导入了二氧化碳的固定途径的微生物的制作方法
【专利摘要】本发明要解决的问题在于提供利用二氧化碳高效地生成乙酰CoA的乙酰CoA生产微生物及使用其的物质生产方法。本发明的乙酰CoA生产微生物具有乙酰CoA生产循环，所述乙酰CoA生产微生物是通过赋予选自苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛连接酶、2－羟基－3－氧代丙酸还原酶、及羟基丙酮酸还原酶中的至少一种酶活性而得到的。
【专利说明】导入了二氧化碳的固定途径的微生物
【技术领域】
[0001]本发明涉及乙酰CoA生产微生物及使用其的物质生产方法。
【背景技术】
[0002]乙酰CoA是微生物的代谢途径中的极其重要的中间体之一。各种代谢产物经由乙酰CoA被生产。作为这样的经由乙酰CoA被生成的物质的例子，例如已知L 一谷氨酸、L -谷氨酰胺、L 一脯氨酸、L 一精氨酸、L 一亮氨酸、L 一异亮氨酸等氨基酸类；乙酸、丙酸、丁酸、己酸、柠檬酸、3 —羟基丁酸、3 —羟基异丁酸、3 —氨基异丁酸、2 —羟基异丁酸、甲基丙烯酸及聚一 3 —羟基丁酸等有机酸类；异丙醇、乙醇、丁醇等醇类；其他如丙酮、聚谷氨酸等。
[0003]在多数微生物的情况下，乙酰CoA以葡萄糖等糖为碳源进行生产。糖首先经过埃姆登.迈耶霍夫途径(Embden — Meyerhof pathwa y)、恩特纳?杜多罗夫途径(Entner —Doudoroff pathway)、戍糖磷酸途径(pentose phosphate pathway)等被称为糖酵解系统的代谢途径而被转化为丙酮酸。然后，在丙酮酸脱羧酶、丙酮酸一甲酸裂解酶等的作用下，被转化为乙酰CoA。此时，二氧化碳、甲酸作为副产物而被生产，损失一部分来自糖的碳。因此，为了将二氧化碳再固定来增加乙酰CoA的产量，进行了一些研究。
[0004]已知一些在微生物的体内固定二氧化碳而作为碳源的途径(Ap p1.Environ.Microbiol.77 (6),1925 — 1936 (2011))。具体而言，可举出卡尔文?本森循环(Calvin —Benson cycle)、还原性 TCA循环(reductive TCA cycle)、Wood — Ljungdahl 途径(Wood —Ljung dahl pathway) 、3 —羟基丙酸循环(3 — hydroxypropionate cycle)、4 —羟基丁酸循环(4 一 hydroxybutyrate cycle)等。卡尔文?本森循环是存在于植物、光养细菌的包括约12种酶的CO2固定途径，通过核酮糖一 1，5 —双磷酸羧化酶(RubisCO)固定CO2，最终生产甘油醒3—磷酸。还原性TCA循环是在以绿硫细菌(green sulfur bacter ia)为代表的厌氧菌、微需氧菌中可见的循环，包括11种酶，特征在于以铁氧还原蛋白(ferredoxin)为辅酶的CO2固定酶(乙酰CoA羧化酶、2 —酮戍二酸合酶(2 — oxoglutarate synthase)),通过与通常的TCA循环方向相反的反应，由CO2生产丙酮酸。Wood - Lju ngdahl途径是在乙酸产生菌等厌氧性微生物中可见的途径，包括9种酶，通过甲酸脱氢酶、CO脱氢酶等将C02、辅酶上的甲酸还原，最终转化为乙酰CoA。3 一羟基丙酸循环是在绿屈挠菌属(ChlOToflexus)菌等中可见的循环，包括13种酶，通过乙酰CoA (丙酰CoA)羧化酶的作用将CO2固定，经由丙二酸单酰CoA等，生产乙酰CoA。4 一羟基丁酸循环是存在于古细菌等中的途径，通过丙酮酸合酶、乙酰CoA(丙酰CoA)羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反应而将CO2固定，经由4 一羟基丁酰CoA等，生产乙酰CoA。
[0005]另一方面，作为构想，也报道了一些将固定二氧化碳的途径导入到生产有用化合物的微生物中来生产有用物质的尝试。例如国际公开第2009/094485号小册子、国际公开第2010/071697号小册子中，公开了使用导入了与乙酸菌的Wood — Ljungdahl途径类似的途径的微生物由二氧化碳生产乙酰CoA的提案。另外，作为固定CO2而生产有用化合物的例子，国际公开第2009/046929号小册子中，公开了使用导入了氢化酶和四氢叶酸裂解酶(tetrahydrofolate lyase)的微生物由二氧化碳生产乳酸的尝试。另外，国际公开第2011/099006号小册子中，提出了经由向乙酰CoA上的二氧化碳固定反应、丙二酸单酰CoA的还原反应而固定CO2的循环。德国专利申请公开第102007059248号说明书中，提出了利用与4 一羟基丁酸循环类似的途径进行的乙酰CoA的生产。
【发明内容】
[0006]然而，从固定CO2而生产来自乙酰CoA的有用化学品这样的观点考虑，公知的二氧化碳固定循环不能说效率一定高。例如，卡尔文?本森循环作为自然界的二氧化碳固定循环最为有名，但担负二氧化碳固定的RubisCO的反应速度慢，而且还可见氧化分解这样的副反应，不能说是效率高的酶(Journal of Bioscience and Bioengin eering94 (6) 497 —505，2002)。另外，Wood — Ljungdahl途径、国际公开第2009/094485号小册子、国际公开第2010/071697号小册子、国际公开第2009/046929号小册子等中记载的途径中，包括将CO2还原为CO、 甲酸的途径，但这样的还原反应在通常的条件下是困难的，而且，催化这样强还原反应的酶只在还原性的环境下起作用的情况很多，不容易导入到绝对厌氧性的微生物以外的微生物中。在还原性TCA循环中，在中途的由丙酮酸合酶、2 —酮戊二酸合酶进行的还原反应中，需要以铁氧还原蛋白作为电子受体的强还原力，不易进行反应。另外，4 一羟基丁酸循环、3 —羟基丙酸循环、国际公开第2011/099006号小册子、国际公开第2009/046929号小册子等中记载的途径等中，利用琥珀酰CoA的还原、丙二酸单酰CoA的还原这样的羧酸或其(硫代)酯的还原反应，但这样的反应作为酶反应通常是困难的，认为作为发酵途径期望尽可能地避免(Atsumi 等.，Nature, 451, (3), 86 — 89, 2008 ;Yim 等.，Nat.Chem.Biol.，7,445 - 452,2011).4 一羟基丁酸循环经由4 一羟基丁酰CoA的脱水、3 —羟基丙酸的脱水这样的脱水反应，但存在这样的反应在水中经常与逆反应(水和)进行竞争这样的问题。另外，在4 一羟基丁酸循环、3—羟基丙酸循环、还原性TCA循环中，在丙二酸单酰Co A合成酶、丙酮酸合酶的作用下，生产出的乙酰CoA在循环内被转化为其他物质，因而从乙酰CoA的生广的观点考虑，不能说一定是有效率的。
[0007]进而，当将这样的循环导入到微生物中而尝试进行某些物质生产时，需要考虑构成循环的酶的数目、应重新赋予的酶活性的数目。即，构筑循环的酶、赋予的酶的数目越多，除了控制越发变难以外，对微生物的负担也越发增加。例如，如果要将Wood — Ljungdahl途径导入至大肠杆菌，则至少需要导入9种基因，除了构筑物质生产的途径之外，进一步进行这样程度的导入基因并控制，可以说在现实中是极其困难的操作。通过赋予数目少的酶来构筑由数目少的酶构成的循环不仅在构筑循环方面有利，而且在组合物质生产途径方面也是有利的，这是显然的。
[0008]因此，对于固定CO2并转化为乙酰CoA，如下方面可以说是理想的:A.构成途径的各酶的活性足够高，B.循环中不含消耗乙酰Co A的酶，C.新赋予的酶的数目少，循环简单。然而，在迄今为止报道的由CO2生产乙酰CoA的循环中，还不存在满足全部的A~C的条件的循环，均缺乏可操作性。其证据是，在现存的二氧化碳固定循环的提案中，迄今完全没有实际将酶活性赋予工业上利用的微生物从而将CO2转化为乙酰CoA及来自乙酰CoA的物质而用于发酵的例子。
[0009]本发明提供为了利用二氧化碳高效地生成乙酰CoA有用的微生物、及使用该微生物制造乙酰CoA及来自乙酰CoA的有用的代谢产物的方法。
[0010]本发明如下所述。
[0011][I]乙酰CoA生产微生物，具有乙酰CoA生产循环，所述乙酰CoA生产微生物是通过如下方式得到的:向不具有下述(a)、(b)、(C)、(d)及(e)中任一种的微生物中，不赋予
(a)、(b)、(C)及(d)中任一种,或即使赋予也不发挥其功能,赋予选自苹果酸硫激酶(malatethiokinase)、苹果酰 CoA 裂解酶(malyl — Co A lyase)、乙醒酸醒连接酶(glyoxylatecarboligase)>2 —羟基一3 —氧代丙酸还原酶(2 — hydroxy — 3 — oxopropionatereductase)及羟基丙酮酸还原酶(hydroxypyruvate reductase)中的至少一种酶活性；
[0012](a)具有由丙二酸单酸CoA (malonyl — CoA)向丙二酸半醒(m alonatesemialdehyde)或3 —羟基丙酸(3 — hydroxypropionate)的酶反应的二氧化碳固定循环，
[0013](b)具有由乙酰CoA和CO2向丙酮酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
[0014](c)具有由巴豆酰CoA (crotonyl CoA)和CO2向乙基丙二酸单酰CoA(ethylmalonyl 一 CoA)或戍烯二酸单酰CoA (glutaconyl CoA)的酶反应的二氧化碳固定循环，
[0015](d)具有由CO2向甲酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
[0016]Ce)选自苹果酸硫激酶和苹果酰CoA裂解酶中的至少一种。
[0017][2] [I]所述 的乙酰Cok生产微生物，具有如下的乙酰Cok生产循环:磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸经由草酰乙酸、进而通过苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛连接酶而得到的2 —羟基一 3 —氧代丙酸进一步经由2 —磷酸甘油酸再次转化为磷酸烯醇式丙酮酸。
[0018][3] [I]或[2]所述的乙酰CoA生产微生物，具有乙酰CoA生产循环，所述乙酰CoA生产循环包括如下酶:
[0019](f)选自丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶、或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、或磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶中的至少一种，
[0020](g)苹果酸脱氢酶，
[0021](h)苹果酸硫激酶，
[0022](i)苹果酰CoA裂解酶，
[0023](j)乙醛酸醛连接酶，
[0024](k)选自2 —羟基一 3 —氧代丙酸还原酶、或羟基丙酮酸异构酶及羟基丙酮酸还原酶中的至少一种，
[0025](I)选自甘油酸2 —激酶、或磷酸甘油酸变位酶及甘油酸3 —激酶中的至少一种，
[0026](m)烯醇化酶。
[0027][4] [I]~[3]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的微生物或属于棒状细菌(coryneform bacteria)的微生物。
[0028][5] [I]~[4]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为属于肠杆菌科的微生物，为埃希氏菌属(Escherichia)细菌或泛菌属(Pantoea)细菌；或属于棒状细菌的微生物，为棒状杆菌属(C orynebacterium)细菌。
[0029][6] [I]~[5]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为埃希氏菌属细菌，埃希氏菌属细菌具有的乳酸脱氢酶的活性被失活或降低。[0030][7] [I]~[6]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为埃希氏菌属细菌，埃希氏菌属细菌具有的选自异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase)及苹果酸合酶(malate synthase)中的至少一种酶的活性被失活或降低。
[0031][8] [I]~[7]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为埃希氏菌属细菌，埃希氏菌属细菌中硫解酶(thiolase)活性、C oA转移酶(CoA transferase)活性及乙酰乙酸脱羧酶(acetoacetate decarboxylase)活性被赋予或强化。
[0032][9] [I]~[8]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为埃希氏菌属细菌，埃希氏菌属细菌中硫解酶活性、CoA转移酶活性、乙酰乙酸脱羧酶活性及异丙醇脱氢酶活性被赋予或强化。
[0033][10] [I]~[5]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为泛菌属细菌，泛菌属细菌具有的富马酸水合酶(fumarate hyd ratase) A及富马酸水合酶C的活性被失活或降低。
[0034][11] [I]~[5]及[10]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为泛菌属细菌，泛菌属细菌具有的苹果酸合酶的活性被失活或降低。
[0035][12] [I]~[11]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其特征在于，使用如下的苹果酸硫激酶，所述苹果酸硫激酶中，对应于来自扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)的mtkB的第144位的氨基酸的氨基酸为异亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酰胺或脯氨酸，及/或，第244位的氨基酸为谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、赖氨酸或精氨酸。
[0036][13]乙酰CoA生产方法，包括如下步骤:使用[I]~[12]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，由碳源材料生产乙酰CoA。
[0037][14]丙酮生产方法，包括如下步骤:使用[9]或[12]所述的乙酰C oA生产微生物，由碳源材料生产丙酮。
[0038][15]异丙醇生产方法，包括如下步骤:使用[9]或[12]所述的乙酰CoA生产微生物，由碳源材料生产异丙醇。
[0039][16]谷氨酸生产方法，包括如下步骤:使用[5]、[10]、[11]或[12]所述的乙酰CoA生产微生物，由碳源材料生产谷氨酸。
[0040]通过本发明，可提供为了高效地将二氧化碳转化为乙酰CoA而有用的微生物及使用该微生物制造乙酰CoA及有用的代谢产物的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0041][图1]为说明本发明涉及的二氧化碳的固定途径的概要的途径图。
[0042][图2A]为表示各种mtkB的序列同源性的图。
[0043][图2B]为表示各种mtkB的序列同源性的图。
[0044][图3A]为表示各种mtkA的序列同源性的图。
[0045][图3B]为表示各种mtkA的序列同源性的图。
[0046][图4]为表示实施例41涉及的向用各种泛菌属细菌生产出的谷氨酸的13C导入图的图。
[0047][图5]为表示实施例50涉及的向用各种棒状杆菌属细菌生产出的谷氨酸的13C导入图的图。
【具体实施方式】
[0048]本发明涉及的乙酰CoA生产微生物具有乙酰CoA生产循环，所述乙酰CoA生产微生物是通过如下方式得到的:向不具有下述(&)、(13)、((3)、((1)及(6)中任一种的微生物中，不赋予(a)、(b)、(C)及(d)中任一种，或即使赋予也不发挥其功能，赋予选自苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛连接酶、2 —羟基一 3 —氧代丙酸还原酶及羟基丙酮酸还原酶中的至少一种酶活性。
[0049](a)具有由丙二酸单酰CoA向丙二酸半醛或3 —羟基丙酸的酶反应的二氧化碳固定循环。
[0050](b)具有由乙酰CoA和CO2向丙酮酸的酶反应的二氧化碳固定循环。
[0051](c)具有由巴豆酰CoA和CO2向乙基丙二酸单酰CoA或戊烯二酸单酰CoA的酶反应的二氧化碳固定循环。
[0052](d)具有由CO2向甲酸的酶反应的二氧化碳固定循环。
[0053]Ce)选自苹果酸硫激酶和苹果酰CoA裂解酶中的至少一种。
[0054]通过本发明，可提供具有乙酰Cok生产循环的乙酰Cok生产微生物，对于所述乙酰CoA生产微生物，通过赋予规定的酶活性，而将在糖代谢中产生的CO2、从外部供给的CO2固定化，构筑二氧化碳的固定循环，且能够高效地将CO2转化为乙酰CoA。
[0055]即，本发明是这样完成的:为了将CO2转化为乙酰CoA而进行了各种研究，结果发现:如上所述，向不具有下述(a)、(b)、(C)、(d)及(e)中任一种的微生物中，不赋予(a)、
(b)、(c)及(d)中任一种，或即使赋予也不发挥其功能，赋予选自苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛连接酶、2 —羟基一 3 —氧代丙酸还原酶及羟基丙酮酸还原酶中的至少一种酶活性，由此，可将CO2转化为乙酰CoA。
[0056](a)具有由丙二酸单酰CoA向丙二酸半醛或3 —羟基丙酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
[0057](b)具有由乙酰CoA和CO2向丙酮酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
[0058](c)具有由巴豆酰CoA和CO2向乙基丙二酸单酰CoA或戊烯二酸单酰CoA的酶反应的二氧化碳固定循环，
[0059](d)具有由CO2向甲酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
[0060]Ce)选自苹果酸硫激酶和苹果酰CoA裂解酶中的至少一种。
[0061]另外，通过利用该将CO2转化为乙酰CoA的乙酰CoA生产微生物，而且对该微生物进一步赋予规定的酶活性，由此可高效地进行如下物质的生产:乙酰CoA和来自乙酰CoA的有用的代谢产物，例如，异丙醇、乙醇、丙酮、柠檬酸、衣康酸、乙酸、丁酸、(聚一)3 —羟基丁酸、3 —羟基异丁酸、3 —氨基异丁酸、2 —羟基异丁酸、甲基丙烯酸、(聚)谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸等。
[0062]本发明提出了将CO2固定并转化为乙酰CoA的最简单且实用的乙酰CoA生产循环(图1)。
[0063]图1所记载的乙酰CoA生产循环表示本发明中的乙酰CoA生产循环的优选方案之一(以下，有时称为“图1的循环”。)。[0064]包括选自磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、和丙酮酸羧化酶及丙酮酸激酶中的至少一种；苹果酸脱氢酶；苹果酸硫激酶；苹果酰CoA裂解酶；乙醛酸醛连接酶；选自羟基丙酮酸异构酶、羟基丙酮酸还原酶及2 —羟基一 3 —氧代丙酸还原酶中的至少一种；选自甘油酸2 —激酶、磷酸甘油酸变位酶及甘油酸3 —激酶中的至少一种；和烯醇化酶这样的8~10种酶，(磷酸烯醇式)丙酮酸羧化酶负责二氧化碳固定。该(磷酸烯醇式)丙酮酸羧化酶属于二氧化碳固定酶中活性高的种类。例如，植物等的光合作用中利用的RubisCO的比活性已知为3U~20U/mg左右的活性(J.Biol.Chem.274 (8)5078 — 82(1999)，Anal.Biochem.153(1)97 — 101( 1986))，与此相对，(磷酸烯醇式)丙酮酸羧化酶中，报道了在大肠杆菌中为 30U/mg、甚至高达 100 ~150U/mg(J.Biol.Chem.247,5785 一 5792(1972)；Biosc1.Biotechnol.Biochem.59,140 — 142 (1995)；Biochim Biophys Acta.1475
(3):191 - 206 (2000))。另外，对于合成苹果酰CoA的苹果酸硫激酶(m tk)，在此次的研究中，发现了与目前为止已知的酶(J.Biol.Che m.248 (21) 7295 — 303 (1973))相比，活性更高的苹果酸硫激酶。进而,构成图1的循环的酶数为8~10种，与公知的乙酰CoA生产循环相比最简单，并且应赋予微生物的酶数为少量即可。而且，在图1的循环中，不含消耗乙酰CoA的酶。因此，图1的循环可以说是用于将CO2固定并转化为乙酰CoA的理想的循环。
[0065]进而，作为图1的循环的优点，也可举出如下优点:由于循环与糖酵解系统独立，因此可以与各种途径的糖酵解系统自由地组合。例如，戊糖磷酸途径的NADPH的生产量高，所以常用于物质生产(日本特表2007 - 510411号公报)，但与本循环独立，可以容易地组合
[0066]图1的循环的苹果酸脱氢酶(mdh)、2 —羟基一 3 —氧代丙酸还原酶(glxR)或羟基丙酮酸还原酶(ycdW)分别消耗NADH (或NADPH)作为还原力。另外，苹果酸硫激酶(mtk)、甘油酸3 —激酶(glxK)、甘油酸2 —激酶(garK)、丙酮酸羧化酶(pyc)消耗ATP。丙酮酸激酶(pyk)生产丙酮酸。
[0067]作为图1的循环的收支，当以磷酸烯醇式丙酮酸为起始物质时，为“磷酸烯醇式丙酮酸+ 2CoA + CO2 + 3NAD (P) H + 3ATP — 2 乙酰 CoA + 3NAD (P) ++ 3ADP”。
[0068]另外，当以丙酮酸为起始物质时，变为“丙酮酸+ 2CoA + CO2 + 3NAD (P)H +4ATP — 2 乙酰 CoA + 3NAD (P)++ 4ADP”。
[0069]即，图1的循环中，固定CO2并转化为乙酰CoA时，需要供给磷酸烯醇式丙酮酸(或丙酮酸)、NAD (P)H、ATP。
[0070]在以乙酰Cok为中间体的发酵途径中，发酵中消耗氧的途径的收支式记载于表1。假定在这些发酵中产生如下那样的现象:在发酵途径上生成NADH等还原型辅酶，其在氧的作用下恢复为氧化型。因此，如果能利用图1的循环代替氧而消耗生成的还原型辅酶，则可期待能将发酵中生成的还原力在乙酰CoA生产循环中有效利用，能固定CO2而转化为产物。
[0071]需要说明的是，此处的还原型辅酶是NADH、NADPH、FADH2、FMNH2、还原型醌辅酶这样的参与氧化还原的辅酶，而且其是指为还原状态的辅酶，优选是指NADH或NADPH，更优选是指NADH。另一方面，氧化型辅酶是还原型辅酶的氧化型，例如是指NAD +、N ADP+、FAD、FMN、氧化型醌辅酶，优选是指NAD +或NADP +，更优选是指NAD +。
[0072][表1][0073]
【权利要求】
1.乙酰CoA生产微生物，具有乙酰CoA生产循环，所述乙酰CoA生产微生物是通过如下方式得到的:向不具有下述(a)、(b)、( c)、( d)及(e)中任一种的微生物中，不赋予(a)、(b)、(c)及(d)中任一种，或即使赋予也不发挥其功能，赋予选自苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛连接酶、2 —羟基一 3 —氧代丙酸还原酶、及羟基丙酮酸还原酶中的至少一种酶活性； Ca)具有由丙二酸单酰CoA向丙二酸半醛或3 —羟基丙酸的酶反应的二氧化碳固定循环， (b)具有由乙酰CoA和CO2向丙酮酸的酶反应的二氧化碳固定循环， (c)具有由巴豆酰CoA和CO2向乙基丙二酸单酰CoA或戊烯二酸单酰CoA的酶反应的二氧化碳固定循环， (d)具有由CO2向甲酸的酶反应的二氧化碳固定循环， Ce)选自苹果酸硫激酶和苹果酰CoA裂解酶中的至少一种。
2.如权利要求1所述的乙酰CoA生产微生物，具有如下的乙酰CoA生产循环:磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸经由草酰乙酸、进而通过苹果酸硫激酶、苹果酰Cok裂解酶、乙醛酸醛连接酶而得到的2 —羟基一 3 —氧代丙酸进一步经由2 —磷酸甘油酸而再次转化为磷酸烯醇式丙酮酸。
3.如权利要求1或2所述的乙酰CoA生产微生物，具有乙酰CoA生产循环，所述乙酰CoA生产循环包括如下酶: (f)选自丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶、或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、或磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶中的至少一种， (g)苹果酸脱氢酶， (h)苹果酸硫激酶， (i)苹果酰CoA裂解酶， (j)乙醛酸醛连接酶， (k)选自2 —羟基一 3 —氧代丙酸还原酶、或羟基丙酮酸异构酶及羟基丙酮酸还原酶中的至少一种， (I)选自甘油酸2 —激酶、或磷酸甘油酸变位酶及甘油酸3 —激酶中的至少一种，和 Cm)烯醇化酶。
4.如权利要求1~3中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为属于肠杆菌科的微生物或属于棒状细菌的微生物。
5.如权利要求1~4中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为属于肠杆菌科的微生物，为埃希氏菌属细菌或泛菌属细菌；或属于棒状细菌的微生物，为棒状杆菌属细菌。
6.如权利要求1~5中任一项所述的乙酰CoA生产微生物,其中,微生物为埃希氏菌属细菌，埃希氏菌属细菌具有的乳酸脱氢酶的活性被失活或降低。
7.如权利要求1~6中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为埃希氏菌属细菌，埃希氏菌属细菌具有的选自异柠檬酸裂解酶及苹果酸合酶中的至少一种酶的活性被失活或降低。
8.如权利要求1~7中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为埃希氏菌属细菌，埃希氏菌属细菌中硫解酶活性、Co A转移酶活性及乙酰乙酸脱羧酶活性被赋予或强化。
9.如权利要求1~8中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为埃希氏菌属细菌，埃希氏菌属细菌中硫解酶活性、Co A转移酶活性、乙酰乙酸脱羧酶活性及异丙醇脱氢酶活性被赋予或强化。
10.如权利要求1~5中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为泛菌属细菌，泛菌属细菌具有的富马酸水合酶A及富马酸水合酶C的活性被失活或降低。
11.如权利要求1~5及权利要求10中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为泛菌属细菌，泛菌属细菌具有的苹果酸合酶的活性被失活或降低。
12.如权利要求1~11中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其特征在于，使用如下的苹果酸硫激酶，所述苹果酸硫激酶中，对应于来自扭脱甲基杆菌的mtkB的第144位的氨基酸的氨基酸为异亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酰胺或脯氨酸，及/或，第244位的氨基酸为谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、赖氨酸或精氨酸。
13.乙酰CoA生产方法，包括如下步骤:使用权利要求1~12中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，由碳源材料生产乙酰CoA。
14.丙酮生产方法，包括如下步骤:使用权利要求9或12所述的乙酰CoA生产微生物，由碳源材料生产丙酮。
15.异丙醇生产方法，包括如下步骤:使用权利要求9或12所述的乙酰CoA生产微生物，由碳源材料生产异丙醇。
16.谷氨酸生产方法，包括如下步骤:使用权利要求5、10、11或12所述的乙酰CoA生产微生物，由碳源材料生产谷氨酸。
【文档编号】C12N15/09GK103703122SQ201280036982
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年7月27日 优先权日:2011年7月29日
【发明者】藤井亮太, 白井智量, 安乐城正, 天野仰, 松本佳子, 馆野俊博, 竹林望, 森重敬, 高桥均, 和田光史, 清水浩, 古泽力, 平泽敬, 秀崎友则, 远藤绚子, D·L·于尔根-洛曼, A·马达范, 张舒善 申请人:三井化学株式会社