专利名称：植物与微生物联合修复油污污染湿地的方法
技术领域：
本发明涉及一种植物与微生物联合修复油污污染湿地的方法。
背景技术：
石油的大规模开采、冶炼、运输、使用和处理过程中，污染、遗漏、井喷、输油管道泄 漏等事故频发，导致严重的土壤污染[文献1 刘国良，苏幼明等.石油污染土壤生物修复 研究新进展[J].化学与生物工程，2008，25(1) :1-4]。石油烃进入土壤后，会破坏土壤结 构，分散土粒，使土壤透水性降低，其富含的反应基能与无机氮、磷结合并限制硝化作用和 脱磷酸作用，从而使土壤有效氮、磷的含量减少。其中的多环芳烃等，因具有“三致”效应和 通过食物链在生物体内富集[文献2 曾宪军，刘登魁.微生物修复受石油污染土壤的研究 进展[J].湖南农业科学2006，(2) :36-38，39]。对生态环境、食品安全和人身健康构成严 重威胁，成为困扰环境领域重要的社会与环境问题。有关土壤恢复技术的发展。在80年代以前，常采用热处理法和化学浸出法进行 治理，但热处理法代价太昂贵很难实施，化学浸出法采用化学溶剂带来二次污染问题。80 年代后期，生物修复方式因其经济、有效并对环境破坏性小等诸多优点，近年来发展尤为迅 猛。生物修复是依靠植物、微生物的吸收和分解氧化作用经细胞的分解同化，使有机物转变 为细胞的组成部分或者变为H2O和CO2排出体外，从而实现对有机污染的修复。分为原位生 物修复和异位生物修复两种。在已被石油污染的自然区域内，由于微生物存在的广泛性会通过自然驯化作用 而产生一定数量的嗜油微生物[文献3 =Whyte L. G. Assessment of the biodegradation potential ofpsychrotrophicmicr oorganism[J]. CanadianjournalofMicrobiology, 1996,42(2) :99-106]。能氧化石油烃及其化合物的微生物菌种在自然界分布广泛。少量烃 类进入土壤时，不但不会影响土壤的通气性，同时还作为土壤有机质促进土壤微生物活性， 有利于污染物的降解。但进入土壤的油浓度过高时，土壤孔隙就会被堵塞，影响通气性，对 微生物造成不利影响，而且大量土壤结构的活性表面会被油类包裹，使微生物失去良好的 活动场所，微生物的活性受到抑制，其降解能力下降[文献2 曾宪军，刘登魁.微生物修复 受石油污染土壤的研究进展[J].湖南农业科学2006，(2) :36-38，39]。植物是一个有效的土壤污染处理系统，主要通过直接吸收石油污染物、释放分泌 物和酶、刺激根区微生物的活性并强化生物转化作用。植物促进有机污染物的降解一方面 是由于根际作用增加了微生物降解菌的数量，另一方面是因为植物分泌有机物为微生物共 代谢提供了基质底物。微生物的活动也促进了根系分泌物的释放。另外，植物还可为微生 物提供生存场所和可转移的氧气，使根区的好氧转化作用得以正常进行。不同植物由于不 同的根特性，具有不同的修复效果。有研究表明，植物根系分泌物刺激了细菌的转化作用， 在根区形成了有机碳，根细胞的死亡也增加了土壤有机碳，这些有机碳的增加可阻止石油 污染物向地下水转移，也可增强微生物对石油污染物的矿化作用。已报道的各种有机污染 物的修复研究表明，草本植物和豆科植物(如紫花苜蓿)较其它植物在污染物根际修复中可能具有更大的应用潜力。污染土壤植物根际微生态环境对微生物活性具有诱导作用，有 利于石油烃的降解和污染土层的生物修复。大草原植物与其内生微生物联合对石油烃的 降解活性研究，其中黑麦草增加了内生寄生微生物系统对根际土壤中烷烃的降解率减少了 根际系统对根际土壤中PAH的降解。表明，生长在石油污染土壤中的不同植物种属特性不 同，不同种分布的微生物种群，能影响植物对烃类的降解[文献4 :Lori A. Phillips, James J. Germida et al. Hydrocarbon degradation potentialand activity of endophytic bacteriaassociated with prairie plants[J]. Soil Biology&Biochemistry,2008,40 3054-3064]。赵爱芬等在石油污染的水稻田中分离出的微生物Bacillussp，仅在有水稻根 分泌物的情况下才能在石油的残留物中生长，表明水稻根分泌物促进了特定微生物消除石 油残留物[文献5 赵爱芬，赵雪，常学礼.植物对污染土壤修复作用的研究进展[J]. 土壤 通报，2000，31(1) :43-46]。利用生物修复污染土壤是一种安全，环境友好型的土壤治理方法。该修复技术不 仅能修复被石油污染的土壤，而且对更多种有毒有害污染的土壤修复有效。已被事实证明， 生物修复污染土壤是一项实用性和有效性很强的技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物与微生物联合修复油污污染湿地的方法。为实现上述目的，本发明的技术方案为一种植物与微生物联合修复油污污染湿地的方法，其特征在于该方法的具体步骤 为a.采集待修复的受油污污染湿地的土壤，用含有所受的油污的无机盐培养基进行 土著嗜油菌的筛选，并扩大化培养筛选土著嗜油菌，将其以尿素浓度为40g/L，过磷酸钙浓 度为15g/L的营养底物，制作成0D_ ^ 1. 5的活性菌制剂；b.在油污污染的湿地土壤中种植薦草幼苗或薦草种子，种植密度为2500 5000 株/m2;待幼苗生长旺盛时期，将步骤a所得的活性菌制剂按质量比为100 1的比例加入 到种植有薦草幼苗的根系土壤中，待开花期、成熟期结束后，在嗜油菌群与植物根系的共同 作用下，修复油污污染的湿地。上述的受油污污染为受汽油、柴油、重油、原油或废弃油污排放带来的油类有机 物污染。上述的受油污污染的土壤中油污的浓度为1000 20000mg/kg。上述的土著嗜油菌的筛选为在100ml含有100mg/L油污浓度的无机盐培养基中 培养IOg受油污污染的土壤，每天取样涂油污平板、分离菌种；再将该菌种加入到含有更高 油污浓度的无机盐培养基中培养，分离菌种，如此反复至最终含油污的浓度为8460mg/L，筛 选出最终菌种；将最终筛选得到的菌种接种于富集培养基中，置于37°C、100 150r/min的 摇床培养至对数生长期，离心收集菌体；重新悬浮于灭菌营养液中，制成0D_ ^ 1. 5的活性 菌制剂。上述的含有所受的油污的无机盐培养基为K2HP04lg，KH2PO4Ig, NaCl 0. 5g, NH4 (SO4) 20. 5g，MgSO4O. 2g，KNO3O. 2g，CaCl2O. 02g, NaCl 0. 5g，FeCl3 痕量，微生素母液 0. lml, 8. 46 84. 6g 油污，蒸溜水 1000ml, pH 7. 5。
上述的富集培养基为蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠5g/L，油污42. 3g/L，蒸 馏水 1000ml/L, pH 7. 5，上述的菌制剂营养底物为尿素40g/L，过磷酸钙15g/L，蒸馏水1000ml/L，pH 7. 5。在石油烃污染土壤上种植薦草，薦草的生长及其根际微生物的活动以及分泌物和 酶的作用，加入土壤的嗜油菌对石油烃有良好的降解效果，薦草的能够促进嗜油菌对土壤 中石油烃污染物的降解，因此通过种植薦草可降解土壤中过量的石油烃，从而达到清除土 壤中石油烃污染的目的，可以成功避免二次污染。本发明所采用的薦草(Scirpus triqueter L.)多年生水生挺水草本植物，生于河 边、溪塘边、沼泽地及低洼潮湿处，具有较好的观赏价值。植物分类学特征如下具长的匍匐 根状茎。秆散生，粗壮，高20 100cm，三棱形，基部具2 3个叶鞘，鞘膜质，最上一个鞘顶 具叶片。叶片扁平，长1. 3 5. 5cm,宽1. 5 2mm。苞片1枚为秆的延长，三棱形，长1. 5 7cm,侧枝聚伞形花序假侧生，有1 8个辐射枝，辐射枝三棱形，棱上粗糙，长达5cm，每辐射 枝顶有1 g个簇生的小穗；小穗卵形或长圆形，长6 12mm，3 7mm，密生多数花，鳞片 长圆形、椭圆形或宽卵形，长3 4mm，膜质，黄棕色；下位刚毛3 5条，与小坚果略等长， 有倒刺；雄蕊3 ；花柱短，柱头2。小坚果倒卵形，平凸状，长2 3mm，成熟时褐色，具光泽。 花果期6 9月。繁殖与栽培有性繁殖即种子繁殖。3 4月份在室内播种，用盆装入培养土并整 平压实，后将催好芽的种子撒播在上面，然后洒上一层细纱或土覆盖种子，再将播好种的盆 浸入水中。保持室温20 25°C，20天左右即可发芽生根。无性繁殖在清明节前后，把越 冬苗从田或盆中挖出，把土抖掉，用枝剪或快刀将地下茎切成若干块丛，每丛8 12个茎 芽，进行栽种。露地栽培，选择水景区适合的位置，在地面上挖穴栽植，株行距30cm左右，如 肥沃地(池)，当年即可旺盛生长连成片。盆栽，选用无泄漏地水盆，每盆栽8株左右，保持 25°C左右温度及浅水(1 3cm) 15天左右即可发芽。在生长发育季节时，应及时清除田中、 盆中杂草，初期水浅，中期深水，后期浅水，以促使地下茎越冬芽地形成，提高来年的繁殖系 数。生长期内需施1 2次追肥，冬季要清除枯叶。本发明通过种植石油烃修复植物薦草与嗜油菌联合作用来修复石油烃污染土壤。 该方法与传统土壤治理方法相比，具有投资少、工程量小、技术要求不高等优点，无二次污 染。修复进程不仅不会破坏土壤生态环境，还有助于改善因石油烃污染而引起的土壤退化 和生产力下降，恢复并提高其生物多样性。另外，薦草挺拔直立，色泽光雅洁净，主要用于水 面绿化或岸边、池旁点缀，较为美观，也可盆栽庭院摆放或沉入小水景中作观赏用。全草入 药，主治食积气滞，呃逆饱胀。茎可织席，编草鞋，又可用于造纸。具有良好的生态效益。
图1薦草与土著嗜油菌群降解后剩余柴油含量图2薦草与土著嗜油菌群降解柴油的效率图3薦草与土著嗜油菌群降解柴油各组分情况
具体实施例方式供试柴油供试柴油为零号柴油上海市宝山区中石化明和加油站购买。实施例子薦草与土著嗜油菌群的除油户外试验本实验于2009年8月进行。实验地点在上海大学环境与化学实验楼五楼露天阳 台，该研究所处上海市宝山区，属湿带半湿大陆性季风气候，年降水量在500 600左右。 试验用原始石油污染土壤取自黄浦江-长江口湿地土壤，并从中筛取出本实验所采用的三 种嗜油菌株。清洁土壤取自上海大学东区花坛，过2mm筛后，按沙土比2 3均勻混合，并 配置成不同柴油浓度梯度的土壤。配置成5个浓度梯度，分别为1000mg/kg，5000mg/kg， 10000mg/kg, 15000mg/kg，20000mg/kg。实验共设三个处理，分别为油污土(空白组)、油 污土接种菌(微生物组)、油污土接种菌种入藤草(实验组)。接种菌悬液为将嗜油菌 在30°C下培养至对数期，离心后收集菌体，将其悬浮于尿素浓度为40g/L，过磷酸钙浓度为 15g/L的营养液中，调节吸光度(OD66tl)为1.5，菌悬液为三种菌株的1 1 1混合液。每 千克土壤中营养菌悬液的加入量为IOml。根据土壤水分丰缺状况，不定期浇水，使土壤饱和 含水。浇入菌液时利用小铁铲松动表土，松土时不要伤到薦草的根，从而保证菌液的均勻分 布与土壤中氧气充足，利于薦草和微生物的生长繁殖。实验共历时60天，在实验过程中间歇采取土样测定其中柴油含量与组分发生的 变化。实验结果如下1)不同处理浓度下嗜油菌群对柴油的降解效率在不同污染物浓度处理下，薦草对污染物显示出了较强的耐受性，无表观毒害特 征，植株均生长良好。从图1各组样品的剩余残油量可以看出，嗜油菌群使土壤中柴油有较 大的降解效果，在薦草与嗜油菌的共同作用下，使土壤中残油量进一步的减少。如图2所示 各组样品的降解率，在各种污染物浓度下，薦草与嗜油菌的共同作用使得降解率有了更大 的提高。污染土壤植物根际微生态环境对微生物活性具有诱导作用，有利于石油烃的降解 和污染土层的生物修复。嗜油菌对柴油的降解率达到12. 6 55.0%，薦草嗜油菌共同作用 下，柴油降解率达到13. 6 61. %。在低浓度柴油的土壤中，由于柴油挥发性与检测分析 域值的影响，降解率出现峰值。而现实是，随着土壤中柴油浓度的增大，在薦草与嗜油菌的 共同作用下柴油的降解率提高。2)薦草联合嗜油菌作用下对柴油组分的降解效果剩余残油经气相色谱分析发现(如图3)，嗜油菌群降解作用下，柴油组分的相对 含量并未发生明显的变化，正构烷烃各组分的峰值仍在C19左右，而在植物薦草与嗜油菌的 联合作用下，正构烷烃组分各组分的相对含量发生了明显的变化，从C17 C24的正构烷烃组 分均有了很大程度的降解。
权利要求
一种植物与微生物联合修复油污污染湿地的方法，其特征在于该方法的具体步骤为a.采集待修复的受油污污染湿地的土壤，用含有所受的油污的无机盐培养基进行土著嗜油菌的筛选，并扩大化培养筛选土著嗜油菌，将其以尿素浓度为40g/L，过磷酸钙浓度为15g/L的营养底物，制作成OD600≈1.5的活性菌制剂；b.在油污污染的湿地土壤中种植藨草幼苗或藨草种子，种植密度为2500～5000株/m2；待幼苗生长旺盛时期，将步骤a所得的活性菌制剂按质量比为100∶1的比例加入到种植有藨草幼苗的根系土壤中，待开花期、成熟期结束后，在嗜油菌群与植物根系的共同作用下，修复油污污染的湿地。
2.根据权利要求1所述的植物与微生物联合修复油污污染湿地的方法，其特征在于所 述的受油污污染为受汽油、柴油、重油、原油或废弃油污排放带来的油类有机物污染。
3.根据权利要求1所述的植物与微生物联合修复油污污染湿地的方法，其特征在于所 述的受油污污染的土壤中油污的浓度为1000 20000mg/kg。
4.根据权利要求1所述的植物与微生物联合修复油污污染湿地的方法，其特征在于所 述的土著嗜油菌的筛选为在IOOml含有100mg/L油污浓度的无机盐培养基中培养IOg受 油污污染的土壤，每天取样涂油污平板、分离菌种；再将该菌种加入到含有更高油污浓度的 无机盐培养基中培养，分离菌种，如此反复至最终含油污的浓度为8460mg/L，筛选出最终菌 种；将最终筛选得到的菌种接种于富集培养基中，置于37°C、100 150r/min的摇床培养至 对数生长期，离心收集菌体；重新悬浮于灭菌营养液中，制成0D_ ^ 1. 5的活性菌制剂。
5.根据权利要求5所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于所述的含有 所受的油污的无机盐培养基为K2HP04lg，KH2PO4Ig, NaCl 0. 5g，NH4 (SO4) 20. 5g，MgSO4O. 2g， KNO3O. 2g，CaCl2O. 02g, NaCl 0. 5g，FeCl3 痕量，微生素母液 0. Iml,8.46 - 84. 6g 油污，蒸馏 水 1000ml，pH 7·5。
6.根据权利要求5所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于所述的富 集培养基为蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠5g/L，油污42. 3g/L，蒸馏水1000ml/L，pH 7. 5，
7.根据权利要求5所述的受油污污染湿地的微生物修复方法，其特征在于所述的菌制 剂营养底物为尿素40g/L，过磷酸钙15g/L，蒸馏水1000ml/L，pH 7. 5。
全文摘要
本发明涉及一种植物与微生物联合修复油污污染湿地的方法。该方法具体为采集待修复的受油污污染湿地的土壤，用含有所受的油污的无机盐培养基进行土著嗜油菌的筛选，并扩大化培养筛选土著嗜油菌，将其以尿素浓度为40g/L，过磷酸钙浓度为15g/L的营养底物，制作成OD600≈1.5的活性菌制剂；在油污污染的湿地土壤中种植藨草幼苗或藨草种子，种植密度为2500～5000株/m2；待幼苗生长旺盛时期，将步骤a所得的活性菌制剂按质量比约为100∶1的比例加入到种植有藨草幼苗的根系土壤中，待开花期、成熟期结束后，在嗜油菌群与植物根系的共同作用下，修复油污污染的湿地。该方法与传统土壤治理方法相比，具有投资少、工程量小、技术要求不很高等优点，无二次污染。修复进程不仅不会破坏土壤生态环境，还有助于改善因石油烃污染而引起的土壤退化和生产力下降，恢复并提高其生物多样性。
文档编号B09C1/00GK101954373SQ20101029095
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者刘晓艳, 张新颖, 曹正楠, 杜静丽, 王君, 王珍珍, 苏鹏程, 蔡倩, 钟成林 申请人:上海大学