶。
[0051]将通过上述步 骤进行的本发明的SM的测定方法的原理图示于表1。
[0052]
【权利要求】
1.一种样本中的鞘磷脂的测定方法，其特征在于，使样本与不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、以及胆碱氧化酶反应，并消去生成的过氧化氢，接着，使样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D、以及胆碱氧化酶反应，并测定生成的过氧化氢。
2.—种样本中的鞘磷脂的测定方法，其特征在于，使样本与不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶反应，并消去生成的过氧化氢，接着，使样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶反应，并测定生成的过氧化氢。
3.如权利要求1所述的方法，其中，在过氧化氢酶存在下进行样本与不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、以及胆碱氧化酶的反应，在过氧化氢酶抑制剂存在下进行样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D、以及胆碱氧化酶的反应。
4.如权利要求2所述的方法，其中，在过氧化氢酶存在下进行样本与不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶的反应，在过氧化氢酶抑制剂存在下进行样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶的反应。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中，过氧化氢酶抑制剂为叠氮化物。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中，在过氧化物酶和一对氧化偶合发色型色原体中的一个存在下进行过氧化氢的消去，在过氧化物酶和一对氧化偶合发色型色原体存在下进行过氧化氢的测定。
7.如权利要求1~5中任一项所述的方法，其中，在过氧化物酶和无色型色原体存在下进行过氧化氢的测定。
8.如权利要求1~7中任一项所述的方法，其中，不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D为来源于链霉菌(Streptomyces sp.)的磷脂酶D。
9.如权利要求1~8中任一项所述的方法，其中，不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D为来源于色褐链霉菌(Streptomyces chromofuscus)的磷脂酶D。
10.一种样本中的鞘磷脂测定用试剂盒，其特征在于，包含:含有不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱氧化酶和过氧化氢酶的第一试剂；以及含有不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D和过氧化氢酶抑制剂的第二试剂。
11.一种样本中的鞘磷脂测定用试剂盒，其特征在于，包含:含有不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶和一对氧化偶合发色型色原体中的一个的第一试剂；以及含有不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D和氧化偶合发色型色原体中的另一个的第二试剂。
12.—种样本中的鞘磷脂测定用试剂盒，其特征在于，包含:含有不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶和过氧化氢酶的第一试剂；以及含有不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D和过氧化氢酶抑制剂的第二试剂。
13.一种样本中的鞘磷脂测定用试剂盒，其特征在于，包含:含有不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化物酶和一对氧化偶合发色型色原体中的一个的第一试剂；以及含有不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D和氧化偶合发色型色原体中的另一个的第二试剂。
14.如权利要求10或12所述的试剂盒，其中，过氧化氢酶抑制剂为叠氮化物。
15.如权利要求10、12或14所述的试剂盒，其中，过氧化物酶和无色型色原体分别包含在第一试剂和第二试剂中。
16.如权利要求10~15中任一项所述的试剂盒，其中，不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D为来源于链霉菌(Streptomyces sp.)的磷脂酶D。
17.如权利要求10~16中任一项所述的试剂盒，其中，不与甘油-3-磷酸胆碱 和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D为来源于色褐链霉菌(Streptomyceschromofuscus)的憐脂酶 D。
【文档编号】C12Q1/26GK103717748SQ201280037421
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2012年7月25日 优先权日:2011年7月29日
【发明者】木村豪秀, 宫内一人, 桑田英之 申请人:协和梅迪克斯株式会社