发酵戊糖的细胞的制作方法

发酵戊糖的细胞的制作方法
【专利摘要】本发明涉及下述细胞，所述细胞包含序列编码木糖异构酶的核苷酸序列，其中木糖异构酶的氨基酸序列与SEQ?ID?NO：2中所示的氨基酸序列具至少75％序列同一性并且其中所述核苷酸序列对宿主而言是异源的。本发明的细胞可用在生产发酵产物，比如乙醇的方法中。这种方法可包括用本发明的细胞发酵含有木糖来源的培养基，从而所述细胞将木糖发酵成为发酵产物。
【专利说明】发酵戊糖的细胞
【技术领域】
[0001]本发明涉及能够将木糖异构化为木酮糖的细胞。本发明还涉及其中使用这类细胞生产发酵产物，比如乙醇的方法。
[0002]发明背景
[0003]最近几十年，传统化石燃料(基于石油的燃料)的大规模消耗造成了高水平的污染。这与化石燃料的世界储备并非有限的认识以及增长的环境意识一起刺激了研究替代性燃料(如乙醇)可行性的新动机，所述替代性燃料是以每升为基础比无铅汽油释放更少CO2的无粒子燃烧燃料来源。
[0004]尽管生物量衍生的乙醇可以通过得自许多不同来源的己糖的发酵来生产，但是，典型地用于商业规模生产燃料醇的底物如甘蔗和玉米淀粉是昂贵的。因此，燃料乙醇生产的提高会需要使用更低成本的原料。
[0005]目前，只有衍生自植物生物量的木质纤维素原料能够足量获得，用于代替目前用于乙醇生产的作物。在大部分木质纤维素材料中，次于葡萄糖的第二常见糖是木糖。因此，对于经济上可行的燃料生产工艺而言，己糖和戊糖均必须被发酵形成乙醇。酵母Saccharomyces cerevisia是鲁棒的(robust)并且充分适合乙醇生产,但是不能够使用木糖作为碳源生产乙醇。另外，没有一种天然存在的生物是已知能够以高乙醇产率(yiled)以及高乙醇生产力将木糖发酵成乙醇的。因此，对下述生物存在需要，所述生物具有这些特性从而能够在商业上有活力地从木质纤维素原料生产乙醇。

【发明内容】

[0006]根据本发明，提供了能够发酵，比如醇发酵并能使用木糖作为碳源的细胞。这类细胞包含编码木糖异构酶的核苷酸 序列，其中木糖异构酶的氨基酸序列与SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列具有至少75%序列同一性，并且，其中，核苷酸序列对宿主而言是异源的。当使用木糖作为碳源时，与野生型丝状真菌相比较，这种细胞生产更高量的乙醇。
[0007]本发明还提供了:
[0008]——生产发酵产物的方法，所述方法包括用本发明的细胞发酵含有木糖来源的培养基，使得细胞将木糖发酵成为发酵产物；
[0009]——生产发酵产物的方法，所述方法包括用本发明所定义的能利用L-阿拉伯糖的细胞发酵至少含有木糖来源和L-阿拉伯糖来源的培养基，使得细胞将木糖和L-阿拉伯糖发酵成为发酵产物；和
[0010]——生产发酵产物的方法，所述方法包括用本发明的细胞和能使用L-阿拉伯糖的细胞发酵至少含有木糖来源和L-阿拉伯糖来源的培养基，借以每种细胞将木糖和/或阿拉伯糖发酵成为发酵产物。
[0011]在一种实施方式中，所述细胞包含编码可从Clostridium属,例如从Clostridiumbeijerinckii细胞获得的木糖异构酶的核苷酸序列。在一种实施方式中，核苷酸可以是野生型的或经密码子优化的或经密码子对优化的。[0012]本发明还提供了本发明的细胞在用于生产发酵产物的方法中的用途。
[0013]附图简沭
[0014]图1展示了编码来自Clostridium beijerinckii的木糖异构酶、用于在Saccharomyces cerevisiae中表达的p427_TEF质粒图谱。CpO表示经密码子对优化的。
[0015]图2展示了用pPWT215转化的BIE104P1和用没有DNA的质粒转化(模拟转化)的参照菌株在2%木糖作为唯一碳源上的生长曲线。数字“I”和“2”表示培养物的等分试样向新鲜培养基的转移。所有的培养物在存在空气的情况下孵育，(第二次转移后的)最后一次培养物例外。
[0016]图3展示了来自实施例6的菌株BIE292XI(C.beyerinCkii)(黑线)和模拟菌株(灰线)的生长曲线。
[0017]序列表简沭
[0018]SEQ ID NO:1展示了来自Clostridium beijerinckii的经密码子对优化的木糖
异构酶序列。
[0019]SEQ ID NO:2展示了来自Clostridium beijerinckii的木糖异构酶的氨基酸序列。
[0020]SEQ ID NO:3展示了正向引物的序列。
[0021]SEQ ID NO:4展示了反向引物的序列。
[0022]发明详沭
[0023]在本说明书和附带的权利要求书中，词语“包含”和“包括”及其变体如“包含”("comprises"，"包含")、“包括包括"和"包括")应被解释为包含在内(inclusive) 0也就是说，在上下文允许时，这些词语旨在传达可能包括未明确指出的其它元素或整数。
[0024]本发明涉及包含编码木糖异构酶的核苷酸序列的细胞，其中木糖异构酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少75%同一性，并且，其中核苷酸序列对宿主而言是异源的。
[0025]编码木糖异构酶的核苷酸序列的存在赋予细胞将木糖异构化为木酮糖的能力。
[0026]“木糖异构酶” (EC5.3.1.5)在本文中被定义为催化D-木糖直接异构化为D-木酮糖和/或其反向的酶。所述酶还已知为D-木糖酮异构酶。本文的木糖异构酶也可以能够催化D-葡萄糖和D-果糖之间的转化(并因此可以被称作葡萄糖异构酶)。本文的木糖异构酶可需要二价阳离子，比如镁、锰或钴作为辅因子。
[0027]因此，本发明的细胞能够将木糖异构化为木酮糖。通过用下述核酸构建体转化宿主细胞对所述宿主细胞赋予将木糖异构化为木酮糖的能力，所述核酸构建体包含编码确定的木糖异构酶的核苷酸序列。本发明的细胞通过木糖到木酮糖的直接异构化将木糖异构化为木酮糖。这被理解为表示，在木糖异构酶催化的单一反应中木糖被异构化为木酮糖，与分别由木糖还原酶和木糖醇脱氢酶催化的、木糖经由木糖醇中间产物成为木酮糖的两步法转化相对。
[0028]木糖异构酶活性单位(U)在本文中可以被定义为:在Kuyper等人(2003，FEMSYeast Res.4:69-78)所述条件下,每分钟生产Ihmol木酮糖的酶的量。
[0029]本发明的细胞参照具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与所述序列具有至少74%序列同一性的木糖异构酶定义。同样地，本发明的细胞可以参照木糖异构酶和编码这种氨基酸序列的核苷酸序列来定义。
[0030]SEQ ID NO:2展不了来自Clostridium beijerinckii的木糖异构酶氨基酸序列。本发明的细胞包含编码下述木糖异构酶的核苷酸序列，所述木糖异构酶具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列或与所述序列具有至少74%序列同一性的氨基酸序列。
[0031]优选地，根据本发明的细胞是包含编码具有下述序列的木糖异构酶的核苷酸序列的细胞，所述序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少约75%、优选地至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%或至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %序列同一性。根据本发明的细胞可包含编码木糖异构酶的、具有下述序列的核苷酸序列，所述序列与SEQ ID NO:1中所示的核酸序列具有至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约70%、至少约75%、优选地至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约92%、至少约93 %、至少约94%、至少约95 %、至少约96 %、至少约97 %、至少约98 %或至少约99 %或至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性。
[0032]序列同一性(或序列相似性)在本文中被定义为，如通过比较序列测定的，两条或多条氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两条或多条核酸(多核苷酸)序列之间的关系。通常，典型地在被比较的序列全长上比较序列同一性或相似性。但是，可在更短的比较窗口上比较序列。本领域中，“同一性”也表示两条氨基酸或核酸序列之间的序列相关度，根据情况通过这些序列串之间的匹配测定。[0033]测定同一性的优选方法被设计为在所测试的序列之间给出最大匹配。测定同一性和相似性的方法在公众可获得的计算机程序中编码。测定两条序列之间的同一性和相似性的优选计算机程序方法，包括例如BestFit、BLASTP, BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.et al.,J.Mol.Biol.215:403-410 (1990)，公众可从 NCBI 和其他来源(BLAST Manual,Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda, MD20894)获得。使用 BLASTP 进行氨基酸序列比较的优选参数是缺口开放11.0、缺口延伸l、Blosum62矩阵。使用BLASTP进行核酸序列比较的优选参数是缺口开放11.0、缺口延伸1、DNA完全矩阵(DNA同一性矩阵)。
[0034]任选地，在氨基酸相似性程度的测定中，本领域技术人员可还将称为“保守的”氨基酸替换考虑进去，这对本领域技术人员而言是明确的。
[0035]保守的氨基酸替换是指具有相似侧链的残基的可交换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳基侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。
[0036]优选的保守氨基酸替换组是:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列替换变体是其中在所公开的序列中至少一个残基已被去除且在其位置处插入不同的残基的那些。优选地，氨基酸改变是保守的。如下为对于每一个天然存在的氨基酸而言优选的保守替换:丙氨酸替换为丝氨酸；精氨酸替换为赖氨酸；天冬酰胺替换为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸替换为组氨酸；半胱氨酸替换为丝氨酸或丙氨酸；谷氨酰胺替换为天冬酰胺；谷氨酸替换为天冬氨酸；谷氨酸替换为脯氨酸；组氨酸替换为天冬酰胺或谷氨酰胺；苯丙氨酸替换为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸替换为异亮氨酸或缬氨酸；赖氨酸替换为精氨酸；谷氨酸酰胺或谷氨酸；蛋氨酸替换为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸替换为蛋氨酸、亮氨酸或酪氨酸；丝氨酸替换为苏氨酸；苏氨酸替换为丝氨酸；色氨酸替换为酪氨酸；酪氨酸替换为色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸替换为异亮氨酸或亮氨酸。
[0037]根据本发明编码催化木糖向木酮糖转化的酶的核苷酸序列也可以通过它们在中度杂交条件下或优选地在严格杂交条件下与编码下述酶的核苷酸序列杂交的能力来定义，所述酶具有SEQ ID NO:2所示的序列或与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少74%序列同一性的序列。
[0038]形式上，这种核苷酸序列与编码下述酶的核苷酸序列的反向互补链杂交，例如是与SEQ ID NO:1或2的反向互补序列杂交的序列,所述酶具有SEQ ID NO:2所示的序列或与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少74%序列同一性的序列。
[0039]严格杂交条件在本文被定义为下述条件，所述条件允许至少约25个、优选地约50个核苷酸、75或100和最优选地约200或更多个核苷酸的核酸序列于约65°C下在包含约IM盐的溶液(优选6 XSSC (氯化钠、柠檬酸钠))或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中杂交，以及于65°C下在包含约IM盐，或更少的盐，优选地0.2X SSC的溶液中或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即，至少进行10个小时，以及优选地，洗涤进行至少一个小时，其中至少将洗涤溶液更换两次。这些条件通常允许具有约90 %或更高序列同一性的序列的特异性杂交。
[0040]中度条件在本文中被定义为下述条件，所述条件允许至少50个核苷酸、优选约200或更多个核苷酸的核酸序列，在约45°C的温度下，在包含约IM盐的溶液(优选6 X SSC)或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中杂交，以及在室温下，在包含约IM盐的溶液(优选6XSSC)或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少进行10小时，以及优选地，洗涤进行至少I小时，其中至少将洗涤溶液更换两次。这些条件通常会允许具有多达50%`序列同一性的序列的特异性杂交。本领域技术人员应当能够调整这些杂交条件，从而特异性地鉴定同一性在50%和90%之间变化的序列。
[0041]为了提高引入的酶在本发明的细胞中以活性形式表达的可能性，可以改变相应的编码核苷酸序列，从而使其密码子使用(codon usage)针对选用的酵母细胞而被优化。用于密码子优化的若干方法是本领域已知的。针对酵母优化核苷酸序列密码子选择的一种优选的方法是W02006 / 077258和/或W02008 / 000632中公开的密码子对优化技术。W02008 /000632提到密码子对优化。密码子对优化是下述一种方法，其中编码多肽的核苷酸序列在其密码子使用方面(特别是使用的密码子对)进行了修饰，从而获得编码多肽的核苷酸序列提高的表达和/或所编码的多肽提高的生产。密码子对被定义为编码序列中两个相继三联体(密码子)的集合。
[0042]本文中使用如Xuhua Xia, Evolutionary Bioinformatics2007,:353-58 中所述的密码子适应指数(Codon Adaptation Index, CAI)作为基因表达和翻译效率的简单度量。所述指数使用来自一个物种的高度表达基因的参照组来评价每种密码子的相对考绩(merits)，并从所述基因中所有密码子的使用频率计算基因的分值。指数评价选择在塑造密码子使用模式中的有效程度。在这一方面中，预测基因的表达水平来评价病毒基因对其宿主的适应和比较不同生物中的密码子使用是有用的。指数也可给出异源基因表达可能成功的大致指示。在根据本发明的经密码子对优化的基因中，CAI为0.6或更多、0.7或更多、
0.8或更多、0.85或更多、0.87或更多0.90或更多、0.95或更多或约1.0。
[0043]在本发明的细胞中，木糖异构酶对细胞而言典型地是异源的。也就是说，木糖异构酶具有下述序列，所述序列不做为其存在的生物、细胞、基因组DNA或RNA序列的一部分而天然存在于所考虑的细胞中。也就是说，木糖异构酶对细胞而言是外源的或在细胞中不天然存在。因此，编码木糖异构酶的核苷酸序列在经转化的宿主细胞中典型地以活性形式被表达或能以活性形式被表达。
[0044]本发明的细胞因而是包含下述核酸构建体(即，用所述核酸构建体转化)的细胞，所述核酸构建体包含编码如上文所定义的木糖异构酶的核苷酸序列。包含木糖异构酶编码序列的核酸构建体优选地能在所述宿主细胞中表达木糖异构酶。
[0045]用于在细胞中表达异源木糖异构酶序列的方法对本领域技术人员而言是熟知的。
[0046]因此，本发明 的细胞是重组细胞。也就是说，本发明的细胞包含下述核苷酸序列，或用下述核苷酸序列转化或遗传修饰过，所述核苷酸序列不天然存在于所考虑的细胞中。
[0047]用于在细胞中重组表达木糖异构酶酶以及用于对本发明的细胞进行其他遗传修饰的技术是本领域技术人员公知的。典型地，此类技术涉及用包含相关序列的核酸构建体转化细胞。此类方法可例如从标准手册中获知，例如Sambrook andRussel (2001)" Molecular Cloning:A Laboratory Manual (3rd edition), Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press 或 F.Ausubel et al.,eds., " Current protocols in molecular biology", Green Publishing and WileyInterscience, New York (1987) ?用于对真菌宿主细胞进行转化和遗传修饰的方法可从例如 EP-A-0635574、W098 / 46772、W099 / 60102、TOOO / 37671、W090 / 14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574 和 US6, 265，186 中获知。
[0048]大部分附加体Gpisomal)或2 μ质粒是相对不稳定的，在每个世代后在约10-2或更多细胞中丢失。即便是在选择性生长的条件下，仅60%到95%的细胞保留附加体质粒。大部分附加体质粒的拷贝数范围为每个cir+宿主细胞中10-40个。然而，质粒并非相等地分布于细胞间，并且种群中每个细胞的拷贝数存在高度变化。用整合性质粒转化的菌株极度稳定，即便是不存在选择性压力时也是如此。然而，质粒损失可通过随机重复的DNA之间的同源重组以约10_3到10_4的频率发生，所述同源重组导致载体序列的成环离开(loopingout)。优选地，稳定整合情况下的载体设计因而是，在选择标记物基因丢失(也可以通过分子内、同源重组发生)后，被整合的构建体的成环离开不再可能。优选地，所述基因因此被稳定整合。稳定整合在本文中被定义为整合进基因组中，其中被整合的构建体的成环离开不再可能。优选地，不存在选择标记物。
[0049]典型地，核酸构建体可以是质粒，例如低拷贝质粒或高拷贝质粒。根据本发明的细胞可包含单个或多个拷贝的编码木糖异构酶的核苷酸序列，例如通过使用多拷贝核苷酸构建体或通过使用具有多拷贝木糖异构酶序列的构建体来实现。
[0050]核酸构建体可以作为附加体维持，并因此包含用于自主复制的序列，比如常染色体复制序列序列。合适的附加体核酸构建体可以例如基于酵母2μ或PKDl质粒(Gleer etal., 1991, Biotechnology9:968_975)或 AMA 质粒(Fierro et al., 1995, Curr Genet.29:482-489)。或者，可以将每种核酸构建体以一个或多个拷贝整合进细胞的基因组中。进入细胞基因组的整合可通过非同源重组随机发生，但优选地，核酸构建体可以通过同源重组被整合进细胞的基因组中，如本领域所公知的(见，例如W090 / 14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574 和 US6, 265，186)。
[0051]典型地，木糖异构酶编码序列应当与能够提供或帮助木糖异构酶序列转录和/或翻译的一条或多条核酸序列可操作地连接。
[0052]术语“可操作地连接”是指下述并置(juxtaposition)，其中所述组分处于允许它们以期望的方式发挥作用的关系中。例如，启动子或增强子与编码序列可操作地连接，所述启动子或增强子影响所述编码序列的转录。
[0053]在本文中使用时，“启动子”是指下述核酸片段，其发挥控制一个或多个基因转录的功能，相对于基因转录起点的转录方向而言位于上游，并且在结构上通过DNA-依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起点和本领域技术人员已知的任何其它DNA序列的存在来识另O。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。
[0054]能够用于实现编码本发明酶的核苷酸序列表达的启动子对编码要表达的酶的核苷酸序列而言可以不是天然的，即对与之可操作地连接的核苷酸序列(编码序列)而言异源的启动子。然而，启动子对宿主细胞而言可以是同源的，即内源的。
[0055] 本文上下文中合适的启动子包括组成型和诱导型的天然启动子以及经改造的启动子，这是本领域技术人员公知的。真核宿主细胞中合适的启动子可以是GAL7、GALlO或GAL1、CYC1、HIS3、ADHl、PGL、PH05、GAPDH、ADCU TRPU URA3、LEU2、ENO1、TP11 和 AOXI。其它合适的启动子包括roCl、GPDl、PGKl、TEFl和TDH3。
[0056]在本发明的细胞中，编码木糖异构酶的核苷酸序列的3’ -端优选地与转录终止子序列可操作地连接。优选地，终止子序列在选择的宿主细胞、比如例如选择的酵母物种中是可操作的。在任何情况下终止子的选择不是关键性的；其可以例如来自于任何酵母基因，尽管如果来自于非酵母、真核基因时终止子有时可能发挥功能。通常，编码木糖异构酶的核苷酸序列包含终止子。优选地，这类终止子与预防本发明宿主细胞中无义介导的mRNA衰变的突变组合(见例如:Shirley et al.,2002, Geneticsl61:1465-1482)。
[0057]转录终止序列还优选地包含多聚腺苷酸化信号。
[0058]任选地，适用于本发明的核酸构建体中可存在可选择标记物。在本文中使用时，术语“标记物”是指编码性状或表型的基因，所述性状或表型允许选择或筛选含有所述标记物的宿主细胞。标记物基因可以是抗生素抗性基因，从而可使用适当的抗生素从未经转化的细胞中选择经转化的细胞。合适的抗生素抗性标记物包括例如二氢叶酸还原酶、潮霉素B磷酸转移酶、3' -O-磷酸转移酶II (卡那霉素、新霉素和G418抗性)。尽管对于多倍体宿主细胞的转化而言抗生素抗性标记物可以是最为便利的，然而优选地使用非抗生素抗性标记物，比如营养缺陷型标记物(URA3、TRP1、LEU2)或S.pombe TPI基因(由Russell P R，1985，Gene40:125-130描述)。在一个优选的实施方式中，用核酸构建体转化的宿主细胞是无标记物基因的。用于构建重组的无标记物基因的微生物宿主细胞的方法公开于EP-A-0635574中，并且基于双向标记物，比如A.nidulans amdS(乙酰胺酶)基因或酵母URA3和LYS2基因的使用。或者，可以将可筛选的标记物，比如绿色荧光蛋白、lacL、萤光素酶、氯霉素乙酰转移酶、葡萄糖苷酸酶并入本发明的核酸构建体中，允许筛选经转化的细胞。
[0059]可存在于适用于本发明的核酸构建体中任选的其它元件包括但不限于，一条或多条前导序列、增强子、整合因子、和/或报告基因、内含子序列、着丝点(centoomer)、调聚物和/或基质附着(MAR)序列。本发明的核酸构建体可还包含用于自主复制的序列，比如ARS序列。
[0060]优选地，木糖异构酶在胞质溶胶中表达。胞质溶胶表达可通过线粒体或过氧化物酶体靶向信号的缺失或修饰来实现。
[0061]本发明的细胞可以是任何合适的细胞，比如原核细胞比如细菌，或真核细胞。典型地，细胞会是真核细胞，例如酵母或丝状真菌。
[0062]酵母在本文中被定义为真核微生物，并且包括主要以单细胞形式生长的真菌亚门的所有物种(Alexopoulos, C.J., 1962, In JntroductoryMycology, John ffiley&Sons,Inc., New York)。
[0063]酵母可以通过单细胞原植体的出芽生长，或可通过生物的裂变生长。作为本发明细胞的一种优选的酵母可属于 Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia、Schizosaccharomyces、Hansenula、Kloeckera、Schwanniomyces 或 Yarrowia 属。优选地，酵母是能够厌氧发酵的酵母，更优选地是能够厌氧醇发酵的酵母。
[0064]丝状真菌在本文中被定义为下述真核微生物，其包括真菌亚门的所有丝状形式。这些真菌的特征是由甲壳质、纤维素和其它复合多糖组成的营养性菌丝体。
[0065]适合用作本发明细胞 的丝状真菌在形态学、生理和遗传上区别于酵母。可有利地使用丝状真菌细胞，因为大部分真菌不需要无菌条件来繁殖，并且对噬菌体感染敏感。丝状真菌的营养生长通过菌丝延长进行，并且大部分丝状真菌的碳代谢是专性需氧的。作为本发明宿主细胞的优选的丝状真菌可属于Aspergillus、Trichoderma、Humicola、Acremoniurra>Fusarium或Penicillium属。更优选地，丝状真菌细胞可以是Aspergillusniger、Aspergillus oryzae、Penicillium chrysogenum 或 Rhizopus oryzae 细胞。
[0066]许多年来，建议引入多种生物用于从作物糖生产生物乙醇。然而在实践中，所有主要的生物乙醇生产方法继续使用Saccharomyces属的酵母作为乙醇生产者。这归因于Saccharomyces物种对工业方法而言的许多有吸引力的特征，即高度耐酸、耐乙醇和耐渗透，厌氧生长的能力，当然及其高的醇发酵能力。作为宿主细胞的优选的酵母物种包括
S.cerevisiae>S.bulder1、S.barnett1、S.exiguus、S.uvarum>S.diastaticus、K.lactis、K.marxianus 或 K fragilis。
[0067]本发明的细胞可以能够将植物生物量、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油转化成例如可发酵的糖。因此，本发明的细胞可表达将纤维素转化为葡萄糖单体和将半纤维素转化为木糖和阿拉伯糖单体所需的一种或多种酶，比如纤维素酶(内切纤维素酶或外切纤维素酶)、半纤维素酶(内切或外切木聚糖酶或阿拉伯糖酶)、能够将果胶转化成葡糖醛酸和半乳糖醛酸的果胶酶，或能够将淀粉转化成葡萄糖单体的淀粉酶。
[0068]本发明的细胞优选地是能够将木糖主动或被动转运进入细胞的宿主。[0069]优选地，本发明的细胞:
[0070]能够进行主动糖酵解；和/或
[0071]显示经过戊糖磷酸通路的通量；和/或
[0072]展示木酮糖激酶活性，使得由木糖异构化而来的木酮糖可以被代谢成丙酮酸。
[0073]细胞还优选地包含将丙酮酸转化成期望的发酵产物，比如乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、反丁烯二酸、苹果酸、衣康酸(itaconic acid)、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素或头孢菌素所需的这些酶活性。
[0074]本发明的一种优选的细胞是天然能够进行醇发酵、优选地进行厌氧醇发酵的细胞。本发明的细胞优选地具有对乙醇的高度耐性、对低PH的高度耐性(即能够在低于约5、约4、约3或约2.5的pH下生长)和对有机酸如乳酸、乙酸或甲酸和/或糖降解产物，比如糠醛和羟基-甲基糠醛的高度耐性，和/或对提高的温度的高度耐性。
[0075]本发明细胞的任何上述特征或活性可以天然存在于细胞中，或者可以通过遗传修饰引入或修饰。
[0076]在经转化的宿主中，编码木糖异构酶的核苷酸序列典型地以活性形式被表达，或者能够以活性形式被表达。因此，宿主细胞中核苷酸序列的表达生产活性木糖异构酶，典型地其比活性在约30°C下为每mg蛋白质至少约IOU木糖异构酶活性,在约30°C下每mg优选地至少约20、至少约25、至少约30、至少约50、至少约100、至少约200、至少约300、至少约500、至少约750或至少约1000U。经转化的宿主细胞中表达的木糖异构酶的比活性在本文中被定义为宿主细胞无细胞裂解物(例如酵母无细胞裂解物)的每mg蛋白质的木糖异构酶活性单位的量。木糖异构酶活性的测定、蛋白质的量和无细胞裂解物的制备如本文所述。优选地，编码木糖异构酶的核苷酸序列在宿主细胞中的表达产生下述木糖异构酶，其对木糖的Km小于50、40、30或25mM，更优选地，`对木糖的Km约为20mM或更少。
[0077]本发明的细胞可包含一种或多种提高戊糖磷酸通路通量的遗传修饰。具体地，遗传修饰可导致通过戊糖磷酸通路非氧化性部分的通量提高。引起戊糖磷酸通路非氧化性部分通量提高的遗传修饰在本文中被理解为表示下述修饰，与除了引起通量提高的遗传修饰之外遗传上相同的菌株中的通量相比，所述修饰将所述通量提高至约1.1、约1.2、约1.5、约2、约5、约10或约20的倍数。戊糖磷酸通路非氧化部分的通量可以如下测量:在木糖作为唯一碳源时培养经修饰的宿主，测定木糖消耗的比速率,并在产生任何木糖醇时从木糖消耗的比速率中减去木糖醇生产的比速率。然而，戊糖磷酸通路非氧化部分的通量与木糖作为唯一碳源时的生长速率成比例，优选地与木糖作为唯一碳源时的厌氧生长速率成比例。木糖作为唯一碳源时的生长速率(μ_)和戊糖磷酸通路非氧化部分的通量之间存在线性相关。木糖消耗的比速率(Qs)等于生长速率(P)除以基于糖的生物量产率(Yxs)，因为基于糖的生物量产率是恒定的(在给定的一组条件下:厌氧、生长培养基、pH、菌株的遗传背景等JPQs=U /Yxs。因此，戊糖磷酸通路非氧化部分通量的提高可能演绎自这些条件下最大生产速率的提高，除非转运(摄取受到限制)。
[0078]可以通过多种方式在宿主细胞中引入提高戊糖磷酸通路通量的一种或多种遗传修饰。这些方式包括例如，实现木酮糖激酶和/或非还原性部分戊糖磷酸通路的一种或多种酶的更高的稳态活性水平，和/或非特异性醛糖还原酶活性的降低的稳态水平。稳态活性水平的这些改变可以通过(自发或化学诱导或辐射诱导的)突变体的选择和/或重组DNA技术(例如分别过表达或失活编码酶的基因或调节这些基因的因子)来实现。[0079]在一种优选的宿主细胞中，遗传修饰包括(非氧化部分)戊糖磷酸通路的至少一种酶的过表达。优选地，所述酶选自由编码核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、转酮酶和转醛酶的酶组成的组。可以过表达(非氧化性部分)戊糖磷酸通路的酶的多种组合。例如被过表达的酶可以至少是酶核酮糖-5-磷酸异构酶和核酮糖-5-磷酸差向异构酶；或至少是酶核酮糖-5-磷酸异构酶和转酮酶；或至少是酶核酮糖-5-磷酸-异构酶和转醛酶；或至少是酶核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转酮酶；或至少是酶核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转醒酶；或至少是酶转酮酶和转醒酶；或至少是酶核酮糖5-磷酸差向异构酶、转酮酶和转醛酶；或至少是酶核酮糖-5-磷酸异构酶、转酮酶和转醛酶；或至少是酶核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转醒酶；或至少是酶核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转酮酶。在本发明的一个实施方式中，酶核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、转酮酶和转醒酶的每一种都在宿主细胞中被过表达。更优选的是下述宿主细胞，其中遗传修饰至少包含酶转酮酶和转醛酶二者的过表达，因为这样的宿主细胞已经能够在木糖上厌氧生长。实际上，在一些条件下，仅过表达转酮酶和转醛酶的宿主细胞在木糖上已经具有与下述宿主细胞相同的厌氧生长速率，所述宿主细胞过表达所有四种酶，即核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、转酮酶和转醛酶。另外，过表达酶核酮糖-5-磷酸异构酶和核酮糖-5-磷酸差向异构酶二者的宿主细胞是超过下述宿主细胞而被优选的，所述宿主细胞仅过表达异构酶或仅过表达差向异构酶，因为这些酶中仅一种的过表达可产生代谢失衡。
[0080]酶“核酮糖-5-磷酸差向异构酶”(EC5.1.3.1)在本文中被定义为催化D-木酮糖5-磷酸差向异构化为D-核酮糖5-磷酸以及反向的酶。所述酶也已知为磷酸核酮糖(phosphoribulose)差向异构酶；赤藓糖_4_磷酸异构酶；磷酸酮戍糖3_差向异构酶；木酮糖磷酸3-差向异构酶；磷酸酮戊糖差向异构酶；核酮糖5-磷酸3-差向异构酶；D-核酮糖磷酸-3-差向异构酶；D-核酮糖5-磷酸差向异构酶；D-核酮糖-5-P3-差向异构酶；D-木酮糖-5-磷酸3-差向异构酶；戊糖-5-磷酸3-差向异构酶；或D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶。核酮糖5-磷酸差向异构酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，核酮糖5-磷酸差向异构酶可以通过编码酶的核苷酸序列定义，以及通过与编码核酮糖5-磷酸差向异构酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码核酮糖5-磷酸差向异构酶的核苷酸序列在本文中称作RPEl。
[0081]酶“核酮糖5-磷酸异构酶”(EC5.3.1.6)在本文中被定义为催化D-核糖5_磷酸直接异构化为D-核酮糖5-磷酸以及反方向的酶。所述酶也已知为磷酸戊糖异构酶；磷酸核糖异构酶；核糖磷酸异构酶；5_磷酸核糖异构酶；D-核糖5-磷酸异构酶；D-核糖-5-磷酸酮醇-异构酶；或D-核糖-5-磷酸醛糖-酮糖-异构酶。核酮糖5-磷酸异构酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，核酮糖5-磷酸异构酶可以通过编码所述酶的核苷酸序列以及与编码核酮糖5-磷酸异构酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码核酮糖5-磷酸异构酶的核苷酸序列在本文中称作RPII。
[0082]酶“转酮酶”(EC2.2.1.1)在本文中被定义为催化下述反应的酶:D_核糖5_磷酸+D-木酮糖5-磷酸< - >景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸以及反方向。所述酶也已知为羟乙醛转移酶或景天庚酮糖-7-磷酸:D-甘油醛-3-磷酸羟乙醛转移酶。转酮酶还可通过其氨基酸定义。类似地，转酮酶可以通过编码酶的核苷酸序列以及与编码转酮酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码转酮酶的核苷酸序列在本文中称作TKL1。
[0083]酶“转醛酶”(EC2.2.1.2)在本文中被定义为催化下述反应的酶:景天庚酮糖7_磷酸+D-甘油醛3-磷酸< -> D-赤藓糖4-磷酸+D-岩藻糖6-磷酸以及反方向。所述酶还已知为二羟基丙酮转移酶；二羟基丙酮合酶；甲醛转酮酶；或景天庚酮糖-7-磷酸:D-甘油醛-3-磷酸甘油酮转移酶。转醛酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，转醛酶可以通过编码酶的核苷酸序列以及与编码转醛酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码转酮酶的核苷酸序列在本文中称作TALl。
[0084]本领域技术人员已知用于在本发明的细胞中表达和过表达酶的多种手段。具体地，可以通过提高宿主细胞中编码酶的基因的拷贝数(例如通过在宿主细胞的基因组中整合额外的基因拷贝，通过表达来自附加体多拷贝表达载体的基因，或通过引入包含多拷贝基因的附加体表达载体)来过表达酶。
[0085]或者，可以通过使用对编码要过表达的酶的序列而言不是天然的启动子(即对与之可操作地连接的编码序列而言为异源的启动子)来实现本发明宿主细胞中酶的过表达。尽管启动子优选地对与之可操作地连接的编码序列而言是异源的，但是还优选启动子是同源的，即对宿主细胞而言是内源的。优选地，与对编码序列而言天然的启动子相比，异源启动子能够生产更高稳态水平的包含所述编码序列的转录本(或者每单位时间能够生产更多转录本分子，即mRNA分子)，优选地在可获得木糖或木糖与葡萄糖作为碳源、更优选地作为主要碳源(即多于50%可获得的碳源由木糖或木糖和葡萄糖组成)、最优选地作为唯一碳源的条件下。在本文上下文中，合适的启动子包括组成型和诱导型两种天然启动子，以及经改造的启动子。用于本发明中的一种优选的启动子还应当对代谢产物(葡萄糖)阻抑不敏感，和/或应当优选地不需要木糖来诱导。具有这些特征的启动子是可广泛获得的，并是对技术人员而言已知的。这类启动子的合适例子包括例如来自糖酵解基因的启动子，比如来自酵母或丝状真菌的果糖磷酸激酶(PKF)、丙糖磷酸异构酶(TPI)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD、TDH3或GAPDH)、丙酮酸激酶(PYK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子；关于来自酵母的这类启动子的更多细节可在(W093 / 03159)中找到。其它有用的启动子是核糖体蛋白编码基因的启动子、乳糖酶基因启动子(LAC4)、醇脱氢酶启动子(ADH1、ADH4等等)和烯醇化酶启动子(ENO)。其它(组成型以及诱导型)启动子和增强子或上游活化序列应当是本领域技术人员已知的。本发明宿主细胞中使用的启动子可以在需要时被修饰，来影响它们的控制特征。
[0086]用于上述酶过表达的编码序列可优选地对本发明的宿主细胞而言是同源的。然而，可以使用对本发明宿主细胞而言异源的编码序列。
[0087]涉及经遗传修饰的宿主细胞中酶的生产时，酶的过表达表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比，所述酶以更高水平的酶比活性被生产。通常，这表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比酶活性蛋白质(或在多亚基酶的情况下多种蛋白质)以更大量被生产，或者以更高的稳态水平被生产。类似地，这通常表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比，编码酶活性蛋白质的mRNA以更大量被生产，或者也以更高的稳态水平被生产。因此，优选地使用本文所述的适当酶测定法，通过测量宿主细胞中的酶比活性水平，来测定酶的过表达。或者，可以例如使用酶的特异性抗体，通过量化酶蛋白质的比稳态水平，或者通过定量编码所述酶的mRNA的比稳态水平，来间接测定酶的过表达。后者可尤其适用于戊糖磷酸通路，对所述戊糖磷酸通路而言酶测定法不是容易可行的，因为所述酶的底物不可商业获得。优选地，在本发明的宿主细胞中，与除了引起过表达的遗传修饰之外在遗传上相同的菌株相比时，要过表达的酶被过表达至至少约1.1、约1.2、约1.5、约2、约5、约10或约20的倍数。应当理解这些过表达水平可适用于酶活性的稳态水平，酶蛋白质的稳态水平以及编码酶的转录本的稳态水平。
[0088]本发明的细胞可包含提高特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传修饰。优选地，所述一种或多种遗传修饰引起木酮糖激酶的过表达，例如通过编码木酮糖激酶的核苷酸序列的过表达来实现。编码木酮糖激酶的基因对宿主细胞而言可以是内源的，或者可以是对宿主细胞异源的木酮糖激酶。用于本发明宿主细胞中木酮糖激酶过表达的核苷酸序列是编码具有木酮糖激酶活性的多肽的核苷酸序列。
[0089]酶“木酮糖激酶”(EC2.7.1.17)在本文中被定义为催化反应ATP+D-木酮糖=ADP+D-木酮糖5-磷酸的酶。所述酶还已知为磷酸化木酮糖激酶、D-木酮糖激酶或ATP:D-木酮糖5-磷酸转移酶。本发明的木酮糖激酶还可以通过其氨基酸序列定义。类似地，木酮糖激酶可以通过编码所述酶的核苷酸序列以及与编码木酮糖激酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。
[0090]在本发明的细胞中，提高特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传修饰可以与上文所述提高戊糖 磷酸通路通量的任何修饰组合。然而，这不是必需的。
[0091]因此，本发明的宿主细胞可仅包含提高特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传修饰。用于实现和分析本发明宿主细胞中木酮糖激酶过表达的本领域可获得的多种手段与上文针对戊糖磷酸通路酶所述相同。优选地，在本发明的宿主细胞中，与除了引起过表达的遗传修饰之外在遗传上相同的菌株相比，要过表达的木酮糖激酶被过表达至少约1.1、约
1.2、约1.5、约2、约5、约10或约20的倍数。还应当理解这些过表达水平可适用于酶活性的稳态水平，酶蛋白质的稳态水平以及编码酶的转录本的稳态水平。
[0092]本发明的细胞可包含降低宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性的一种或多种遗传修饰。优选地，通过一种或多种下述遗传修饰降低宿主细胞中的非特异性醛糖还原酶活性，所述遗传修饰降低编码非特异性醛糖还原酶的基因的表达或使其失活。优选地，所述遗传修饰使宿主细胞中编码非特异性醛糖还原酶的基因的每种内源拷贝的表达降低或失活。宿主细胞可由于二倍性、多倍性或非整倍性而包含多拷贝的编码非特异性醛糖还原酶的基因，和/或宿主细胞可含有具有醛糖还原酶活性的若干不同的(同工)酶，所述酶氨基酸序列不同并且各自由不同基因编码。还在这类情况下，优选地编码非特异性醛糖还原酶的每种基因的表达被降低或失活。优选地，通过缺失基因的至少一部分或者通过破坏基因使基因失活，其中在该语境中，术语基因还包括编码序列上游或下游的任何非编码序列，其(部分)缺失或失活导致宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性表达的降低。
[0093]编码要在本发明宿主细胞中降低其活性的醛糖还原酶的核苷酸序列是编码具有醛糖还原酶活性的多肽的核苷酸序列。
[0094]在本发明的宿主细胞中，降低宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性的遗传修饰可以与上文所述提高戊糖磷酸通路通量的任何修饰和/或提高上述宿主细胞中特异性木酮糖激酶活性的任何修饰组合。然而，这不是必需的。[0095]因此，仅包含下述一种或多种遗传修饰的本发明的宿主细胞明确地包括在本发明中，所述修饰降低宿主细胞中的非特异性醛糖还原酶活性。
[0096]酶“醛糖还原酶”(EC1.1.1.21)在本文中被定义为能够将木糖或木酮糖还原为木糖醇的任何酶。在本发明的语境中，醛糖还原酶可以是对本发明宿主细胞而言天然(内源)的并且能够将木糖或木酮糖还原为木糖醇的任何非特异性醛糖还原酶。非特异性醛糖还原酶催化反应:
[0097]1?;糖+NAD (P) H+H 4.^ 糖醇+NAD (P) +
[0098]所述酶具有广泛特异性并且也已知为醛糖还原酶；多元醇脱氢酶(NADP+);糖醇:NADP氧化还原酶；糖醇=NADP+1-氧化还原酶；NADPH_戊醛糖还原酶；或NADPH-醛糖还原酶。
[0099]这类非特异性醒糖还原酶的一个具体的例子对S.cerevisiae而言是内源的并且是由 GRE3 基因编码的醒糖还原酶(Traff et al., 2001, Appl.Environ.Microbiol.67:5668-74)。因此，本发明的醛糖还原酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，醛糖还原酶可以通过编码酶的核苷酸序列以及与编码醛糖还原酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。
[0100]可以针对在木糖上、优选地木糖作为唯一碳源上、更优选地在厌氧条件下的生长，来选择自发或(例如通过辐射或化学品)诱导的突变体，使本发明的细胞适应木糖使用。突变体的选择可以通过包括例如Kuyper等人(2004, FEMS Yeast Res.4:655_664)所述的培养物连续传代在内的技术来进行，或者通过在恒化器培养中的选择压力下培养来进行。在本发明的一种优选的宿主细胞中，至少一种上述遗传修饰(包括通过突变体选择获得的修饰)赋予宿主细胞在木糖作为碳源、优选地作为唯一碳源时、并且优选地在厌氧条件下生长的能力。优选地，经修饰的宿主细胞基本上不生产木糖醇，例如生产的木糖醇低于检出界限，或者例如以摩尔为基础少于消耗的碳的约5%、约2%、约I %、约0.5%或约0.3%。
[0101]本发明的细胞可具有在木糖作为唯一碳源时在需氧条件下以至少约0.05、约
0.1、约0.2、约0.25或约0.3h-1的速率，或可行时在厌氧条件下以至少约0.03、约0.05、约
0.07、约0.08、约0.09、约0.1、约0.12、约0.15或约0.2h-1的速率生长的能力。优选地，经修饰的宿主细胞具有在葡萄糖和木糖(重量比1:1)混合物作为唯一碳源时在需氧条件下以至少约0.05、约0.1、约0.2、约0.25或约0.3h-1的速率，或可行时在厌氧条件下以至少约0.03、约0.05、约0.1、约0.12、约0.15或约0.2h-1的速率生长的能力。
[0102]本发明的细胞可具有至少约200、约250、约300、约346、约350、约400、约500、约600、约750或约1000mg木糖/ g细胞/ h的木糖比消耗速率。本发明的细胞在木糖上发酵产物(比如乙醇)的产率至少是宿主细胞在葡萄糖上发酵产物(比如乙醇)产率的约40%、约 50%、约 55%、约 60%、约 70%、约 80%、约 85%、约 90%、约 95%、约 98%或约 99%。更优选地，本发明的细胞在木糖上发酵产物(比如乙醇)的产率等于细胞在葡萄糖上发酵产物(比如乙醇)的产率。类似地，细胞在木糖上生物量的产率至少是宿主细胞在葡萄糖上生物量产率的约40%、约50%、约55%、约60%、约70%、约80%、约85%、约90%、约95%、约98%或约99%。更优选地，细胞在木糖上生物量产率可等于宿主细胞在葡萄糖上的生物量产率。应当理解，在葡萄糖和木糖上产率的比较中，两种产率均在需氧条件下比较或均在厌氧条件下比较。[0103]本发明的细胞可以能够使用阿拉伯糖。因此，本发明的细胞因此可以能够将L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或需要的发酵产物，例如本文提到的发酵产物之一。
[0104]能够从L-阿拉伯糖生产乙醇的生物例如S.cerevisiae菌株可以通过修饰细胞，引入来自合适来源的araA(L_阿拉伯糖异构酶)、araB(L_核酮糖激酶)和araD(L_核酮糖-5-P4-差向异构酶)基因来产生。这类基因可被引入本发明的细胞中，使其能够使用阿拉伯糖。这样的途径描述于W02003 / 095627中。
[0105]本发明的细胞可以是适合生产乙醇的细胞。然而，本发明的细胞可适用于生产除乙醇以外的发酵产物。这类非乙醇发酵产物原则上包括可由真核微生物，比如酵母或丝状真菌生产的任何大宗化学品(bulk chemical)或精细化学品。
[0106]这类发酵产物可以是，例如丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素或头孢菌素。用于生产非乙醇发酵产物的一种优选的本发明经修饰的宿主细胞是下述宿主细胞，所述宿主细胞含有导致降低的醇脱氢酶活性的遗传修饰。
[0107]在又一个方面中，本发明涉及多种发酵方法，其中使用本发明经修饰的宿主细胞来发酵包含木糖来源的碳源，比如木糖。除了木糖来源以外，发酵培养基中的碳源还可包含葡萄糖来源。木糖或葡萄糖来源可以是原样的木糖或葡萄糖，或者可以是包含木糖或葡萄糖单元的任何碳水化合物寡聚体或多聚体，比如例如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉等等。为了从这类碳水化合物释放木糖或葡萄糖单元，可以向发酵培养基中添加或者可由经修饰的宿主细胞生产适当的糖酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等等)。在后一情况下，经修饰的宿主细胞可以被遗传改造为生产和分泌这类碳水化合物。使用葡萄糖的寡聚体或多聚体来源的一个额外的优点是其例如通过使用限速量的碳水化合物，使得能够在发酵期间维持(更)低的游离葡萄糖浓度。这随即会预防对非葡萄糖的糖(比如木糖)代谢和转运所需的系统的阻抑。
[0108]在一种优选的方法中，经修`饰的宿主细胞发酵木糖以及葡萄糖，优选地同时发酵，在这种情况下优选地使用下述经修饰的宿主细胞，所述宿主细胞对葡萄糖阻抑不敏感从而防止两阶段生长(diauxic growth) 0除了作为碳源的木糖(和葡萄糖)来源以外，发酵培养基还会包含经修饰的宿主细胞生长所需的适当成分。用于微生物(比如酵母)生长的发酵培养基的组成是本领域公知的。发酵方法是用于生产以下发酵产物的方法，比如例如乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β -内酰胺抗生素，比如青霉素G或青霉素V及其发酵衍生物，和头孢菌素。
[0109]发酵方法可以是需氧或厌氧的发酵方法。厌氧发酵方法在本文中被定义为在不存在氧时运行的发酵方法，或者其中基本不消耗氧，优选地消耗少于约5、约2.5或约Immol /L / h，更优选地消耗Ommol / L / h(即，氧消耗不可检出)的发酵方法，并且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种用途。在不存在氧时，糖酵解和生物量形成中产生的NADH不能够被氧化磷酸化氧化。为了解决这一问题，许多微生物使用丙酮酸或其衍生物之一作为电子和氢受体，从而再生NAD+。
[0110]因此，在一种优选的厌氧发酵方法中，丙酮酸被用作电子(和氢受体)，并且被还原成发酵产物，比如乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。
[0111]发酵方法优选地在对经修饰的宿主细胞而言最适的温度下进行。因此，对大部分酵母或真菌宿主细胞而言，发酵方法在低于约42°c、优选地低于约38°C的温度下进行。对酵母或丝状真菌宿主细胞而言，发酵方法优选地在低于约35、约33、约30或约28°C的温度且高于约20、约22或约25 °C的温度下进行。
[0112]一种优选的方法是用于生产乙醇的方法，其中所述方法包括步骤:(a)用上文定义的经修饰的宿主细胞发酵含有木糖来源的培养基，其中所述宿主细胞将木糖发酵成乙醇；和任选地(b)回收乙醇。所述发酵培养基可还包含也被发酵成乙醇的葡萄糖来源。在所述方法中，体积乙醇生产力优选地为至少约0.5、约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约5.0或约10.0g乙醇/升/小时。所述方法中基于木糖和/或葡萄糖的乙醇产率至少约50 %、约60 %、约70 %、约80 %、约90 %、约95 %或约98 %。乙醇产率在本文中被定义为理论最大产率的百分比。
[0113]本发明还涉及 用于生产发酵产物、比如选自下组的产物的方法，所述组由丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素和头孢菌素组成。所述方法优选地包含用上文定义的经修饰的宿主细胞发酵含有木糖来源的培养基，其中所述宿主细胞将木糖发酵成所述发酵产物。
[0114]本发明还提供了用于生产发酵产物、比如选自下组的产物的方法，所述组由乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β -内酰胺抗生素和头孢菌素组成。所述方法优选地包含用上文定义的能够使用木糖以及L-阿拉伯糖二者的细胞发酵至少含有木糖来源和L-阿拉伯糖来源的培养基，从而所述细胞将木糖和L-阿拉伯糖发酵成所述发酵产物。
[0115]本发明还提供了用于生产发酵产物、比如选自下组的产物的方法，所述组由乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素和头孢菌素组成。所述方法优选地包含用上文定义的细胞和能够使用L-阿拉伯糖的细胞发酵至少含有木糖来源和L-阿拉伯糖来源的培养基，其中每种细胞将木糖和/或L-阿拉伯糖发酵成所述发酵产物。
[0116]本发明的方法还可包含发酵产物的回收。进行所述方法的培养基也可含有葡萄糖来源。
[0117]根据本发明的方法可以在需氧和厌氧条件下进行。优选地，所述方法在微需气(aerophilic)或氧受限的条件下进行。
[0118]厌氧发酵方法在本文中被定义为在不存在氧时进行的发酵方法，或其中基本不消耗氧，优选地消耗少于约5、约2.5或约lmmol / L / h的发酵方法，并且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种作用。
[0119]氧受限的发酵方法是下述方法，其中氧消耗受到从气体到液体的氧转移的限制。氧受限的程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际混合/物量转移特性决定。优选地，在氧受限条件下的方法中，氧消耗速率为至少约5.5、更优选地至少约6、如至少 7mmol / L / h。[0120]以下述实施例阐述本发明:
实施例
[0121]一般分子生物学技术
[0122]除非另有说明，使用的方法是标准生物化学技术。合适的一般方法论教科书的例子包括 Sambrook 等，Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989)和 Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley&Sons, Inc。
[0123]如实施例中所示的，使用补充有糖的Verduyn培养基(Verduyn，1992)或YEPh-培养基(IOg / I酵母提取物，20g / I植物蛋白胨)进行生长实验。对于固体YEPh培养基而言，灭菌之前将20g / I的琼脂添加到液体培养基中。
[0124]用环状DNA转化酵母细胞
[0125]在质粒DNA 的情况下，根据 Chen 等人(Current Genetics (1992), Volume21,Number 1,83-84)描述的方法，进行酵母转化。
[0126]通过电穿孔用线形DNA片段转化酵母细胞
[0127]通过用单酵母菌落对含2%葡萄糖的25 ml YEPh-培养基接种，来培养酵母细胞。将烧瓶在30°C、280rpm下孵育过夜。
[0128]测定600nm下的光密度值并且将获得0.2的光密度值所需的量转移至有2%葡萄糖的100ml YEPh-培养基中。将细胞在30°C、280rpm下培养4到5个小时，以实现约1.2到1.3的光密度值，这相当于2到3个世代。通过离心收集细胞并在28ml TE(IOmM Tris.HCl，ImM EDTA,pH7.5)中再悬浮。添加3ml的IM LiAC溶液( 用稀释的HAc设定为ρΗ7.5)。将细胞在旋转式孵育器中轻轻摇动(30°C、150rpm)45分钟。添加500 μ I的IM DTT (二硫苏糖醇)溶液后，将细胞在这些条件下再次孵育15分钟。用无菌、冰冷的milliQ水将体积补至100ml。通过离心收集细胞。
[0129]将上清液丢弃并用50ml无菌、冰冷的milliQ水洗涤成团的细胞，并通过离心收集。随后的洗涤处理用30ml冰冷的IM山梨糖醇溶液处理。离心之后，丢弃上清液并将成团的细胞再悬浮在4ml冰冷的IM山梨糖醇溶液中。离心之后，丢弃上清液并将成团的细胞再悬浮在300 μ I冰冷的IM山梨糖醇溶液中。
[0130]对于每次转化，将40 μ I的细胞悬浮液转移进冰冷的Eppendorf管中。添加转化用DNA和5 μ g鲑鱼精DNA (作为载体DNA)，合起来最大体积为20 μ I。DNA应当溶于TE中。小心敲打Eppendorf管以将内容物轻轻地混合。随后，将内容物转移至(在冰上)预冷的有0.2cm孔隙的电穿孔试管中，并(使用例如BioRad电穿孔装置)应用在1.5kV，2000hm和25 μ F下的脉冲。脉冲时间应为约5ms。
[0131]将细胞立即转移至200 μ I的IM山梨糖醇中。随后，添加4ml的YEPh2%葡萄糖，并将细胞悬浮液在30°C下孵育I小时。I小时之后，通过离心收集细胞，丢弃上清液并将球团再悬浮在4ml的IM山梨糖醇中。再次通过离心收集细胞,弃去上清液并将球团悬浮在300 μ IlM的山梨糖醇中。将细胞适当稀释并用在选择培养基中。
[0132]乙醇牛产
[0133]通过用冷冻的培养物原液或来自琼脂平板的单菌落对于100ml摇瓶中的补充有2%葡萄糖的 25ml Verduyn-培养基(Verduyn 等人，Yeast8:501-517, 1992)接种，制备预培养物。30°C下在轨道摇床(280rpm)中孵育约24小时后，收获这种培养物并用于测定二氧化碳释放量(carbon dioxide evolution)和用于乙醇生产实验。
[0134]在BAM(Biological Activity Monitor, Halotec,荷兰)中 30 °C 下在 100ml 合成模式培养基(有5%葡萄糖、5%木糖、3.5%阿拉伯糖、I %半乳糖和0.5%甘露糖的Verduyn-培养基(Verduyn等人，Yeast8:501-517, 1992)中进行乙醇生产的培养。在灭菌之前，用2M NaOH / H2SO4将培养基的pH调至4.2。对厌氧培养的合成培养基补充溶于乙醇的 0.01g / I 麦角留醇和 0.42g / I Tween80 (Andreasen and Stier.J.Cell Physiol.41:23-36，1953 ;and Andreasen and Stier.J.Cell Physiol.43:271-281,1954)。在约 2 的初始OD-下对培养基接种。通过磁性搅拌器搅拌培养物。厌氧条件在发酵期间快速发展，因为培养未被通气。持续监测二氧化碳生产。通过NMR分析糖转化和产物形成(乙醇，甘油)。通过观察LKB Ultrospec K分光光度计上的600nm下的培养物的光密度值，来监测生长。
[0135]实施例1
[0136]木糖异构酶表达载体的构建
[0137]基于之前的氨基酸序列设计合成的密码子对优化的xylA基因，并通过GeneArt (Regensburg，德国)合成。如前面所述(W02008000632)的进行密码子对优化。在此包括作为SEQ ID NOl的核苷酸序列和对应的作为SEQ ID N02的氨基酸序列。
[0138]使用限制性酶SpeI和XmaI将开放读码框克隆进酵母穿梭载体p427_TEF(图1 ;DualSystems Biote ch, Schlieren,瑞士)中。
[0139]质粒被称为PPWT215。
[0140]实施例2
[0141]用pPWT215 转化 BIE104P1
[0142]使用Chen等人(1992)所描述的一步法酵母转化方法，用质粒pPWT215
转化如 W02009109633 中所述的 S.cerevisiae 菌株-BIE104P1 (MATa
URA3HIS3LEU2TRP1MAL2-8SUC2GRE3::[TPIlp-TALl_ADHlp-TKLl_PGIIp-RPE1_ENOlp-RKIl])，其中GRE3-基因被戊糖磷酸通路非氧化部分的基因所代替。使用milliQ作为阴性对照。将转化程序的最终球团再悬浮在Iml的YEPh2%葡萄糖(见上述)中。将50 μ I的该转化混合物在补充有2%葡萄糖和200 μ g G418 / ml的YEPh琼脂平板上涂板。剩余的950 μ I被转移至含有补充有2%木糖、10 μ g G418 / ml和250 μ I的Pen-Str印溶液(Gibco / Invitrogen)的 25ml Verduyn 培养基的 100ml 摇瓶中。在 30°C和 280rpm 下于旋转摇床中孵育接种的摇瓶(模拟转化和质粒转化)。随着时间观察光密度值。
[0143]实施例3
[0144]生长实验
[0145]转化之后的生长实验的进展在图2中示出。
[0146]在生长实验的头10天期间，培养物的600nm下的光密度值几乎不增加。20天之后(在图2中用“I”表示)，质粒转化的细胞培养物的光密度值达到大于20的值。随后，将一定量的培养物转移至新鲜的25ml Verduyn培养基的等分试样(含有2%木糖、10 μ gG418 / ml和250 μ I Pen-Strep)中。从图2中清楚地看出，成功进行了 4次转移。在存在空气的情况下进行生长实验，第四次转移之后的最后一次培养例外，所述最后一次培养在有水锁(厌氧条件)的摇瓶中进行。
[0147]从图2中可推断出，用pPWT215转化的菌株BIE104P1酵母细胞已获得了利用木糖作为唯一碳源和能量来源的能力，而模拟转化的相同菌株的酵母细胞没有显示光密度值增加，因而不能在木糖上生长。
[0148]实施例4
[0149]构建发酵戊糖的细胞
[0150]S.cerevisae 菌株是菌株 BIE201 的衍生菌株。在 PCT / EP2011 / 056242 的实施例7中描述了该菌株的构建。这是下述菌株BIE201与适应性进化之前的其亲本菌株BIE104A2Pla的回交结果，所述菌株BIE201通过用于有效阿拉伯糖发酵的转化和适应性进化而被优化。菌株BIE292组成型表达来自Lactobacillus pi ant arum的基因araA、araB和araD和非氧化戊糖磷酸通路基因TAL1、TKL1、RPE1和RKII，并且缺失编码醛糖还原酶的GRE3基因。此外，BIE292具有GAL80基因中的SNP (核苷酸改变A436C，其中起始密码子ATG的A是I)和在染色体VII上的该阿拉伯糖表达盒的扩增。
[0151]随后，用密码子对优化的xylA基因的PCR片段(包括启动子和终止子序列，侧翼是与基因组中Tyl序列的IOObp重叠区)转化菌株BIE292。使用pPWT215作为模板通过PCR扩增xylA表达盒。根据供应商的说明书，使用引物序列SEQ ID N03和SEQ ID N04，使用Phusion DNA聚合酶(Finnzymes),进行PCR反应。对扩增的表达盒进行乙醇沉淀并在使用前存储于_20°C下。
[0152] 通过离心收集沉淀的DNA并且用70%乙醇洗涤DNA球团，随后晾干。DNA以约I μ gDNA / μ I的浓度溶于TE-缓冲液。
[0153]将酵母菌株ΒΙΕ292在含有2%葡萄糖的YEPh-培养基中培养。如上所述的，制备感受态细胞用于电穿孔。将感受态细胞用20μ8 PCR产物转化。使用milliQ水作为阴性对照。
[0154]将XyIA-转化和模拟转化二者的转化混合物直接转移到各含有补充有2%木糖和250 μ I pen / strep的25ml Verduyn培养基的4个不同的摇瓶中。因为不使用显性选择标记物，所以转化后不对平板上正确转化体进行选择。
[0155]在30°C和280rpm下于旋转摇床中孵育8个摇瓶。通过经常测量600nm下的光密度值来监测生长。
[0156]实施例5
[0157]发酵戊糖的酵母菌株的选择和表征
[0158]如果实施例4中所述的培养物已在600nm下达到了大于15的光密度值，将250 μ I的等分试样转移至含有补充有2%木糖的Verduyn培养基的摇瓶中。经常监测600nm下的光密度值。使用光密度数据测定生长速率。
[0159]在含木糖的培养基上接种若干个循环之后，使用含有2%阿拉伯糖作为碳源的Verduyn培养基，以保持对阿拉伯糖利用的选择压力。类似地，使用含有下述Verduyn培养基的摇瓶，所述Verduyn培养基补充有己糖(即葡萄糖、半乳糖和/或甘露糖)和戍糖(即阿拉伯糖和/或木糖)混合物。在阿拉伯糖和木糖二者上，最初在需氧条件下进行培养实验，但随后例如当生长速率超过约0.07 /小时或更高的值时，在厌氧条件下进行培养实验。[0160]在厌氧条件下培养且再接种若干个循环后，将培养物的一份等分试样稀释至每毫升约100-1000个菌落形成单位(CFU)并随后将10-100 μ I的等分部分在含有2%葡萄糖的YEPh-琼脂平板上涂板。将平板在30°C下孵育至少48小时，或直到单菌落可见。
[0161]在BAM中测试单菌落隔离物(见上文)。基于如从二氧化碳谱和糖、乙醇和副产物的NMR数据推断的高效发酵所有五种糖的能力，选择单菌落隔离物。
[0162]通过对本领域技术人员而言已知的遗传和分子生物学技术，比如PCR、Southern印迹、FIGE和再测序，表征最优菌株。
[0163]实施例6
[0164]发酵戊糖的酵母菌株的选择和表征
[0165]当实施例4中所述的培养物已在600nm下达到大于10的光密度值时，将25 μ I的等分试样转移到含有补充有2%木糖的Verduyn培养基的摇瓶中。经常监测光密度值并使用这些数据测定生长速率。当培养物在600nm下达到大于15的光密度值时，将培养物的等分试样转移到含有补充有2%木糖的Verduyn培养基的摇瓶，并将摇瓶用能实现厌氧培养的水锁来封闭。从此时起，在30°C和IOOrpm下于轨道摇床中进行孵育。通过测量600nm下的光密度值监测培养物的生长，并且基于这些数据计算生长速率。当培养物的600nm下的光密度值达到大于3.75的值时，将培养物的等分试样转移到含有补充有2%阿拉伯糖的Verduyn培养基的摇瓶中。将摇瓶用水锁封闭。600nm下培养物达到光密度值大于5的值的情况下，将培养物的等分试样再次转移到含有补充有2%木糖的Verduyn培养基的摇瓶中，并将摇瓶用水锁封闭。该生长实验的典型的结果在图3中给出。
[0166]从图3清楚 地看出，用来自Clostridium beyerinckii的XylA对BIE292的转化使得该菌株快速获得消耗木糖的表型，而模拟转化不会导致消耗木糖的细胞。
[0167]表1列出了用来自若干生物体的木糖异构酶基因转化的S.cerevisiae菌株的生长速率。转化后当在作为唯一碳源的木糖上初始生长后，菌株BIE292XI (C.beyerinckii)表示在需氧条件下的最大生长速率。此外，BIE292XI (C.beyerinckii)是能在厌氧条件下在木糖上生长而进行没有广泛的进化工程改造的唯一菌株。
[0168]表1:当在木糖上初始生长后，BIE292XI(C.beyerinckii)的生长速率和用Clostridium phytofermentans (参照 I)、Orpinomyces (参照 2)、Piromyces (RWB202)(参照 3)和 Thermus thermophilus (参照 4)的 XI 转化的 Saccharomyces cerevisiae 菌株的
公众可得到的数据。
[0169]
木糖异构酶[1S|11

C.beyerincki0.061h_10.056h_1

C.phytofermentans0.039h_1—
Orpinomyces0.01h"1--
Piromvces0.005h_1--
T.thermophilus——
[0170]上表中列出的数据都获得自不同的菌株背景。一表示未测量出或未检测出。对于负载来自τ.thermophilus的XI的S.cerevisiae菌株,应当注意到,观察到木糖的消耗,但是消耗水 平太低以致不能支持生长。
【权利要求】
1.包含编码木糖异构酶的核苷酸序列的细胞，其中所述木糖异构酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2中示出的氨基酸序列具有至少75%的序列同一性，并且其中所述核苷酸序列对所述宿主来说是异源的。
2.根据权利要求1的细胞，其为酵母细胞。
3.根据权利要求1或2的细胞，其中所述编码木糖异构酶的核苷酸序列可获得自Clostridium属的细胞。
4.根据权利要求2或3的细胞,所述细胞是Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia>Schizosaccharomyces>Hansenula>Klockera>Schwanniomyces 或 Yarrowia 属的酵母细胞。
5.根据权利要求4的细胞，其中所述酵母细胞是物种S.cerevisiae、S.bulder1、S.barnett1、S.exiguus、S.uvarum>S.diastaticus、K.lactis、K.marxianus 或 K.fragilis的酵母细胞。
6.根据前述权利要求中任一项的细胞，其中所述细胞包含一种或多种遗传修饰，所述遗传修饰导致: a.所述细胞中木糖转运提高； b.木酮糖激酶活性提高； c.通过戊糖磷酸途径的通量提高； d.醛糖还原酶活性降低； e.对分解代谢物阻遏的敏感性降低； f.对乙醇、渗量或有机分子的耐性提高；或 g.副产物的生产减少。
7.根据权利要求6的细胞，其中所述一种或多种遗传修饰导致编码戊糖磷酸通路的非氧化部分的酶的至少一种基因的过表达。
8.根据权利要求7的细胞，其中所述基因是编码核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、转酮酶或转醛酶的基因。
9.根据权利要求6至8中任一项的细胞，其中所述一种或多种遗传修饰导致编码木酮糖激酶的基因过表达。
10.根据权利要求6至9中任一项的细胞，其中所述一种或多种遗传修饰导致所述细胞中非特异性醛糖还原酶活性的降低。
11.前述权利要求中任一项的细胞，所述细胞具有使用L-阿拉伯糖的能力，其中基因TALK TKLU RPEl 和 RKIl 被过表达。
12.根据权利要求6至11中任一项的细胞，其中GRE3-基因的编码区通过用包含基因TALl、TKLl、RPEl和RKIl的核苷酸序列来代替所述编码区而被失活。
13.根据权利要求6至12中任一项的细胞,其中来自Lactobacilluspi ant arum的基因araA、araB和araD被表达。
14.根据权利要求6至13中任一项的细胞，其中一种或多种组成型表达或组成型过表达的基因被稳定整合进所述细胞的基因组中。
15.用于生产发酵产物的方法，所述方法包括用根据前述权利要求中任一项的细胞发酵含有木糖来源的培养基，使得所述细胞将木糖发酵成为所述发酵产物。
16.根据权利要求15的方法，其中所述发酵产物是乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、丁醇、β -内酰胺抗生素和头孢菌素。
17.根据权利要求15或16的方法，其中所述方法是厌氧的。
【文档编号】C12N15/52GK103717733SQ201280037246
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2012年8月2日 优先权日:2011年8月4日
【发明者】保罗·克莱斯森, 芮妮·马赛尔·德·钟, 吉斯博蒂娜·皮特奈拉·范·苏勒库姆 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司