新颖的构建物及其在代谢途径工程中的用途的制作方法

专利名称：新颖的构建物及其在代谢途径工程中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，更具体而言，本发明涉及产生编码两个或更多个融合酶结构域的基因融合构建物的方法。
背景技术：
从本质上说，代谢途径是酶活性的集结，当以一定的顺序进行时，这些酶活性引导原料形成最终产物。在一些情况下，代谢途径是合成过程；在其它一些情况下，代谢途径是降解过程。在原核细胞的大多数未分区化的细胞环境中，代谢途径的酶组分的合成和协调是相当直接的。原核细胞中的转录和翻译在空间上和暂时性上都是存在联系的。由于原核细胞不具有膜结合的核，其转录和翻译不像真核细胞那样，而是未分区化的，这些过程在相同的细胞位置中(细胞质)中发生。但是，真核细胞的细胞结构是分区化的。在真核系统(如植物)所需的区室中建立和执行一种新的代谢途径，要比在原核系统中建立类似的代谢途径困难得多，这是因为，例如转录和翻译事件的协调受到许多蛋白质、胞内分区化结果以及许多启动子、起始和中止系统的使用的额外阻碍。因此，需要能在有机体，尤其是真核生物中促进代谢途径工程的新方法。
本发明提供用于在如真核生物(如植物系统)中表达代谢途径和途径组分的方法和组合物。
发明概要可将代谢途径工程用于生产新颖的代谢物，和提高或增强目前用于生产现有代谢物的方法。代谢途径在不同物种之间的转移还提供新颖的方法来在特殊的宿主中生产所需的代谢物。例如，将生产化学化合物的细菌代谢途径转移到植物系统中，将使得这种化合物的生产与传统的化学合成或细菌发酵相比，是以一种替代的以及具有潜在的经济竞争力的方式进行。或者，代谢途径成分和所产生的代谢物的转移和表达可赋予受体系统以所需的特性。
因此，本发明提供生产改进的基因融合构建物的方法，包括使两条或更多条(常常是3条或多条)编码两个或更多个酶结构域的核酸序列连接在一起，其中核酸序列中至少有一条与其原始确定的序列(即未修饰)相比，已经被修饰(如突变、改组或发生了其它改变)。修饰的核酸序列可在共连接到第二条核苷酸序列之前被修饰，或者在序列共连接后被修饰。任选地，修饰的核酸序列进行循环的重新组合，以在该序列中产生修饰。这些核酸序列可以是脱氧核糖核酸的各种形式(例如，基因组DNA、cDNA、有义链序列、反义链序列、重组DNA、改组DNA、修饰DNA或者DNA类似物)。或者，这些核酸序列可以是核糖核酸(包括但不限于基因组RNA、信使RNA、催化RNA、有义链序列、反义链序列、重组RNA、改组RNA、修饰RNA或RNA类似物)。可直接将核酸序列连接在一起，或者在这些核酸序列之间可用一个或多个核苷酸接头序列将它们分开。本发明的核苷酸接头序列典型的长度范围是约3个到约300个核苷酸，但在一些例子中可以更长。任选地，这些核苷酸接头序列包括内含子、限制酶切位点、编码内含肽(intein)的序列，和/或编码可解离的肽区域的序列。对于编码酶结构域的核苷酸序列，其核苷酸接头序列可以被修饰，例如通过突变、改组或其它改变。此外，可将一个或多个转录调节序列(例如启动子或增强子)插入修饰的基因融合构建物中。可将修饰的基因融合构建物进一步导入真核动物系统中，如植物系统。
掺入本发明修饰的基因融合构建物中的核酸可以从单一的代谢途径中得到，或者可从两个或更多个截然不同的代谢途径中得到(如，以生产新颖的代谢途径)。此外，掺入基因融合构建物中的核酸可从单一的来源或物种得到，或者从多个来源或物种得到。在本发明的一个实施例中，由两条或更多条核酸序列编码的酶结构域是从八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素去饱和酶和/或β-环化酶得到。在本发明的另一个实施例中，由两条或更多条核酸序列编码的酶结构域是从二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰转移酶和外蛋白(ectoine)合成酶得到。在本发明的另一实施例中，由两条或更多条核酸序列编码的酶结构域是从β-酮硫解酶、D-还原酶和聚(羟基链烷酸酯)合成酶得到。在本发明的又一实施例中，由两条或更多条核酸序列编码的酶结构域是从下述酶中得到酮合成酶-乙酰转移酶，链长度因子、酰基载体蛋白和环化酶。此外，本发明提供修饰的融合构建物、含有该修饰的基因构建物的载体、杂交蛋白和转基因系统(如转基因植物系统)。
本发明还提供生产基因融合构建物的方法，该方法将参与相同的代谢途径的两条或更多条异源核酸序列共连接在一起，其中共连接的核酸序列中至少有一条从真核生物得到，其它共连接的核酸序列从不同的真核生物或原核生物的物种得到。可将先前描述的生产修饰融合构建物的方法中感兴趣的核酸序列用于使用两条或更多条异源核酸序列的方法中，该异源核酸从两种或多种真核生物得到，或者从至少一种原核生物和至少一种真核生物得到。此外，可使用类似的核苷酸接头序列和转录调节元件。这些方法还可包括将所述修饰的基因融合构建物导入原核或真核系统(如植物系统)中的步骤。此外，本发明提供基因融合构建物、含有该基因构建物的载体、杂交蛋白和转基因系统(如转基因植物系统)。
本发明还提供生产基因融合构建物的方法，该方法将编码异源酶结构域的两条或更多条核酸序列共连接在一起，其中至少一个酶结构域得自植物。植物的酶结构域可得自如在类胡萝卜素的生物合成中涉及的酶。这些核酸序列可以是脱氧核糖核酸或核糖核酸的各种形式，如在生产修饰的基因融合构建物的方法中所述。此外，可任选地使用类似的核苷酸接头序列和转录调节元件。这些方法还可包括将所述基因融合构建物导入生物系统(如原核系统或真核系统)的步骤。此外，本发明提供基因融合构建物、含有该基因构建物的载体、杂交蛋白和转基因生物系统，如转基因细菌、真菌或植物系统。
本发明还提供在生物系统(如原核系统或真核系统)表达多种酶活性的方法。这些方法包括将任何一种或多种前述基因构建物导入生物系统的步骤。这些核酸序列通常编码参与代谢途径的蛋白质，其中，该途径可以但不一定出现在自然界中，例如，通过将在自然界的相同途径中通常不起作用的酶结构域组合而产生的新颖的代谢途径。在本发明的一个实施例中，由核酸序列编码的酶结构域得自八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素去饱和酶和/或β-环化酶。在本发明的另一个实施例中，由核酸序列编码的酶结构域是从二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰转移酶和外蛋白合成酶得到。在本发明的另一实施例中，由核酸序列编码的酶结构域是从β-酮硫解酶、D-还原酶和聚(羟基链烷酸酯)合成酶得到。在本发明的又一实施例中，核酸序列是从下述酶中得到酮合成酶-乙酰转移酶、链长度因子、酰基载体蛋白和环化酶。用于本发明方法的核酸序列可以是脱氧核糖核酸的各种形式(例如，基因组DNA、cDNA、有义链序列、反义链序列、重组DNA、改组DNA、修饰DNA或者DNA类似物)。或者，可以使用核糖核酸(包括但不限于基因组RNA、信使RNA、催化RNA、有义链序列、反义链序列、重组RNA、改组RNA、修饰RNA或RNA类似物)。在基因融合构建物的合成中可使用单独的核酸序列或者核酸序列文库。编码酶结构域的核酸序列可直接相互连接，或者它们可通过一条或多条核苷酸接头序列连接，这些接头序列长约3个到300个核苷酸。任选地，一条或多条核酸序列，和/或一条或多条接头序列可以发生突变、改组或发生其它改变(在序列的共连接之前或之后)。
对于上述基因融合构建物和修饰的基因融合构建物，可掺入本方法的基因融合构建物中的核酸得自单一的代谢途径，或者从两种或多种不同的代谢途径中得到(如，以产生新颖的代谢途径)。此外，掺入基因融合构建物中的核酸可以从单一的来源或物种得到，或者可从多个来源或物种得到。基因融合构建物和修饰的基因融合构建物可含有构建物(如重组基因融合构建物)的文库，该文库可任选地在将上述基因融合构建物或修饰的基因融合构建物导入生物系统之前进行筛选。此外，可将一个或多个转录调节序列掺入基因融合构建物中。该生物系统可以是原核系统，例如细菌或古细菌细胞；或者，该生物系统可以是真核系统，如真核细胞、植物细胞、动物细胞、真菌、酵母、原生质体、组织培养物、有机体等等。可采用例如本领域技术人员已知的技术(如电穿孔、微注射、微粒轰击、聚乙二醇介导的转化或者农杆菌属介导的转化)将基因融合构建物导入任何这些系统中。本发明的方法还可包括使基因融合构建物在真核系统中表达的步骤。此外，本发明提供基因融合构建物、含有该基因融合构建物的载体、杂交蛋白以及转基因生物系统，如转基因植物系统，如采用本发明方法制备的。
此外，本发明提供采用本文所述方法制得的重组核酸序列。在一些实施例中，重组核酸序列含有编码至少两条互接的酶结构域的序列，这些酶结构域得自不同的真核生物物种或得自真核生物和原核生物。在另外的实施例中，重组核酸序列含有编码至少两条互接的酶结构域的序列，这些酶结构域得自植物基因。任选地，这些重组核酸序列可以被修饰，例如，通过突变、改组、循环的组合等等。在一些实施例中，这些重组核酸序列含有编码至少两条共接的酶结构域的序列，其中，编码一个或多个酶结构域的序列已被修饰，如本文所述。由重组核酸序列编码的酶结构域可得自参与相同的代谢途径的蛋白质，或者它们可得自两条或更多条不同的代谢途径(如，以产生新颖的代谢途径)。可获得酶结构域的代谢途径的例子包括胡萝卜素合成途径(包括八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素去饱和酶和β-环化酶)、外蛋白合成途径(包括二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰转移酶和外蛋白合成酶)、聚(羟基链烷酸酯)合成途径〔包括β酮硫解酶、还原酶和聚(羟基链烷酸酯)合成酶〕以及最小聚酮化合物合成途径(包括酮合成酶-酰基转移酶、链长度因子和酰基载体蛋白以及环化酶)。
附图的简要描述

图1具有两个核酸序列的修饰的基因融合构建物的示意图，其中没有接头序列。基因1中的终止密码子被去除，然后按阅读框架与基因2中的编码序列融合。
图2具有两条核酸序列的修饰的基因融合构建物的示意图，其中具有接头序列。基因1中的终止密码子被去除，然后与一接头序列融合，该接头序列按阅读框架与基因2中的编码序列融合。
图3具有三条核酸序列的基因融合构建物的示意图，其中存在和缺乏接头序列。接头序列的存在是任选的。基因1和2中的终止密码子在按阅读框架与基因3融合之前被去除。
图4类胡萝卜素生物合成途径，和本发明的基因融合产物的可能实施例。
图5外蛋白生物合成途径。(ASA天冬氨酸β-半醛；DABA2，4-二氨基丁酸；ADABAγ-N-乙酰基-α，γ-二氨基丁酸)。
图6PHA生物合成途径。(R＝乙酰基、丙酰基和其它较长的链基；i和j＝重复单元的数量。最终聚合物的变化由最初建立的方框中的R基团决定)。
图7最小聚酮化合物合成途径。
图8野生型外蛋白合成酶操纵子的功能性分离的克隆策略。
图9制备三种外蛋白生物合成酶的融合构建物的策略。
图10在不同盐浓度下，用pBR322转化的大肠杆菌(对照)和含有WT ect操纵子的质粒(ect操纵子1和ect操纵子2是两个独立转化的大肠杆菌菌落)和含有融合的ect基因的质粒(融合的ect1和ect2是两个独立转化的大肠杆菌菌落)的生长。
发明的详细讨论定义在详细描述本发明之前，应理解本发明并不限于具体的组合物或生物系统，当然这些都是可以改变的。还应理解本文所使用的术语仅仅是为了描述具体的实施例，而不能将它们看做是限制性的。在本说明书和附带的权利要求书中，单数形式“一”和“该”包括其复数形式，除非文中有清楚的说明。因此，例如，“一种装置”包括两种或多种这样的装置的组合，“一个基因融合构建物”包括构建物的化合物，等等。
除非另有说明，本文所使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员所理解的相同。虽然在实施本发明的实践中可使用与本文类似或等效的任何方法和材料，但是本文所述的是优选的材料和方法。
在描述本发明和对本发明提出权利要求时，将使用下述术语，其定义如下。
术语“修饰的核酸序列”指与一种或多种亲本核酸(如一个或多个天然的核酸)相比已发生改变的核酸序列，如被修饰、删除、重排，或者与亲本核酸相比，修饰核酸中有一个或多个核苷酸残基被取代。核酸序列修饰的优选模式包括改组和突变。在本发明的一些优选实施例中，对核酸序列的修饰导致在由该核酸序列编码的氨基酸序列的内部区域中发生取代、缺失和/或插入，更佳的是有许多内部修饰(即两个、三个或更多)被导入该编码的多肽中。这种类型的内部修饰与例如蛋白质的一个末端的截短不同。它遵循酶结构域的内部修饰的位点侧接该酶结构域的氨基末端和羧基末端的原则。
术语“修饰的蛋白质”、“修饰的酶”和“修饰的酶结构域”指由相应的修饰核酸序列编码的翻译产物。
术语“多样化”和“多样性”，在用于核酸序列时，指产生亲本核酸的许多修饰形式或者许多亲本核酸。在核酸序列编码基因产物的情况中，核酸序列的多样性可产生相应的基因产物的多样性，如核酸序列的各种合并物编码许多修饰的蛋白质。在本发明的一些优选实施例中，通过筛选/选择修饰核酸和/或具有所需功能特征的蛋白质而利用这种序列多样性。
术语“编码”指编码一个或多个氨基酸的多核苷酸序列。该术语并不需要起始密码子或终止密码子。氨基酸序列可在多核苷酸序列提供的6种不同阅读框中的任一种中被编码。
术语“植物”包括全植物、枝条营养器官/结构(如叶子、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚胎、胚乳和种皮)和果实(成熟的子房)、植物组织(如维管组织、基本组织等等)和细胞(如保卫细胞、卵细胞、毛状体等等)以及该植物的后代。可用于本发明方法的植物的类别范围通常大至可采用转化技术进行修改的高等和低等植物类别，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。该术语包括各种倍性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。
术语“基因融合构建物”在本文中指含有从至少两种不同的亲本核酸衍生得到的互接序列的重组核酸序列。“修饰的基因融合构建物”含有一个亚组的基因融合构建物，其中，与亲本或者获得该构建物所述部分的野生型序列相比，该构建物中至少有一个核苷酸(任选地在一个编码区域或接头区域中)被修饰，或者发生了变化。
术语“酶结构域”指在多肽或蛋白质中拥有酶的活性位点的氨基酸序列部分。术语“酶的活性位点”通常指能影响蛋白质的一些功能活性的酶的区域，如催化化学反应，与配体或底物结合，或者特异性与其它分子如小分子、生物聚合物、核酸或其它蛋白质或肽相互作用。蛋白质的活性对于天然形式的蛋白质可以是内源性的活性，或者可以是已通过对获得该蛋白质的亲本核酸进行修饰而被导入该蛋白质中的活性。
如果酶结构域对应于该酶的氨基酸序列的一部分，或者在一些情况中，该结构域基本上是该酶的所有氨基酸序列，则该酶结构域从具体的酶“衍生得到”。即使酶结构域由于编码具体的酶的核酸序列被修饰而具有基本上不同的序列和/或功能，仍认为该酶结构域是从具体的酶衍生得到。
如果核酸序列最初是从植物分离得到，不管该序列是否如本文所述在接下来的步骤中被修饰，都认为该序列从植物“衍生得到”。
术语“肽接头”和“肽接头序列”指放置在其它肽序列(如酶结构域)之间、将这些序列连接起来的氨基酸序列。肽接头可在最终的延伸构建物中起到如间隔单元的作用。或者，肽接头可以提供一种机制，通过这种机制，可将连接的序列分离(例如，通过提供蛋白酶切割位点或内含肽序列)。
术语“基因融合构建物”指含有两个或更多个互接的异源核酸序列的构建物。在本发明优选的实施例中，该互接的序列编码异源的酶结构域，该构建物的表达产生含有该异源酶结构域的杂交蛋白质，这些结构域直接相互融合，或者通过肽接头融合。基因融合构建物的制备通常需要在融合编码区域中维持正确的读框并将任何内部终止密码子除去。或者，在某些生物系统中内部终止密码子可以被抑制。
术语“异源”在本文中是描述两种或多种成分之间的关系，该关系表明这些成分在自然界中通常是相互不接近的。因此，术语“异源酶结构域”是指不在自然界的单一多肽上发现的酶结构域，如异源结构域从两种不同的酶获得，或者从不同物种的酶获得，等等。异源的物质(如酶结构域、多肽、核酸序列等)可从相同的物种获得(如，物种中的两种不同蛋白质)，或者从不同的物种获得。
如果一条多核苷酸序列从一外源物种得到，或者从相同的物种得到，但它从其原始形式中被修饰，则该多核苷酸序列与有机体或另一种多核苷酸序列是“异源的”。例如，操作性连接于异源编码序列的启动子指从不同于获得该启动子的物种的物种中得到的编码序列，或者，如果是从相同的物种得到，则编码序列不是天然与该启动子有联系(如从不同的生态型或变种得到的经遗传工程加工的编码序列或等位基因)。
术语“代谢途径”指催化活性的任何组合，通常是酶介导的，其结果是底物化学转化为产物。代谢途径可以是分解代谢或合成代谢。代谢途径一般可以是在生物系统中发现，或者可以是在自然界中还未发现的新颖的代谢途径。如果一组两种或多种酶(酶结构域)中一种酶的底物和/或产物是该组中另一种酶的底物或产物，则该组酶(或酶结构域)是共同的代谢途径的成员，并且在适当的条件下这些酶的协同活性会使底物(或者一些底物)通过中间物(或者一系列中间物)转化成产物(或者许多产物)。在典型的例子中，底物被该组酶的第一成员转化成第一中间物，该第一中间物被该组的第二成员转化成第二中间物，该第二中间物被该组的第三成员转化成该代谢途径的最终产物。代谢途径中的中间物数量随着途径而改变，例如，一些途径仅有单一的中间物，其它则有许多。在一些例子中，代谢途径可分支，这样一种或多种中间物可以转化成其它的产物。对于不同的代谢途径，底物、产物和中间物的数量可从一到许多不等。
术语“生物系统”指可将核酸序列导入其中，以用于接下来的复制、重组和/或表达的任何系统，包括但不限于细菌、古细菌、原生动物、真菌、植物、动物、病毒、单细胞、多细胞生物、人工构建物如脂质体、体外表达系统等等。
真核生物中的代谢途径工程和表达在真核生物(如植物)的所需的区室中建立具有多种单一酶的新的(或修饰的)代谢途径，要比在原核系统的相对未分区化的环境中建立这种代途径困难得多。其困难的部分原因在于各种酶的转录都由它自己的启动子和终止序列控制这一事实。作为例子，由四种酶构成的代谢途径通常需要四种启动子序列和四种终止序列，以进行完整的表达。在多种转录产物分开合成和翻译之后，在转化宿主中，翻译的肽序列共定位到相同区室可能出现困难。另一考虑是将酶的来源工程加工到真核生物中。当酶可参与相同的代谢途径时，可从不同的物种中获得最佳用于该代谢途径的各步骤的酶，因而会出现不同的最佳pH、温度要求、转换率以及其它环境要求和影响。
目前解决多种代谢酶的共表达问题的一个方法包括将编码各酶的核酸序列克隆到分离的质粒中。然后采用适用于真核系统的转化技术(细菌介导的转化、原生质体融合技术、微粒轰击等等)，将这些质粒转染到所需的真核系统中。或者，可使编码酶的核酸序列组合到表达盒中，将其作为单一的载体而非多个元件转染到宿主细胞中。这些方法在本领域中是已知的〔例如，可参见《分子生物学当前的方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等编辑，GreenePublishing Associates，Inc.和John Wiley&Sons，Inc.合资，2000年的增刊〕。
但是，这些方法存在大量的缺陷。如果核酸序列被掺入宿主基因组中，由于位置影响的缘故，可能或产生表达方面的问题(例如，相关的核酸序列可能已插入染色质的紧密包装的部分)。当基因组被复制和宿主细胞分裂时，分离作用也可导致一种或多种相关序列的丢失。此外，在串联克隆方法的情况中，存在与重复使用相同启动子相关的稳定性问题。这些问题严重地削弱了多酶代谢途径在真核系统中的实用性和实施。
本发明提供表达多种酶活性的方法，以及生产修饰的基因构建物的方法，其中所需的代谢酶以单一的、伸展的、多功能杂交蛋白质的形式生产。通过将所需的酶结构域合成为从一系列互接的核酸序列翻译得到的单一的肽，关于多种酶在代谢途径中的共表达和共定位的问题迎刃而解。掺入本发明基因融合构建物中的核酸序列可直接相互连接，或者可由核苷酸接头序列分开序列。在本发明的一些实施例中，掺入所得杂交蛋白质中的酶活性在此互接的或粘连形式中是活跃的。在其它实施例中，在转录或翻译后，为了如修饰酶的活性而将该酶结构域解离或分离也是合乎需要。可通过如使用对蛋白酶切割或水解敏感的肽接头，或者通过将内含肽或内含子序列掺入接头序列中，从而可以实现组成型酶活性的分离。下文将进一步详细描述这些方法、基因融合构建物、修饰的基因融合构建物以及在这些方法中使用或者由这些方法产生的杂交蛋白质。
基因融合构建物本发明提供通过使用基因融合构建物表达多种酶活性的方法，以及生产修饰的基因构建物的方法。此外，本发明提供用于这些方法的基因融合构建物，和采用这些方法制备修饰的基因融合构建物。以它们的最简单形式的基因融合构建物是编码酶结构域的核酸序列的组合(图1-3)。这些构建物还可包含参与编码的杂交蛋白质的表达的核酸序列，如转录元件、启动子、终止序列、内含子等等。此外，这些构建物可包含如下面所述的核苷酸接头序列。
互接以形成本发明的基因融合构建物和修饰的基因融合构建物的核酸序列可以是脱氧核糖核酸的各种形式(例如，基因组DNA、cDNA、有义链序列、反义链序列、重组DNA、改组DNA、修饰DNA或者DNA类似物)。或者，这些核酸序列可以是核糖核酸(包括但不限于基因组RNA、信使RNA、催化RNA、有义链序列、反义链序列、重组RNA、改组RNA、修饰RNA或RNA类似物)。掺入本发明的融合构建物中的核酸序列也可以从一个或多个核酸序列文库中获得。
可采用本领域已知的许多技术制备本发明的基因融合构建物和修饰的基因融合构建物，如分子克隆技术。适用于构建重组核酸(如表达载体)的各种克隆和体外扩增方法对于熟练的技术人员来说是已知的。描述本文采用的分子生物学技术(包括诱变)的一般内容包括Berger和Kimmel，《分子克隆技术指南——酶学方法》(Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology)，第152卷，Academic出版社，San Diego，CA(“Berger”)；Sambrook等，《分子克隆——实验室手册》(第二版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，纽约，1989(“Sambrook”)；和《分子生物学当前的方法》，F.M.Ausubel等编辑，Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley & Sons，Inc.合资，2000年的增刊(“Ausubel”)。足以指导熟练的技术人员进行体外扩增方法的例子，包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导的技术(如NASBA)可在以下文献中获得Berger，Sambrook和Ausubel，以及Mullis等，(1987)，美国专利4683202；《PCR方法——方法和应用指南》(PCR Protocols A Guide to Methods and Applications)(Innis等编辑)，Academic Press Inc.，San Diego，CA(1990)；Arnheim & Levinson(1990年10月1日)，《化学和工程新闻》(Chemical and Engineering News)，36-47；《NIH研究期刊》(The Journal of NIH Research)(1991)，381-94；Kwoh等(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，861173；Guatelli等(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，871874；Lomell等(1989)，J.Clin.Chem.，351826；Landegren等(1988)，《科学》，2411077-1080；Van Brunt(1990)，《生物技术》(Biotechnology)，8291-294；Wu和Wallace，(1989)，《基因》(Gene)，4560；Barringer等(1990)，《基因》，89117，和Sooknanan和Malek(1995)，《生物技术》，13563-564。Wallace等(美国专利5426039)描述了体外克隆扩增的核酸的改进方法。Cheng等〔(1994)，《自然》，369684-685〕和其中的文献总结了采用PCR扩增大的核酸的改进方法，其中，获得达到40kb的PCR扩增子。熟练的技术人员将理解，采用反转录酶和聚合酶，任何RNA基本上都可以被转化入适合于限制性消化、PCR延伸以及测序的双链DNA中。参见Ausubel，Sambrook和Berger，同上。
可采用本领域已知的任何技术分离包含在基因融合构建物中的核酸序列。例如，可使用基于已知序列的寡核苷酸探针来鉴别cDNA或基因组DNA文库中的所需的基因。探针可用于与基因组DNA或cDNA序列杂交，以分离出相同或不同物种中的同源基因。或者，可使用针对酶而产生的抗体筛选用于相应的编码序列的mRNA表达文库。
或者，采用扩增技术可从核酸样品中扩增感兴趣的核酸。例如，聚合酶链反应(PCR)技术可用来直接从基因组DNA、cDNA、基因组文库或cDNA文库中扩增所需的基因。例如，PCR和其它体外扩增方法也可用于克隆编码要表达的蛋白质的核酸序列，用于制备用作检测样品中所需的mRNA是否存在的探针的核酸，用于核酸测序，或者用于其它目的。对于PCR的一般概述参见《PCR方案方法和应用指南》〔PCR Protocolsa Guide to methods and Applications，Innis，M，Geffand，D.，Sninsky，J.和White，T.，编，Academic出版社，圣迭戈(1990)〕。
如技术文献中所述，也可采用众所周知的技术合成多核苷酸。参见如Carruthers等.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47411-418(1982)，和Adams等，J.Am.Chem.Soc.105661(1983)。在适当条件下，通过合成互补链、然后将这些链退火，或通过使用适当的引物序列，用DNA聚合酶添加互补链，从而可得到双链DNA片段。
通常根据Beancage和Camthers(1981)Tetrahedron Letts.22(20)1859-1862所述的固相亚磷酰胺三酯方法，使用自动合成仪〔如Needham-VanDecanter等(1984)，Nucleic Acids Res.，126159-6168〕，化学合成用作探针的寡核苷酸(例如在体外扩增方法中)、用作基因探针的寡核苷酸、或用作改组的靶标(例如合成的基因或基因节段)的寡核苷酸。用于本发明的核酸构建物的寡核苷酸还可以从本领域技术人员知道的各种商业来源定做和定购。
在本发明的一些实施例中，基因融合构建物包括除了所述互接核酸序列外的元件，如启动子、增强子元件以及信号序列。启动子的例子包括CaMV启动子、从核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶-加氧酶小亚单元基因得到的启动子、遍在蛋白启动子和rolD启动子。增强子元件和信号序列的例子包括但不限于编码组织特异性转运肽的核酸序列(例如，叶绿体转运肽)。
在本发明的一些实施例中，制备了适用于转化植物细胞的基因融合构建物和/或修饰的基因融合构建物。编码所需核酸的DNA序列，例如编码酶结构域的cDNA或基因组序列，被方便地用于构建可导入所需植物中的重组表达盒。表达盒通常含有选择的核酸序列(修饰的或未修饰的，根据该构建物)，该序列操作性连接于启动子序列和其它转录和翻译起始调节序列，这些序列将指导从转化的植物的所需组织(如完整的植物、叶子、种子)中的基因得到的序列进行转录。
例如，可使用一种强的或弱的组成型植物启动子，该启动子将指导本文所述的基因融合构建物或修饰的基因融合构建物中的编码序列在植物的所有组织中表达。这些启动子在发育或细胞分化的大多数环境条件下和状态下是活跃的。组成型启动子的例子包括从根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)得到的1′-或2′-启动子，和从熟练的技术人员已知的各种植物基因中得到的其它转录起始区域。在从基因融合构建物中得到的基因的超表达对植物有害的情况下，熟练的技术人员在阅读了本公开内容后，将认识到可将弱的组成型启动子用于低水平的表达。在高水平的表达对植物无害的情况下，可使用强的启动子，如t-RNA或其它pol III启动子，或者强的pol II启动子，如花椰菜花叶病毒启动子。
或者，植物启动子可以处于环境的控制之下。这些启动子在此称为“可诱导的”启动子。可通过可诱导的启动子影响转录的环境条件的例子包括病原体攻击、厌氧菌条件，或者光的存在。
掺入本发明的基因融合构建物和/或修饰的基因融合构建物的启动子可以是“组织特异性的”，这样，在发育控制下，所需的基因仅在某些组织(如叶子和种子)中表达。在对于植物系统来说是内源性的一条或多条核酸序列被掺入构建物中的实施例中，从这些基因得到的内源启动子(或其变体)可用于指导这些基因在转染的植物中表达。组织特异性启动子还可用于指导异源结构基因的表达，包括本文所述的修饰的核酸。
通常，用于植物中的表达盒的具体启动子依赖于所需的应用。植物细胞中指导转录的启动子的任何数量都是合适的。启动子可以是组成型的或可诱导型的。除了上述启动子外，在植物中操作的细菌来源的启动子包括章鱼氨酸合成酶启动子、胭脂氨酸合成酶启动子和从天然的Ti质粒获得的其它启动子〔参见，Herrara-Estrella等(1983)，《自然》，303209-213〕。病毒启动子包括花椰菜花叶病毒的35S和19S RNA启动子〔Odell等(1985)，《自然》，313810-813〕。其它植物启动子包括核酮糖-1，3-二磷酸羧化酶小亚单元启动子和云扁豆蛋白启动子。也可使用从E8基因和其它基因获得的启动子序列。E8启动子的分离和序列在Deikman和Fischer(1988)，EMBO J.，73315-3327中有详细的描述。
为了鉴别候选的启动子，将基因组克隆的5′部分用于分析启动子序列的序列特征。例如，启动子序列元件包括TATA盒共有序列(TATAAT)，这个序列通常是转录起始位点的20-30碱基对上游。在植物中，在TATA盒的更上游，在-80到-100的位置上，通常是具有处于三核苷酸G(或T)周围的一系列腺嘌呤的启动子元件，如Messing等所述〔1983，《植物遗传工程》(Genetic Engineering in Plants)，Kosage等编，第221-227页〕。
在制备本发明的基因融合构建物或修饰的基因融合构建物时，还可使用除了启动子和互接的核酸序列以外的序列。如果需要正常的多肽表达，则可在改组的编码区域的3′端包含有多腺苷酸化区域。该多腺苷酸化区域可从天然的基因得到，也可从其它各种植物基因得到，或者从T-DNA得到。
基因融合构建物和/或修饰的基因融合构建物还可包括标记物基因，这种基因赋予植物细胞以可选择的表型。例如，该标记物可编码杀生物剂耐受性，尤其是抗生素耐受性，如针对卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素的耐受性，或者是除草剂耐受性，如针对氯斯路福龙(chlorosluforon)或膦丝菌素(除草剂双丙氨酰膦和草铵膦中的活性成分)的耐受性。
基因融合构建物还可含有按阅读框架与标记物序列融合的编码序列或其片段，该编码序列促进编码多肽的纯化。这种促进纯化的结构域包括但不限于金属螯合肽，如使纯化可在固定的金属上进行的组氨酸-色氨酸组件、结合谷胱甘肽的序列(如GST)、血凝素(HA)标记物〔对应于从流感血凝素蛋白得到的表位，Wilson，I.等(1984)，《细胞》，37767〕、麦芽糖结合蛋白序列、在FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp.，Seattle，WA)中使用的FLAG表位等等。在纯化结构域和酶结构域之间包含蛋白酶可解离的多肽接头对促进纯化是有用的。
例如，可用于本文所述的组合物和方法中的一个表达载体提供含有本发明多肽的融合蛋白的表达，该多肽与多组氨酸区域融合，而被肠激酶切割位点分开。组氨酸残基促进IMIAC上的纯化〔固定的金属离子亲和色谱法，如Porath等(1992)所述，《(蛋白质表达和纯化》，3263-281〕，而该肠激酶切割位点则提供一种从表达产物的其余部分分离出多组氨酸区域的方法。任选地使用pGEX载体(Amersham Pharmacia Biotech)将外源多肽表达为具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。还可任选地使用其它表达系统，如使表达得以在毕赤酵母属(Pichia)中进行的pPICz载体(Invitrogen)。通常，这种融合蛋白是溶解的，并且，通过吸附到配体琼脂糖珠(如在GST-融合物的例子中的谷胱甘肽-琼脂糖)，然后在游离配体的存在下进行洗脱，可容易地从裂解的细胞中纯化这种融合蛋白。
可采用本领域已知的各种方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的多肽，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水作用色谱法、亲和色谱法(如使用本文所述的任何一种标记系统)、羟基磷灰石色谱法以及凝集素色谱法。在一些例子中，需要使该蛋白质再折叠，以恢复成功能性产物。除了上述参考文献外，各种纯化方法在本领域中是已知的，包括以下文献所述如Sandana(1997)，《蛋白质的生物分离》，Academic出版公司；和Bollag等(1996)，《(蛋白质方法》，第2版，Wiley-Liss，NY；Walker(1996)，《蛋白质方法手册》，Humana出版社，NJ，Harris和Angal(1990)，《蛋白质纯化应用实际的方法》，IRL出版社，牛津，英格兰；Harris和Angal，《蛋白质纯化方法实际的方法》，IRL出版社，牛津，英格兰；Scopes(1993)，《蛋白质纯化原理和实践》，第3版，Springer Verlag，NY；Janson和Ryden(1998)，《蛋白质纯化原理、高分辨率方法和应用》，第2版，Wiley-VCH，NY；和Walker(1998)，《CD-ROM上的蛋白质方法》，Humana出版社，NJ。
也可使用无细胞转录/翻译系统来表达本发明的基因融合构建物。可从市售途径获得几种这样的系统。体外转录和翻译方法的一般指导可从Tymms(1995)的《体外转录和翻译方法分子生物学方法)》(第37卷，Garland出版社，NY)中获得。
本发明还包括含有本发明两种或多种核酸的组合物(如用于重组的底物)。该组合物可含有重组核酸的文库，其中该文库含有至少2种、至少3种、至少5种、至少10种、至少20种或至少50种或更多的核酸。可任选地将这些核酸克隆到表达载体中，提供表达文库。
本发明还包括由使用限制性核酸内切酶、RNA酶或DNA酶消化一种或多种本发明的核酸而获得的组合物(如，与上述以某些重组形式进行的一样)；和通过采用机械方法(如超声波、涡旋等)分段或剪切一条或多条本发明多核苷酸而得到的组合物，这种组合物还可用于提供底物，用于上述方法中的重组。类似地，可将含有对应于本发明一种以上核酸的寡核苷酸的组合物用作重组底物，这也是本发明的一个特征。为了方便，将这些片段化的、剪切的或寡核苷酸合成的混合物都称为片段化核酸组。
本发明还包括通过在核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸以及核酸聚合酶的存在下培育一种或多种上述片段化核酸组而获得的组合物。所获得的这种组合物形成了一种重组混合物，可用于上述许多种重组形式。核酸聚合酶可以是RNA聚合酶、DNA聚合酶或者RNA指导的DNA聚合酶(如“反转录酶”)；聚合酶可以是如热稳定的DNA聚合酶(如VENT、TAQ等等)。
上面描述了用于生产和分离本发明融合蛋白的重组方法。除了重组生产外，可采用固相技术进行直接的肽合成生产多肽〔例如，可参见，Stewart等(1969)，固相肽合成，WH Freeman公司，San Francisco；Merrifield J(1963)，J.Am.Chem.Soc.，852149-2154〕。可采用人工技术或自动化技术进行肽合成。可使用AppliedBiosystems 431A肽合成仪(Perkin Elmer，Foster City，加州)，根据制造商提供的说明书进行自动合成。例如，可分开地化学合成亚序列，然后采用化学方法将其组合，得到全长的融合蛋白。或者，可从任何专门从事多肽生产的各公司订购这种序列。通过使编码核酸表达，和回收多肽，从而产生本发明的大多数通常的融合蛋白，如上所述。
修饰核酸序列以形成修饰的基因融合构建物在本发明的一些实施例中，使用修饰的基因融合构建物。修饰基因融合构建物中的一条或多条核酸序列的方法包括，与该蛋白质或酶结构域的最初鉴别的或“亲本”序列相比，使所述一条或多条核酸序列发生变化。改变序列的方法可导致如单一的核苷酸取代，多个核苷酸取代，以及核酸序列的区域的插入或缺失。
可获得各种产生多样性的方法，这些方法在本领域中有描述。这些方法可分开使用，和/或组合，以产生一种或多种核酸或核酸组的变体，以及编码的蛋白质的变体。单独或总的来说，这些方法提供了强化的、可广泛应用的产生多样的核酸和核酸组(包括如核酸文库)的方法，以用于核酸、蛋白质、途径、和具有新的和/或改进的特性的细胞和/或生物的改变、工程加工或快速进化。
虽然在随后的讨论中，为了清楚而进行区分和分类，但是应理解这些技术通常并不是相互排斥的。实际上，可单独或组合、平行或依次采用各种方法，从而获得多样的序列变体。
本文所述的任一产生多样性的方法的结果可以是产生一种或多种核酸，这些方法可用于选择或筛选编码具有所需特性或赋予所需特性的蛋白质的核酸。在采用本发明一种或多种方法或熟练的技术人员可获得的方法进行多样化之后，可根据所需的活性或特性(如编码从一个或多个代谢途径中获得的多酶结构域)选择所产生的任何核酸。这可包括采用由本领域的任何检测，如以自动或可自动的方式鉴别可被检测到的任何活性或活性组。例如，可测定胡萝卜素化合物、外蛋白、各种聚羟基链烷酸酯、大量的芳族聚酮化合物或其它代谢途径产物或副产物的生物合成，如下文更详细的描述。或者，可采用本领域已知的各种试验检测单个酶的活性。此外，可以顺次或平行的方式，由实施者根据自己的判断评估许多相关(甚或不相关的)的特性。
用于产生编码多酶结构域的修饰核酸序列的各种产生多样性方法的描述可在以下出版物和参考文献中获得Soong，N.等(2000)，“病毒的分子繁殖”，“自然遗传学”，25(4)436-39；Stemmer等(1999)，“用于靶向和其它临床性能的病毒的分子繁殖”，“肿瘤靶标”，414；Ness等(1999)，“枯草蛋白酶的亚基因组序列的DNA改组”，“自然生物技术”，17893-896；Chang等(1999)，“使用DNA家族改组的细胞因子的进化”，“自然生物技术”，17793-797；Minshull和Stemmer(1999)，“采用分子繁殖进行的蛋白质进化”，“当前的化学生物学观点”，3284-290；Christians等(1999)，“使用DNA家族改组进行的用于AZT磷酸化的胸苷激酶的直接进化”，“自然生物技术”，17259-264；Crameri等(1998)，“从不同的物种得到的基因家族的DNA改组加速了直接的进化”，“自然”，391288-291；Crameri等(1997)，“采用DNA改组进行的砷酸盐解毒途径的分子进化”，“自然生物技术”，15436-438；Zhang等(1997)，“采用DNA改组和筛选由半乳糖苷酶进行有效的岩藻糖苷酶的直接进化”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，944504-4509；Patten等(1997)，“将DNA改组应用于药物和疫苗”，“当前的生物技术观点”，8724-733；Crameri等(1996)，“采用DNA改组进行的抗体-噬菌体文库的构建和进化”，“自然医学”，2100-103；Crameri等(1996)，“采用DNA改组由分子进化获得的改进的绿荧光蛋白质”，“自然生物技术”，14315-319；Gates等(1996)，“通过在lac阻抑物‘帽子形二聚体’(headpiece dimer)上显示由肽文库进行配体的亲和选择性分离”，“分子生物学期刊”，255373-386；Stemmer(1996)，“性PCR和装配PCR”，“分子生物学百科全书”，VCH出版社，纽约，第447-457页；Crameri和Stemmer(1995)，“组合的多盒突变产生诱变和野生型盒所有的置换”，“生物技术”，18194-195；Stemmer等(1995)，“对基因和完整的质粒进行单步装配，形成大量的寡脱氧核糖核苷酸”，“基因”，16449-53；Stemmer(1995)，“分子计算的发展”，“科学”，2701510；Stemmer(1995)，“探索序列空间”，“生物技术”，13549-553；Stemmer(1994)，“通过DNA改组在体外进行蛋白质的快速发展”，“自然”，370389-391；和Stemmer(1994)，“采用随机片段化和装配进行的DNA改组分子发展的体外重组”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9110747-10751。
产生多样性的突变方法包括如定点诱变〔Ling等(1997)，“DNA诱变的方法综述”，“分析生物化学”，254(2)157-178；Dale等(1996)，“使用硫代磷酸酯法进行寡核苷酸指导的随机诱变”，“分子生物学方法”，57369-374；Smith(1995)，“体外突变”，“遗传学年评”，19423-462；Botstein & Shortle(1985)，“体外诱变的策略和应用”，“科学”，2291193-1201；Carter(1986)，“定点诱变”，“生物化学杂志”，2371-7；和Kunkel(1987)，“寡核苷酸指导的诱变的效率”，“核酸和分子生物学”，Eckstein，F.和Lilley，D.M.J.编辑，SpringerVerlag，Berlin〕；使用含有模板的尿嘧啶进行的诱变〔Kunkel，1985，“不进行表型选择的快速和有效的位点特异性诱变”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488-492；Kunkel等(1987)，“不进行表型选择的快速和有效的位点特异性诱变”，“酶学方法”，154367-382；和Bass等(1988)，“具有新的DNA-结合特异性的突变Trp阻抑物”，“科学”，242240-245；寡核苷酸指导的诱变《酶学方法》，100468-500，1983；《酶学方法》，154329-350(1987)；Zoller & Smith(1982)，“使用M13衍生的载体进行寡核苷酸指导的诱变在任何DNA片段中生产点突变的有效和一般方法”，“核酸研究”，106487-6500；Zoller & Smith(1983)，“克隆到M13载体中的DNA片段的寡核苷酸指导的诱变”，“酶学方法”，100468-500；和Zoller&Smith(1987)，“寡核苷酸指导的诱变使用两种寡核苷酸引物和单链DNA模板的简单方法”，“酶学方法”，154329-350〕；硫代磷酸酯修饰的DNA诱变(Taylor等，1985)，“在限制酶反应中使用硫代磷酸酯修饰的DNA制备裸DNA”，“核酸研究”，138749-8764；Taylor等(1985)，“使用硫代磷酸酯修饰的DNA以高频率快速产生寡核苷酸指导的突变”，“核酸研究”，138765-8787(1985)；Nakamaye&Eckstein(1986)，“硫代磷酸酯基团对限制性核酸内切酶Nci I切割的抑制及其在寡核苷酸指导的诱变中的应用”，《核酸研究》，149679-9698；Sayers等(1988)，“基于硫代磷酸酯的寡核苷酸指导的诱变中的Y-T核酸外切酶”，《核酸研究》，16791-802；和Sayers等(1988)，“通过在溴乙锭的存在下与限制性核酸内切酶反应对含有硫代磷酸酯的DNA进行链特异性切割”，《核酸研究》，16803-814〕；使用带缺口的双链体DNA进行的诱变〔Kramer等(1984)〕，“用于寡核苷酸指导的突变构建的带缺口的双链体DNA方法”，《核酸研究》，129441-9456；Kramer&Fritz(1987)，《酶学方法》，“经带缺口的双链体DNA进行的寡核苷酸指导的构建的突变”，154350-367；Kramer等(1988)，“在用于寡核苷酸指导的构建的突变的带缺口的双链体DNA方法中改进的体外酶反应”，《核酸研究》，167207；和Fritz等(1988)，“寡核苷酸指导的构建的突变没有体外酶反应的带缺口的双链体DNA法”，《核酸研究》，166987-6999〕。
额外的合适方法包括点错配修复〔Kramer等(1984)，“点错配修复”，“细胞”，38879-887〕，使用修复缺陷的宿主株进行的诱变〔Carter等(1985)，“使用M13载体进行改进的寡核苷酸定点诱变”，《核酸研究》，134431-4443；和Carter(1987)，“使用M13载体进行改进的寡核苷酸指导的诱变”，“酶学方法”，154382-403〕，缺失诱变〔Eghtedarzadeh & Henikoff(1986)，“使用寡核苷酸产生大的缺失”，《核酸研究》，145115〕，限制性选择和限制性效率和〔Wells等(1986)，“氢键形成对于使枯草蛋白酶的过渡态稳定的重要性”，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A，317415-423〕，通过总基因合成进行的诱变〔Nambiar等(1984)，“编码核糖核酸酶S蛋白的基因的总合成和克隆”，“科学”，2231299-130l；Sakamar和Khorana(1988)，“用于牛杆菌外片段鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(转导素)的亚基的基因的总合成和表达”，《核酸研究》，146361-6372；Wells等(1985)，“盒诱变在限定位点上产生多个突变的有效方法”，“基因”，34315-323；和Gmndstrom等(1985)，“由微量‘鸟枪’基因合成进行的寡核苷酸指导的诱变”，《核酸研究》，133305-3316〕，双链断裂修复〔Mandecki(1986)；Arnold(1993)，“用于异常环境的蛋白质工程”，“当前的生物技术观点”，4450-455；“大肠杆菌质粒中的寡核苷酸指导的双链断裂修复一种定点诱变方法”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，837177-7181〕。上述方法的更多细节可在“酶学方法”第154卷中获得，该卷还描述了用各种诱变方法有效控制故障问题。
关于各种产生多样性的方法的更详细的描写可从以下美国专利、PCT出版物和EPO出版物中找到Stemmer的美国专利5605793(1997年2月25日)，《体外重组的方法》；Stemmer等的美国专利5811238(1998年9月22日)，《通过反复选择和重组产生具有所需特性的多核苷酸的方法》；Stemmer等的美国专利5830721(1998年11月3日)，《采用随机片段化和装配进行的DNA诱变》；Sremmer等的美国专利5834252(1998年11月10日)，《端互补聚合酶反应》；Minshull等的美国专利5837458(1998年11月17日)，《用于细胞和代谢工程的方法和组合物》；WO 95/22625，Stemmer和Crameri，《采用随机片段化和装配进行的诱变》；Stemmer和Lipschuz的WO 96/33207，《端互补聚合酶链式反应》；Stemmer和Cremeri的WO 97/20078，《通过反复选择和重组产生具有所需特性的多核苷酸的方法》；Minshull和Stemmer的WO 97/35966，《用于细胞和代谢工程的方法和组合物》；Punnonen等的WO 99/41402，《遗传疫苗载体的靶标》；Punnonen等的WO 99/41383，《抗原库免疫》；Punnonen等的WO 99/41369，《遗传疫苗载体工程》；Punnonen等的WO 99/41368，《遗传疫苗的免疫调节性能的优化》；Stemmer和Crameri的EP 752008，《采用随机片段化和装配进行的DNA诱变》；Stemmer的EP 0932670，《采用循环序列重组发展细胞DNA摄取》；Sremmer等的WO 99/23107，《采用病毒基因组改组进行的病毒向性和宿主范围的修饰》；Apt等的WO 99/21979，《人乳头瘤病毒载体》；del Cardayre等的WO 98/31837，《采用循环序列重组发展全细胞和生物体》；Patten和Stemmer的WO 98/27230，《用于多肽工程的方法和组合物》；Sremmer等的WO 98/13487，《采用循环序列改组和选择进行的优化基因治疗的方法》，WO 00/00632，《产生高度不同的文库的方法》，WO 00/09679，《获得体外重组多核苷酸序列库和所产生的序列的方法》；Arnold等的WO 98/42832，《使用随机的或限定的引物重组多核苷酸序列》；Arnold等的WO 99/29902，《产生多核苷酸和多肽序列的方法》；Vind的WO 98/41653，《构建DNA库的体外方法》；Borchert等WO 98/41622，《使用DNA改组构建文库的方法》；和Pati和Zariing的WO 98/42727，《使用同源重组进行的序列改变》；Patten等的WO 00/18906，《密码子改变的基因的改组》；Cardayre等的WO 00/04190，《采用循环序列重组发展全细胞和生物体》；Crameri等的WO 00/42561，《寡核苷酸介导的核酸重组》；Selifonov和Stemmer的WO00/42559，《用于进化刺激中的增加数据结构的方法》；Salifonov等的WO00/42560，《制备特征链、具有所需特征的多核苷酸和多肽的方法》；Welch等的WO 01/23401，《将密码子改变的寡核苷酸合成用于合成性改组》；以及Affholter的PCT/US01/06775，《单链核酸模板介导的重组和核酸片段分离》。
某些美国申请还提供了关于产生多样性的方法的更详细的描述，包括Patten等在1999年9月28日提交的《密码子改变的基因的改组》(USSN 09/407800)；delCardayre等在1998年7月15日(USSN 09/166188)和1999年7月15日(USSN09/354922)提交的《采用循环序列重组发展全细胞和生物体》；Crameri等在1999年9月28日提交的《寡核苷酸介导的核酸重组》(USSN 09/408392)；Crameri等在2000年1月18日提交的《寡核苷酸介导的核酸重组》(PCT/US00/01203)；Welch等在1999年9月28日提交的《将基于密码子的寡核苷酸合成用于合成性改组》(USSN 09/408393)；Selifonov等在2000年1月18日提交的《制备特征链、具有所需特征的多核苷酸和多肽的方法》(PCT/US00/01202)；和例如Selifonov等在200年7月18日提交的《制备特征链、具有所需特征的多核苷酸和多肽的方法》(USSN09/618579)；Selifonov和Stemmer在2000年1月18日提交的《用于进化刺激中的繁殖数据结构的方法》(PCT/US00/01138)；Affholter的《单链核酸模板介导的重组和核酸片段分离》(USSN 60/186482，2000年3月2日提交)。
简言之，可将序列修饰方法的几种不同的一般类别，如突变、重组等用于本发明的方法，这些方法在如上面的文献中有描述。即，可在互接序列之前或互接之后，采用所述任何数量的方法，将组分核酸序列改成生产得到的修饰的基因融合构建物。下文举例阐述了本发明中的一些产生多样性的不同类型的优选方式，包括如某些基于重组的产生多样性的方式。
可采用上述文献中所讨论的任一种技术在体外将核酸重组，包括如对要重组的核酸进行DNA酶消化，然后将这些核酸连接和/或PCR重装配。例如，可采用性PCR诱变，其中，使DNA分子的随机(或者是假随机，甚或非随机)片段根据序列相似性与具有不同但是相关的DNA序列的DNA分子之间体外重组，接着通过在聚合酶链式反应中延伸而进行交叉固定。在上述几个参考文献中描述了这种方法以及许多方法的变化形式，如Stemmer(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9110747-10751。
类似地，可在体内循环地重组核酸，如使重组在细胞中的核酸之间发生。上述文献中描述了许多这样的体内重组方式。这样的方式可任选地在感兴趣的核酸之间产生直接的重组，或者在含有感兴趣的核酸的载体、病毒、质粒等之间产生重组，其它方式也一样。关于这些方法的细节可在上述文献中获得。
也可采用全基因组重组方法，在该方法中，细胞或其它生物体的全基因组被重组，任选地包括使用所需的库成分强化基因组重组混合物(如对应于本发明途径的基因)。这些方法具有许多应用，包括在靶基因的身份未知的情况中。关于这些方法的细节，可在以下文献中获得如del Cardayre等的WO 98/31837，《采用循环序列重组发展全细胞和生物体》和del Cardayre等的PCT/US99/15972，《采用循环序列重组发展全细胞和生物体》。因此，可单独或组合采用任何一种这样的重组方法和技术重组、循环重组和全基因组重组，产生本发明的修饰的核酸序列和/或修饰的基因融合构建物。
还可采用合成性重组法，在该方法中，对应于感兴趣的靶标的寡核苷酸被合成，然后再在PCR或连接反应中被重新装配，这些寡核苷酸包括对应于一种以上亲本核酸的寡核苷酸，这样可产生新的重组核酸。可采用标准的核苷酸加入法制得寡核苷酸，或者，可采用如三核苷酸合成法制得。关于这些方法的细节可在上述文献中获得，包括Crameri等的WO 00/42561，《寡核苷酸介导的核酸重组》；Welch等的WO 01/23401，《将密码子改变的寡核苷酸合成用于合成性改组》；Selifonov等的WO 00/42560，《制备特性链、具有所需特性的多核苷酸和多肽的方法》；以及Selifonov和Stemmer的WO 00/42559，《用于进化刺激中增加数据结构的方法》。
可采用原硅(in silico)重组方法，其中，在计算机中使用遗传算法重组对应于同源(乃至非同源)核酸的序列链。通过对应于重组序列的核酸的合成，将所得的重组序列链任选地转化成核酸，如与寡核苷酸合成/基因重装配技术一致。这种方法可产生随机的、部分随机的或设计的变体。关于原硅重组的许多细节，包括遗传算法、遗传操纵子在计算机系统中的使用、与产生相应的核酸(和/或蛋白质)相结合、以及所设计的核酸和/或蛋白质(如基于跨越位点选择)的组合以及设计的、假随机的或随机的组合方法，在以下文献中描述Selifonov等的WO 00/42560，《制备特性链、具有所需特性的多核苷酸和多肽的方法》；Selifonov和Stemmer的WO 00/42559，《用于进化刺激中增加数据结构的方法》。关于原硅重组法的更多细节可在这些文献中获得。通常可将这种方法用于本发明，以原硅提供编码各种代谢途径(如类胡萝卜素生物合成途径、外蛋白生物合成途径、聚羟基链烷酸酯生物合成途径、芳族聚酮化合物生物合成途径等)中涉及的蛋白质的核酸序列和/或基因融合构建物的重组，和/或产生相应的核酸或蛋白质。
可类似地采用评估天然多样性的许多方法，如通过使不同的核酸或核酸片段与单链模板杂交，接着进行聚合作用和/或连接作用，产生全长序列，然后任选地使模板降解，回收所得的修饰核酸。在使用单链模板的一个实施例中，使从基因组库获得的片段种群与对应于相反链的部分的或通常约全长的ssDNA或RNA退火。然后使用核酸酶除去非杂交片段末端介导从此种群获得的复杂的嵌合基因的装配，聚合填满这些片段之间的空隙，接着进行单链连接。可通过消化(如，如果含有RNA或尿嘧啶)、在变性条件下的磁力分离(如果以有益于这种分离的方式标记)和其它可获得的分离/纯化方法除去亲本多核苷酸链。或者，使亲本多核苷酸任选地与嵌合链共纯化，并在随后的筛选和加工步骤中除去。关于这种方法的更多细节可在Affholter的PCT/US01/06775(《(单链核酸模板介导的重组和核酸片段分离》)中获得。
在另一种方法中，将单链分子转化成双链DNA(dsDNA)，然后通过配体介导的结合使该dsDNA分子结合到固相载体上。在将未结合的DNA分离后，从载体上释放出选择的DNA分子，然后将其导入合适的宿主细胞中，产生富含有与探针杂交的序列的文库。由此产生的文库为采用本文所述任一种方法进行的进一步多样化提供了所需的底物。
前述任一种一般的重组形式都可以反复的方式进行(如突变/重组一个或多个循环，或者其它产生多样性的方法，任选地采用一种或多种选择方法)，产生更多样的重组核酸组。
还已提出采用多核苷酸链终止法进行诱变〔例如，参见Short的美国专利5965408，《采用中断合成法重装配DNA的方法》，以及上面的文献〕，并可将该方法用于本发明。在此方法中，在对该基因特异的引物的存在或缺乏的情况下，将对应于具有序列相似性的一个或多个基因共享区域的双链DNA混合。然后使这些单链多核苷酸退火，并在聚合酶和链终止剂(如，紫外光、γ射线或X-射线；溴乙锭或其它嵌入剂；DNA结合蛋白，如单链结合蛋白、转录激活因子或者组蛋白；多环芳烃；三价铬或三价铬盐；或者由快速热循环介导的简易聚合；等等)的存在下培育，得到部分双链体分子。然后使这些部分双链体分子(如含有部分延伸的链)变性，并在随后的复制和部分复制循环中再退火，得到共享有不同程度的序列相似性的多核苷酸，这些多核苷酸与起始的DNA分子种群相比是多样化的。任选地，在该方法中，可在一个或多个阶段扩增所得产物或者产物的部分合并物。由链式终止法(如上述)制得的多核苷酸是用于任何其它所述的重组方式的合适底物。
还可采用称为Ostermeier等(1999)在“与DNA同源性无关的杂交酶的组合方法”〔《自然生物技术》，171205〕中所述的“用于产生杂交酶的增量截短”(incremental truncation for the creation of hybrid enzyme，ITCHY)的重组方法在核酸或核酸种群中产生多样性。可采用这种方法产生变体的原始文库，该文库可任选地作为用于一种或多种体外或体内重组方法的底物。还可参见Ostermeier等(1999)，“采用增量截短进行的组合蛋白质工程”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，963562-67；Ostermeier等(1999)，“在新颖的生物催化剂的工程中以增量截短作为策略”，《生物和医学化学》，72139-44。
可有利地采用用于产生单个核苷酸或者成组的邻接或非邻接核苷酸的改变的突变方法，将核苷酸多样性导入本发明的核酸序列和/或基因融合构建物中。许多诱变方法可在上述文献中获得；关于诱变方法的更详细细节可在下文获得，这些细节也被应用于本发明。
例如，可采用易错PCR产生核酸变体。采用这种技术，在DNA聚合酶复制逼真度低的条件下进行PCR，这样可沿着PCR产物的整个长度获得高比例的点突变。这些技术的例子可上述文献中获得，以及Leung等(1989)，《技术》，111-15；和Caldwell等(1992)，《PCR方法应用》，228-33。类似地，在涉及从小DNA片段的混合物获得的PCR产物的装配的过程中，可采用装配PCR。可在相同的反应混合物中平行发生大量不同的PCR反应，一个反应的产物引发另一反应的产物。
可采用寡核苷酸指导的诱变在感兴趣的核酸序列中导入位点特异性突变。这类技术的例子可在上述文献中获得，以及Reidhaar-Olson等(1988)，《科学》，24153-57。类似地，在使用与天然序列不同的合成性寡核苷酸盒替换双链DNA分子的小区域的过程中，可采用盒诱变。寡核苷酸可含有如完全和/或部分随机化的天然序列。
反复整体诱变(recursive ensemble mutagenesis)是一种将用于蛋白质诱变的算法用于产生表型相关的突变体的不同种群的方法，该突变体的数量在氨基酸序列上不同。这种方法使用反馈机制监测组合型盒诱变的连续循环。这种方法的例子可在Arkin & Youvan(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，897811-7815中获得。
可采用指数整体诱变产生具有高百分数的独特和功能性突变体的组合型文库。感兴趣的序列中的少量残基在鉴别各改变位置上导致功能性蛋白质的氨基酸的同时被随机化。这类方法的例子可在Delegrave & Youvan(1993)，《生物技术研究》，111548-1552中获得。
可采用体内诱变，通过在携带有一个或多个DNA修复途径中的突变的大肠杆菌株中繁殖DNA，在感兴趣的任何克隆DNA中产生随机突变。这些“增变”株比野生型亲本具有较高的随机突变率。使DNA在一个这样的株中繁殖，最终将在该DNA中产生随机突变。这些方法在上述文献中有描述。
在基因组(如细菌、真菌、动物或植物基因组)中产生多样性的其它方法可与上述和/或所参考的方法一起使用。例如，除了上述方法外，还已提出产生适用于转化到各种物种中的核酸多聚体的技术(例如，可参见Schellenberger，美国专利5756316和上述参考文献)。用这类由相互之间不同的基因(如从天然的多样性得到的，或者通过采用定点诱变、易错PCR获得的，通过诱变细菌株传代获得的等等)组成的多聚体对合适的宿主进行转化，可提供用于DNA多样化的核酸多样性的来源，如通过上述体内重组方法。
或者，可将共享有部分序列相似性的区域的多数单体多核苷酸转化到宿主物种中，由宿主细胞在体内进行重组。接下来的细胞分裂可产生文库，文库的成员包括单一的、同源的种群，或者单体多核苷酸的合并物。或者，可采用标准的技术(如PCR和/或克隆)回收单体核酸，然后以任一种重组方式进行重组，包括上面所述的反复重组方式。
已描述了产生多物种表达文库的方法〔除了上述参考文献以外，还包括如Peterson等(1998)，美国专利5783431，《产生和筛选新颖代谢途径的方法》；和Thompson等(1998)，美国专利5824485，《产生和筛选新颖的代途径的方法》〕，还提出了它们在鉴别感兴趣的蛋白质活性方面的用途〔除了上述文献以外，还可参见Short(1999)的美国专利5958672，《具有从未培育的微生物中获得的DNA的克隆的蛋白质活性筛选》〕。通常，多物种表达文库包括含有从多种物种或菌株获得的cDNA或基因组序列的文库在表达盒中操作性连接于适当的调节序列。该cDNA和/或基因组序列可任选地随机连接，以进一步提高多样性。载体可以是适用于在一种以上宿主生物体(如细菌物种、真核细胞)中转化和表达的穿梭载体。在一些例子中，通过预先选择编码感兴趣的蛋白质的序列，或者与感兴趣的核酸杂交的序列，使得该文库产生偏倚。任何这样的文库可用作本文所述任一中方法的底物。
已广泛采用上述方法增加核酸和/或编码的蛋白质多样性。但是，在许多情况中，并不是所有的多样性都是有用的，如功能方面，多样性仅仅有助于增加必须被筛选或选择的变体的背景、以鉴别少数有利的变体。在一些应用中，需要在多样化之前预先选择或预先筛选文库(如扩增的文库、基因组文库、cDNA文库、归一化文库等等)或其它底物核酸，例如，通过基于重组的诱变方法，或者需要使这些底物对编码功能性产物的核酸有偏倚。例如，在抗体工程中，通过在采用上述任一种方法进行人工操作前利用体内重组事件，有可能使产生多样性的方法对具有功能性抗原结合位点的抗体产生偏倚。例如，可在采用本文所述的任一种方法进行多样化之前，先将从B细胞cDNA文库获得的重组CDR扩增，然后装配到构架区域中〔如Jirholt等(1998)，“利用序列空间体内将形成的互补性测定区域改组到主要构架中”，《基因》，215471〕。
文库也针对编码具有所需的酶活性的蛋白质的核酸产生偏倚。例如，在从具有特殊活性的文库中鉴别一个克隆后，可采用任何已知的方法使该克隆诱变，以在其中产生DNA改变。然后根据所需的活性筛选出含有诱变的同系物的文库，该活性可能与初始的特殊活性相同，或者不同。这种方法的一个例子是Short(1999)在美国专利5939250〔《通过诱变产生具有所需活性的酶》〕中提出的。可采用本领域已知的任何方法鉴别所需的活性。例如，WO 99/10539提出，可通过使从基因文库获得的抽提物与从代谢旺盛的细胞获得的成分相混合，然后鉴别具有所需活性的组合物，从而可筛选出基因文库。还提出(如WO 98/58085)，通过将生物活性底物插入文库的样品中，然后使用荧光分析仪(如流式细胞仪装置、CCD、荧光计或光谱仪)检测对应于具有所需活性的产物的生物活性荧光，从而可鉴别出具有所需活性的克隆。
文库还可针对具有特殊特性(如与选择的核酸探针杂交)的核酸产生偏倚。例如，申请WO 99/10539提出，可以下述方式从基因组DNA序列中鉴别出编码所需活性的多核苷酸(如酶活性，例如脂肪酶、酯酶、蛋白酶、糖苷酶、糖基转移酶、磷酸酶、激酶、加氧酶、过氧化物酶、水解酶、水合酶、腈水解酶、转氨酶、酰胺酶或酰基转移酶)。使从基因组DNA种群中获得的单链DNA分子与偶联配体的探针杂交。可从培育的或未培育的微生物得到基因组DNA，或者从环境样品中得到。或者，可从多细胞生物或其组织得到基因组DNA。可从事先从捕获培养基中释放的或未释放的用于捕获的杂交探针直接进行第二链合成，或者可采用本领域已知的各种其它策略进行。或者，可不需进一步克隆就将分离的单链基因组DNA种群片段化，然后将其直接用于如基于重组的方法(如上述，该方法使用单链模板)中。
在Short的WO 00/46344〔《遗传疫苗和酶的非随机性产生》〕中描述了产生核酸和多肽的“非随机性”方法。这些方法，包括所提出的非随机性多核苷酸重装配和位点饱和性诱变方法都可用于本发明。采用掺杂或简并寡核苷酸进行随机或半随机诱变也有描述，如Arkin和Youvan(1992)，“优化核苷酸混合物，以编码用于半随机诱变的氨基酸的特殊亚类”，Biotechnology，10297-300；Reidhaar-Olson等(1991)，“使用寡核苷酸盒对蛋白质序列进行随机诱变”，MethodsEnzymol.，208564-86；Lim和Sauer(1991)，“内部包装相互作用在测定蛋白质的结构和稳定性中的作用”，J.Mol.Biol.，219359-76；Breyer和Sauer(1989)，“单克隆抗体51F与λ阻抑物的良好特异性结合的突变分析”，J.Biol.Chem.，26413355-60；和《初排(walk-through)诱变》(Crea，R，美国专利5830650和5798208；EP专利0527809 B1)。
很容易理解，上述适用于在多样化前先使文库富集化的技术也可用于筛选由产生多样性方法获得的产物、或者产物文库。
用于诱变、文库构建和其它产生多样性的方法的试剂盒也可从商业途径获得。例如，可从Stratagene(如QuickChangeTM定点诱变试剂盒；和ChameleonTM双链、定点诱变试剂盒)、Bio/Can Scientific、Bio-Rad(如，使用上述Kunkel方法)、Boehringer Mannheim Corp.、Clonetech Laboratories、DNA Technologies、EpicentreTechnologies(如5引物3引物试剂盒)；Genpak Inc、Lemargo Inc、Life Technologies(Gibco BRL)、New England Biolabs、Pharmacia Biotech、Promega Corp.、QuantumBiotechnologies、Amersham International plc(如，采用上述Eckstein法)和AnglianBiotechnology Ltd(如，采用上述Carter/Winter法)。
上述参考文献提供了许多突变方式，包括重组、循环重组、循环突变和重组或者具有其它诱变形式的重组，以及这些方式的许多改动形式。不管采用哪种产生多样性的方式，都可以重组本发明的核酸〔相互之间，或者相关(乃至无关)序列〕，产生用于本发明的基因融合构建物和修饰的基因融合构建物的重组核酸的不同组合，如同源核酸以及相应的多肽的组合。
上述许多用于产生修饰的核酸序列的方法产生了亲本序列或序列的大量不同的变体。在本发明的一些优选实施例中，采用经改动的技术(如改组的一些形式)产生变体的文库，然后用此文库筛选编码一些所需功能特性的修饰核酸或者修饰核酸的合并物。这种所需的功能特性较佳是酶活性在某些方面优于由亲本序列所编码的酶活性。可用于筛选酶活性的例子包括催化速率(通常以动力学常数如Kcat和KM表征)、底物特异性、和对底物、产物或其它分子(如抑制剂或激活剂)的激活或抑制的易感性。
在本发明的一些优选实施例中，通过检测预计修饰核酸的表达产物参与的代谢途径的功能，从而筛选和/或选择出该修饰核酸。如果给定核酸的特殊修饰导致其基因产物的功能发生改变，这常常在该途径的输出物中发生可检测的变化。例如，增强催化代谢途径中限速或部分限速步骤的酶结构域的活性的修饰有可能增加表达该修饰核酸的细胞中产物形成的速率。因此，可通过筛选生产较高水平的代谢途径产物的宿主细胞，从而鉴别出编码增强的酶活性的修饰核酸。一个非限制性例子是，通过检测增加胡萝卜素产量的宿主细胞，筛选在胡萝卜素合成途径中酶的增强的活性。在此例中，胡萝卜素的颜色特征促进了该筛选过程，这又使得可通过检测与胡萝卜素有关的肉眼可见的颜色的强度来检测改进的修饰核酸。
选择所需的酶活性的一个例子需要使宿主细胞在这样的条件下生长抑制表达感兴趣的酶活性和/或代谢途径不足的细胞的生长和/或生存。采用这种方法可淘汰除了编码所需的酶活性的修饰核酸以外的所有修饰核酸。例如，在本发明的一些实施例中，将宿主细胞维持在没有足够水平的感兴趣的酶和/或代谢途径的产物时抑制细胞生存的条件下。在这些条件下，仅有具备如下特性的宿主细胞能生存和生长具有编码能催化生产足够水平的产物的酶活性的修饰核酸。例如，通过使宿主细胞在高盐条件下生长，可筛选出增强的外蛋白合成活性，如下面的实施例1所述。
为了方便以及获得高通量，常常需要筛选/选择微生物(如细菌，如大肠杆菌)中的所需的修饰核酸。另一方面，在一些例子中，植物细胞或植物中的筛选将是优选的，其最终的目的是产生用于在植物系统中表达的修饰核酸。
在本发明的一些优选的实施例中，通过筛选表达不同的修饰核酸(单独的或者作为基因融合构建物的一部分)的宿主细胞的合并物来增加通量。可对显示出显著活性的任何合并物去褶合，以鉴别表达所需活性的单一克隆。
熟练的技术人员将认识到，相关的检测、筛选或选择方法将根据具体的酶或代谢途径而改变。通常，有利的是使用可以高通量形式实施的检测。
在高通量检测中，有可能在一天内就筛选到几千种不同的变体。例如，可使用微滴定板的各个孔实施分离检测，或者，如果要观察浓度或培育时间效果，每5-10个孔可测试一种单一的变体。
除了液体方法以外，如上述，有可能以简单的方式使细胞在用于选择所需的酶或代谢功能的培养基平板上生长。这种方法提供了一种简单和高通量的筛选方法。
还已开发了许多已知的机器人系统，用于检测系统中的溶液相化学组成。这些系统包括自动工作站，如Takeda Chemical Industries，LTD.(大阪，日本)开发的自动合成装置和许多使用机器人臂的机器人系统(zymate II，Zymark公司，Hopkinton，MA；Orca，Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)，该系统模拟科学家进行的人工合成操作。上述任一设备都适合在本发明中应用。对这些装置(如果有的话)的性质和实施作出改动以使它们如本文所述可根据整合系统操作对于相关领域的熟练技术人员来说是明显的。
可从市场上获得高通量筛选系统〔例如，参见Zymark公司，Hopkinton，MA；Air Technical Industries，Mentor，OH；Beckman Instruments，Inc.Fullerton，CA；Precision Systems，Inc.，Natick，MA等)。这些系统通常自动操作整个过程，包括所有的样品和试剂的吸取、液体分散、时控培育和对在适用于检测的检测器中的微滴定板进行最后的读数。这些可配置的系统提供了高通量和快速的起始，以及高度的灵活性和用户化。
这类系统的制造商为各种高通量设备提供了详细的方案。因此，例如，ZymarkCorp.提供了描述用于检测基因转录、配体结合等的调节的筛选系统的技术公报。Caliper Technologies(Mountain View，CA)已开发了试剂操作的微流体方法。
在本文所述的实施例中，还可任选地使用照相机或其它记录设备(如光电二极管和数字存储设备)观察(以及任选地记录)光学图像，例如通过使图像数字化和/或在计算机上存储和分析该图像。可使用各种市售获得的外围设备和软件使录像或光学图像数字化，并将数字化的录像或光学图像存储和分析，如使用PC(Intel×86或者与奔腾芯片相容的基于DOSTM、OSTMWINDOWSTM、WINDOWS NTTM或者WINDOWS 95TM的机器)、MACINTOSHTM或者基于UNIX(如SUNTM工作站)计算机。
一个常规的系统将光线从检测设备传送到本领域常使用的冷电荷耦合器件(CCD)照相机中。CCD照相机包括图像元素的一个阵列(像素)。样品的光线在CCD上成像。对应于该样品的各区域的具体的像素(如在生物聚合物的阵列上的单个杂交位点)被取样，以获得各位置上的光强度读数。多个像素被平行进行，以增加速度。使用将本发明的装置和方法容易观察任何样品，如采用荧光或暗视野显微镜技术。
酶结构域的目标激活的非功能性融合可采用多种方式将本发明使用的未修饰核酸序列和修饰的核酸序列互接。例如，可直接将这些序列相互连接，在它们之间没有插入任何序列(图1)。任选地，在第一条核酸序列按照阅读框与第二条核酸序列连接之前，先将其终止密码子除去。基于这样的互接序列合成的肽序列将含有直接相互连接的蛋白质序列(或其部分)(即，第一酶结构域的C末端氨基酸将与随后的酶结构域的N末端连接，依次类推)。或者，核酸序列可通过一条或多条核苷酸接头序列互接(图2)。
任选的核苷酸接头序列较佳长约3个(即编码一个氨基酸接头)到约300个(即编码大约100个氨基酸接头肽)核苷酸，但是可以更长。任选地，核苷酸接头序列含有约12-150个核苷酸，约12-120个核苷酸，或者约12-90个核苷酸。或者，核苷酸接头序列含有约3-150个核苷酸，或者约3-30个核苷酸。核苷酸接头序列可以是在翻译之前从杂交蛋白质转录物中除去的内含子序列。或者，核苷酸接头序列可编码与酶结构域一起翻译的肽，作为杂交蛋白质的一部分。由核苷酸接头序列编码的肽可以是任何所需组合物的随机氨基酸序列。所述组合物的一个例子是主要含有甘氨酸和/或丙氨酸的肽接头。另一组合物选项是具有内含肽结构的肽接头，这样肽接头可以在翻译过程中或者翻译之后使自己从杂交蛋白质序列中解脱出来。较佳的是，如果编码肽接头的核苷酸接头序列被作为杂交蛋白质的一部分而翻译，则该接头序列的长度增加3个核苷酸，这样，在核苷酸接头序列之后编码的酶结构域的翻译不会被转移到阅读框之外。
还可将接头序列加工成含有可切割的位点(如核苷酸接头序列中的限制性位点，或者，肽接头的氨基酸序列中的蛋白酶易感位点)。
将一条或多条核苷酸接头序列掺入本发明的基因融合构建物进一步提供了对该基因融合构建物和所得的杂交蛋白质产物的操作和控制。例如，可选择核苷酸接头序列，以提供杂交蛋白质的目标激活。在目标激活的杂交蛋白质的例子中，一个或多个酶结构域直到肽接头区域被修饰(如切割或去除)后才被激活。在另一例子中，核苷酸接头序列可影响或抑制基因融合构建物的转录或翻译，除非该核苷酸接头序列通过催化性RNA分子的切割而被改变。
生产修饰的基因融合构建物的方法本发明提供生产修饰的基因融合构建物的方法。这些方法包括使编码两个或更多个酶结构域的两条或更多条核酸序列互接，其中至少一条所述核酸序列与原始测定的序列相比已被修饰(图1)。这些核酸序列应以一种方式互接，这样维持了任何下游编码序列的阅读框。此外，设计应是编码转录物未被终止密码子过早地中断的翻译，通常，通过消除构建物的编码序列中的任何内部终止密码子容易获得这样的设计。
核酸序列可以是脱氧核糖核酸或核糖核酸的各种形式，如上所述。此外，核酸序列可任选地含有单条核酸序列，或者是序列的文库。可在两条或更多条序列互接之前，将其中至少一条核酸序列修饰，或者这种修饰可在将序列互接后进行。这种修饰包括但不限于该核酸序列的一部分的修饰或改组。
可任选地加工本发明的基因融合构建物，以编码分泌/定位序列(如信号序列、细胞器靶定序列、膜定位序列等等)、和/或促进纯化的序列(如表位标记物，如FLAG表位)、多组氨酸标记物、GST融合物等等。表达产物任选地包括一个或多个修饰的氨基酸，如糖基化的氨基酸、PEG基化的氨基酸、法呢基化的氨基酸、乙酰基化的氨基酸、生物素化的氨基酸、羧基化的氨基酸、磷酸化的氨基酸和酰基化的氨基酸等。
生产修饰的基因构建物的方法还可包括将所述修饰的基因融合构建物导入真核系统中的步骤。真核系统可以是任何数量的生物系统，包括哺乳动物序列(如鼠、啮齿动物、豚鼠、兔、犬、猫、灵长类动物或人系统)。或者，真核系统可以是鸟、两栖动物、爬行动物或鱼系统。较佳的是，真核系统是植物系统。在下面的“基因融合构建物的表达”部分中将进一步描述基因表达的方法。
在本发明的真核系统是植物系统的实施例中，修饰的基因构建物可含有从植物得到的核酸序列，或不是从植物获得的核酸序列(如从细菌得到)，或是从植物得到的序列和不是从植物得到的序列的一些组合。例如，本发明的一些优选实施例涉及导入含有一条或多条从非植物微生物(如细菌或古细菌)获得的核酸序列的修饰的基因构建物。此方法的一个可能的有功效的应用，涉及导入通常在植物中不存在代谢途径的植物中。下文更详细描述的一个例子是将从嗜盐细菌得到的外蛋白合成途径导入植物中，以增加所得植物的压力耐受性。
本发明的修饰的基因构建物可含有两个、三个、四个、五个或更多的酶结构域，其中一个或多个酶结构域已如本文所述被修饰。
在本发明的优选实施例中，通过改组同源亲本序列〔直向同源物(ortholog)或共生同源物(paralog)〕，可对修饰的基因构建物的核酸元素进行修饰。可从植物或非植物获得亲本序列。本发明包括从改组的植物或非植物衍生序列(如从植物或细菌获得的改组的同源序列)修饰的核酸。在本发明的一些方面，可将同源性低或者无可辨别同源性的序列改组，以获得可用于制备修饰的基因构建物的核酸。
可将编码从感兴趣的任何数量的代谢途径中获得的酶结构域的核酸序列掺入采用本发明方法生产的修饰的基因融合构建物中。此外，通过酶结构域的融合可产生新颖的代谢途径，这种产生可以逐步的方式，使用一系列相关的底物/中间物产生所需的最终产物。
在生产修饰的基因融合构建物的方法的一个实施例中，由两条或更多条核酸序列编码的酶结构域从八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素去饱和酶和/或β-环化酶衍生得到。在本发明的另一实施例中，由两条或更多条核酸序列编码的酶结构域从二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰转移酶和外蛋白合成酶衍生得到。在本发明的另一实施例中，由两条或更多条核酸序列编码的酶结构域从β-酮硫解酶、D-还原酶和聚(羟基链烷酸酯)合成酶衍生得到。在本发明的又一实施例中，所述两条或更多条核酸序列从下列酶衍生得到酮合成酶-酰基转移酶、链长度因子、酰基载体蛋白和环化酶。
生产基因融合构建物的方法本发明还提供生产基因融合构建物的方法，该方法将两条或更多条编码至少两个参与共同的代谢途径的酶结构域的核酸序列互接。在本发明的一些优选实施例中，将编码至少两个酶结构域的三条或更多条核酸序列互接，产生基因融合构建物。考虑用于本发明的特殊的代谢途径包括类胡萝卜素生物合成、外蛋白生物合成、聚羟基链烷酸酯生物合成和芳族聚酮化合物生物合成。这些途径和它们的组成型酶结构域在下文将有更详细的描述。可使用以前描述的方法中感兴趣的核酸序列，但是，在本发明此实施例中，掺入基因融合构建物中的任何核酸序列的修饰是任选的(图3)。此外，可使用类似的核苷酸接头序列和转录调节元件。生产基因融合构建物的方法还可包括将修饰的基因融合构建物掺入真核系统中，如上所述，例如植物系统。
此外，本发明提供生产基因融合构建物的方法，该方法将两条或更多条核酸序列互接，各序列编码至少一个酶结构域，其中一个或多个酶结构域从植物酶或植物系统获得。从植物系统获得的生物合成的例子包括但不限于类胡萝卜素生物合成中涉及的酶。编码植物衍生酶结构域的核酸序列可以直接互接，或者可通过核苷酸接头序列连接，并还可包含调节序列，如上所述。此外，核酸序列、核苷酸接头序列，或者两者都可如先前所述，任选地被修饰，从而形成修饰的基因融合构建物。该方法还任选地包括将基因融合构建物(或修饰的基因融合构建物)导入生物体中，如原核系统或真核系统。在“基因融合构建物的表达”部分描述了原核系统和真核系统的例子。
本发明还通提供含有两条或更多条核酸序列的基因融合构建物的生产，以及将构建物导入植物中，其中各序列编码至少一个酶结构域，至少一个酶结构域从非植物物种得到。这可用于将异源的代谢途径导入植物中，如通常在微生物中发现的途径。或者，本发明这方面可用于引入与其对应的内源途径不同的方式起作用的途径，如通过将从嗜热生物获得的酶活性插入植物中，这有可能产生可在高温下激活的代谢途径。在一些例子中，需要对非植物核酸序列进行修饰，这样由此编码的酶结构域能更好地适应于植物环境。非限制性的例子是修饰细菌的酶活性的pH依赖性，以在植物系统中获得更佳的活性。
表达多种酶活性的方法本发明还提供在生物系统(如真核或原核系统)中表达多种酶活性的方法。这些方法包括提供编码具有至少三个酶结构域的单一多肽的基因融合构建物，然后将该基因融合构建物导入生物系统中。该基因融合构建物含有互接的核酸序列，具有至少三条编码至少至少三个酶结构域的核酸序列。或者，该基因融合构建物含有两条或更多条编码植物衍生的酶结构域的核酸序列。
可将编码从感兴趣的任何数量的代谢途径获得的酶结构域的核酸序列掺入采用本发明方法生产的基因融合构建物中。此外，通过酶结构域的融合，可产生新颖的代谢途径，这种产生可以逐步的方式，使用一系列相关的底物/中间物产生所需的最终产物。酶结构域可从各种来源获得，以及从生物化学或代谢途径获得。任选地，这些核酸序列编码参与相同代谢途径的蛋白质。在本发明的一个实施例中，由两条或更多条核酸序列编码的酶结构域从八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素去饱和酶和/或β-环化酶衍生得到。在本发明的另一实施例中，由三条或更多条核酸序列编码的酶结构域从二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰转移酶和外蛋白合成酶衍生得到。在本发明的另一实施例中，由三条或更多条核酸序列编码的酶结构域从β-酮硫解酶、D-还原酶和聚(羟基链烷酸酯)合成酶衍生得到。在本发明的又一实施例中，所述三条或更多条核酸序列从下列酶衍生得到酮合成酶-酰基转移酶、链长度因子、酰基载体蛋白和环化酶。
如上所述，用于本发明方法的核酸序列可以是脱氧核糖核酸的各种形式(例如，基因组DNA、cDNA、有义链序列、反义链序列、重组DNA、改组DNA、修饰DNA或者DNA类似物)。或者，这些核酸序列可以是核糖核酸(包括但不限于基因组RNA、信使RNA、催化RNA、有义链序列、反义链序列、重组RNA、改组RNA、修饰RNA或RNA类似物)。可直接将编码酶结构域的核酸序列连接在一起，或者在这些核酸序列之间可以通过一个或多个长约3-300个核苷酸的核苷酸接头序列将它们连接。如果在翻译之前该核苷酸接头序列没有从核酸转录物中删掉，则较佳的是含有接头的核苷酸的数量是3的倍数，或者3个3个地增加，这样在接头区域转录之后酶结构域的翻译不被转移到阅读框之外。任选地，可使一条或多条核酸序列、和/或一条或多条接头序列突变，或者改组(在将序列互接之前或之后)。
本发明的方法还可包括使所述基因融合构建物在生物系统中表达，如下文所述。此外，本发明提供基因融合构建物和转基因系统，如转基因植物，如采用本发明方法制得的。
基因融合构建物的表达本发明方法的实施涉及上述基因融合构建物的构建，并且在一些方面，还涉及重组的核酸在转染的宿主细胞中的表达。
宿主细胞可包括真核系统，例如真核细胞、植物细胞、动物细胞、原生质体或者组织培养物。宿主细胞任选地含有多种细胞，例如生物体。或者，宿主细胞可包括原核系统，包括但不限于细菌〔即革兰氏阳性菌、紫色细菌、绿硫菌、绿色非硫菌、蓝细菌、螺旋体、栖热袍菌(thermatogale)、黄杆菌和类菌体〕和古细菌〔即Korarchaeota、热变形杆菌(Thermoproteus)、热网属菌(Pyrodictium)、热球菌属(Thermococcales)、产甲烷菌、古生球菌属(Archaeoglobus)和极端嗜盐菌〕。较佳的是，原核生物含有一种或多种感兴趣的农业的、环境的、工业的、药学的或临床的细菌种类，包括但不限于大肠杆菌、各种链霉菌种类和各种芽胞杆菌种类。
可通过例如电穿孔、微注射、微粒轰击、聚乙二醇介导的转化或者农杆菌属介导的转化等技术将基因融合构建物导入所需的系统中。可在将基因融合构建物导入所需系统之前，任选地对基因融合构建物(或者修饰的基因融合构建物)进行筛选。在使用融合构建物文库的实施例中，可在将构建物文库导入所需系统之前，任先地对这些构建物进行筛选。
在本发明方法的某些实施例中，将上述基因融合构建物和/或修饰的基因融合构建物导入植物系统中，从而获得转基因植物。通常可以获得使用核酸转导植物细胞的方法。除了Berger、Ausubel和Sambrook之外，用于植物细胞克隆、培养和再生的一般参考文献包括Payne等(1992)，《液态系统中的植物细胞和组织培养》(John Wiley&Sons，Inc.，纽约，NY)和Gamborg和Philips编辑(1995)，《植物细胞、组织和器官培养基本方法》(Springer Lab Mannal，Springer-Cerlag，Berlin)。在以下文献中描述了细胞培养基Atlas和Parks编辑(1993)，《微生物培养基手册》(CRC出版社，Boca Raton，FL)。其它的信息可从商业的文献中获得，如《生命科学研究用细胞培养基》，Sigma-Aldrich，Inc.(St.Louis，MO，“Sigma-LSRCCC”目录，以及如《植物培养目录》及增刊(1997)，Sigma-Aldrich(“Sigma-PCCS”)。
可采用各种常规的技术将本发明的基因融合构建物和修饰的基因融合构建物导入所需的植物宿主的基因组中。用于转化各种高等植物物种的技术是周知的，并在技术和科学文献中有描述。例如，可参见Payne，Gamborg，Altas，Sigma-LSRCCC和Sigma-PCCS，同上；以及如Weising等(1988)，Ann.Rev.Gent.，22421-477。
例如，可采用如植物细胞原生质体的电穿孔和微注射技术将核酸直接导入植物细胞的基因组DNA中，或者可使用弹道法(如DNA微粒轰击)将基因融合构建物导入植物组织中。或者，可使基因融合构建物与合适的T-DNA侧接区域组合，然后一起导入常规的根癌农杆菌宿主载体中。当细胞被细菌感染时，农杆菌宿主的毒力功能将指导该构建物和邻近的标记物插入植物细胞DNA中。
微注射技术在本领域中是已知的，并且在科学和专利文献中有很好的描述。Paszkowski等(1984)EMBO J.，32717-2722中描述了使用聚乙二醇沉淀导入DNA构建物的方法。Fromm等(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，825824中描述了电穿孔技术。Klein等(1987)，Nature和Week等(1993)，Plant Physiol.，1021077-1084描述了弹道转化技术。
在一个实施例中，采用农杆菌介导的转化技术将改组的编码序列转移到转基因植物中。农杆菌介导的转化主要用于双子叶植物，但是，某些单子叶植物也可与农杆菌转化。例如，以下文献描述了稻米的农杆菌转化Hiei等(1994)，Plant J.，6271-282；美国专利5187073；美国专利5591616；Li等(1991)，Science in China，3454；和Raineri等，(1990)，Bio/Technology，833。此外，Xu等(1990)，ChineseJ.Bot.，281描述了由农杆菌感染转化玉米、大麦、黑小麦和芦笋。
在此技术中，有利地将根癌农杆菌的肿瘤诱导(Ti)的质粒整合到植物细胞基因组中的能力用于将感兴趣的核酸共转染到本发明的重组植物细胞中。一般产生一种表达载体，其中感兴趣的基因融合构建物(或修饰的基因融合构建物)与自主复制的质粒连接，该质粒还含有T-DNA序列。T-DNA序列通常侧接该基因融合构建物，并含有该质粒的整合序列。除了该基因融合构建物外，T-DNA通常还含有标记物序列，如抗生素耐受基因。然后具有T-DNA的质粒和基因融合构建物转染到根癌农杆菌中。为了有效转化植物细胞，该根癌农杆菌在天然的Ti质粒上含有必需的vir区域。
在另一转化技术中，T-DNA序列以及vir序列都在相同的质粒上。关于根癌农杆菌的讨论，可参见如Firoozabady & Kuehnle在《1995 Springer关于植物细胞、组织和组织培养实验室手册》(上面所引用的)中所述。
从各种植物类型建立可转化的原生质体以及随后的培养的原生质体的转化的各种方案可在本领域中获得，本文将它们纳入作为参考。例如，可参见Hashimoto等(1990)，Plant Physiol.，93857；Fowke和Constabel(编辑)(1994)，Plant Protoplasts；Saunders等(1993)，Applications of Plant In Vitro Technology Symposium，UPM 16-18；和Lyznik等(1991)，BioTechniques，10295；本文将这些文献纳入作为参考。
在本发明的一个实施例中，使用从所需植物的组织(如叶子)获得的分离块可实现植物宿主的转化。将这些分离块培育在根癌农杆菌的约0.8×109-1.0×109个细胞/mL溶液中一段适当的时间(通常为几秒)。然后使这些分离块在合适的培养基上培育大约2-3天。
可将采用上述任一种转化技术得到的转化的植物细胞培育，以产生具有转化的基因型从而具有所需的表型的全植物。通过在组织培养生长培养基中操纵某种植物激素，可实施这种再生技术，通常要依赖于已与所需的核苷酸序列一起导入的杀生物剂和/或除草剂标记物。以下文献描述了由培养的原生质体进行的植物再生Evans等91983)，《原生质体分离和培养，植物细胞培养手册》，第124-176页(Macmillian出版公司，纽约)；和Binding(1985)，《植物、植物原生质体的再生》，第21-73页(CRC出版社，Boca Raton，FL)。还可从植物愈伤组织、分离块、器官或其部分中获得再生，和/或使用它们进行再生。这些再生技术在以下文献中有一般的描述Klee等(1987)，Ann.Rev.of Plant Phys.，38467-486。还可参见Payne、Gamborg、Altas、Sigma-LSRCCC和Sigma-PCCS，同上。
在使用农杆菌转化后，将分离块转移到选择培养基中。熟练的技术人员将认识到，选择培养基的选择依赖于可选择的标记物被共转染到该分离块中。经过适当长的时间后，转化子将开始形成根。在根长约1-2厘米后，将其转移到合适的根和枝条培养基中。一旦转移到根和枝条培养基中，应该维持选择压力。
在1周到约2周中，转化子长出根，形成小植株。在小植株高约3-5厘米后，可将它们放在纤维罐(fiber pot)中的无菌土壤中。本领域熟练的技术人员将认识到，应使用不同的气候环境获得不同的的转化植物。在优选的实施例中，转化植物的切片以及体细胞胚长出根和枝条后，将它们转移到用于建立小植株的培养基中。关于转化植物的选择和再生的描述，可参见Dodds & Roberts(1995)，《植物组织培养实验》，第3版(剑桥大学出版社，剑桥，英国)。
叶绿体是许多活性的作用位点，在一些例子中，可将基因融合构建物融合到叶绿体转运序列肽中，以促进基因产物移位到叶绿体中。在这些例子中，可有利地将基因融合构建物转化到植物宿主细胞的叶绿体中。在本领域中有许多方法可实现叶绿体转化和表达〔例如可参见Daniell等(1998)，《自然生物技术》，16346；O′Neill等(1993)，《植物杂志》，3729；Maliga(1993)，TIBTECH，111)。表达构建物通常含有在植物中起作用的操作性连接于基因融合构建物的转录调节序列。设计用于在叶绿体中起作用的表达盒包含确保在叶绿体中表达所需的序列。通常，编码序列侧接与叶绿体基因组同源的两个区域，以影响与叶绿体基因组的同源重组；可选择的标记物基因还常常出现在侧接的质粒DNA序列中，以促进遗传稳定的转化叶绿体在所产生的转原生质体(transplastonic)植物细胞中的选择〔例如，可参见Maliga(1993)和Daniell(1998)，以及本文列出的参考文献〕。
可以基因型或表型表征本发明的转基因植物，以测定改组的基因的存在。基因型分析是测定具体的遗传物质的存在与否。表型分析是测定表型特性的存在与否。表型特性是植物的物理特征，由植物的遗传物质与环境因素所决定。如前述关于优化的改组核酸的鉴别部分所述，可检测到基因融合构建物(或修饰的基因融合构建物)的存在，如采用PCR扩增转基因植物的基因组DNA，和该基因组DNA与特殊标记的探针杂交。也可以暴露于选择过程中的植物的生存来监测该基因融合构建物掺入该植物中，其中在该选择过程中由该基因融合构建物编码的产物有助于应付选择的应力。
任何植物基本上都可使用本发明的基因融合构建物来转化。用于本发明新颖的核酸的转化和表达的合适植物包括农艺上和园艺上重要的物种。这些物种包括但不限于禾本科(包括玉米、黑麦、黑小麦、大麦、粟、稻、小麦、燕麦等)；豆科(包括豌豆、菜豆、扁豆、花生、薯蓣豆、豇豆、绒毛黧豆、大豆、苜蓿、紫苜蓿、羽扇豆、野豌豆、荷花、草木樨、紫藤和香豌豆)；菊科(维管植物的最大家族，包括至少1000种属，包括重要的经济作物，如向日葵)和蔷薇科(包括悬钩子、杏树、杏仁、桃树、玫瑰等)。以及坚果树(包括胡桃、山核桃、榛子等)，和林木〔包括松属(Pinus)、栎属(Quercus)、黄杉属(Pseudotsuga)、红杉属(Sequoia)、杨属(Populus)等〕。
此外，由本发明的核酸修饰的优选靶标以及上述物种包括下述种属剪股颖属(Agrostis)、葱属(Allium)、金鱼草属(Antirrhinum)、旱芹属(Apium)、鼠耳芥属(Arabidopsis)、花生属(Arachis)、芦笋属(Asparagus)、颠茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)(如燕麦)、山白竹属(Bambusa)、芸苔属(Brassica)、雀麦属(Bromus)、博洛瓦阿拉属(Browaalia)、山茶属(Camellia)、大麻属(Cannabis)、辣椒属(Capsicum)、鹰嘴豆属(Cicer)、藜属(Chenopodium)、菊苣属(Chichorium)、柑桔属(Citrus)、咖啡属(Coffea)、薏苡属(Coix)、香瓜属(Cucumis)、葫芦属(Curcubita)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、曼陀罗属(Datura)、胡萝卜属(Daucus)、毛地黄属(Digitalis)、薯蓣属(Dioscorea)、油棕属(Elaeis)、Eleusine、羊矛属(Festuca)、草莓属(Fragaria)、老鹳草属(Geranium)、大豆属(Glycine)、向日葵属(Helianthus)、龙骨角属(Heterocallis)、三叶胶属(Hevea)、大麦属(Hordeum)(如大麦)、天仙子属(Hyoscyamus)、番薯薯(Ipomoea)、莴苣属(Lactuca)、兵豆属(Lens)、百合属(Lilium)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、百脉根属(Lotus)、番茄属(Lycopersicon)、甘牛至属(Majorana)、苹果属(Malus)、芒果属(Mangifera)、木薯属(Manihot)、苜蓿属(Medicago)、龙面花属(Nemesia)、烟草属(Nicotiana)、驴食豆属(Onobrychis)、稻属(Oryza)(如稻)、稷属(Panicum)、天竺葵属(Pelargonium)、狼尾草属(Pennisetum)(如粟)、碧冬茄属(Petunia)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、李属(Prunus)、毛茛属(Ranunculus)、萝卜属(Raphanus)、茶庶子属(Ribes)、蓖麻属(Ricinus)、悬钩子属(Rubus)、甘蔗属(Saccharum)、蛾蝶花属(Salpiglossis)、黑麦属(Secale)(如黑麦)、千里光属(Senecio)、狗尾草属(Setaria)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、蜀黍属(Sorghum)、钝叶草属(Stenotaphrum)、可可树属(Theobroma)、车轴草属(Trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、小麦属(Triticum)(如小麦)、野豌豆属(Vicia)、豇豆属(Vigna)、葡萄属(Vitis)、玉蜀黍属(Zea)(如玉米)、Olyreae、Pharoideae以及其它。应注意的是，禾本科(Graminae)的植物是用于本发明方法的特别优选的靶标植物。
作为本发明的目标的通常的农作物包括玉米、稻米、黑小麦、黑麦、棉花、大豆、高粱、小麦、燕麦、大麦、粟、向日葵、加拿大油菜、豌豆、菜豆、小扁豆、花生、薯蓣豆、豇豆、绒毛黧豆、大豆、苜蓿、紫苜蓿、羽扇豆、野豌豆、荷花、草木樨、紫藤和香豌豆、番茄、香蕉和坚果植物(如胡桃、山核桃等)。
除了植物以外，其它真核生物如真菌、鞭毛虫和纤毛虫、微孢子虫，甚至是动物(即各种鱼类、鸟类、爬行动物和哺乳动物)也可使用本发明的基因融合构建物和/或修饰的基因融合构建物转化。除了全文所提出的参考文献以外，熟练的技术人员还可从Freshney(1994)，《动物细胞的培养，基本技术手册》(第3版)(Wiley-Liss，纽约)和本文所引用的其它参考文献中获得关于动物细胞培养的内容。还可参见Kucher等(1977)，《细胞培养和病毒学中的生物化学方法》(Dowden，Hutchinson和Ross，Inc.，纽约)和Inaba等(1992)，J.Exp.Med.，1761693-1702。关于细胞培养的其它信息可在Ausubel、Sambrook和Berger(同上)中获得。在Atlas和Parks(同上)中还描述了细胞培养的培养基。总的来说，熟练的技术人员使用可获得的技术完全能够从动物、植物、真菌、细菌和其它细胞中转导细胞。此外，熟练的技术人员可以采用可获得的技术，使用遗传构建物转导全生物体。
或者，可使用本发明的基因融合构建物和/或修饰的基因融合构建物转化原核系统。任选地，使用含有至少一条植物衍生的核酸序列的构建物转化原核系统。可用于本发明方法中的系统的例子包括但不限于细菌系统〔如醋杆菌属(Acetobacter)、醋单胞菌属(Acetomonas)、放线菌属(Actinomyces)、农杆菌属(Agrobacterium)、芽胞杆菌属(Bacillus)、细菌属(Bacterium)、拟杆菌属(bacteroides)、博戈里亚氏菌属(Bogoriella)、博德特氏菌属(Bordetalla)、疏螺旋体属(Borrelia)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭菌属(Clostridium)、冷杆菌属(Cryobacterium)、双球菌属(Diplococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)，欧文氏菌属(Erwinia)、赤细菌属(Erythrobacter)、大肠杆菌属(Escherichia)、真杆菌属(Eubacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、嗜血菌属(Haemophilus)、盐杆菌属(Halobacillus)、盐拟杆菌属(Halobacteroides)、螺杆菌属(Helicobacter)、螺旋菌属(Helibacillus)、螺旋杆菌属(Heliobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳杆菌属(Lactobacillus)、军团菌属(Legionella)、无色杆菌属(Leucobacter)、李斯特菌属(Listeria)、利斯顿氏菌属(Listonella)、甲烷单胞菌属(Methanomonas)、微球菌属(Micrococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、枝动菌属(Mycoplana)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、消化球菌属(Peptococcus)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤杆菌属(Rhizobacter)、根单胞菌属(Rhizomonas)、红细菌属(Rhodobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、螺旋体属(Spirochaeta)、螺状菌属(Spirosoma)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链杆菌属(Streptobacillus)、链细菌属(Streptobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、弧菌属(Vibrio)等等〕和古细菌系统(如，Korarchaeota、热变形杆菌、热网菌属、热球菌属、甲烷细菌、古生球菌属、产甲烷菌和极端嗜盐菌)。较佳的是，原核生物体含有农业、环境、工业、药学或临床上感兴趣的一种或多种细菌种类，包括但不限于大肠杆菌、各种链霉菌属物种和各种芽胞杆菌属物种。
代谢途径和系统类胡萝卜素生物合成有利于在真核系统中表达的一个代谢系统的例子是类胡萝卜素的代谢(图4)。类胡萝卜素通常是基于带色的类异戊二烯的分子，它由各种植物、霉菌、酵母和少数细菌合成。在人中，β-胡萝卜素是维生素A合成中的前体；β-胡萝卜素或维生素A的营养性不足可能导致易患上夜盲症、干眼症和角膜软化症(角蛋白过量形成)。除了前维生素A外，各种类胡萝卜素，如番茄红素、β-胡萝卜素以及其它的类胡萝卜素，都是有效的抗氧化剂。此外，有证据表明，类胡萝卜素在预防心血管疾病和癌症中起重要的作用〔例如可参见Singh/ & Lippman(1998)，《癌症化学预防》(Cancer Chemoprevention)，第1部分类维生素A和类胡萝卜素以及其它种类的抗氧化剂，Oncolgy NY，121643-1653〕。类胡萝卜素的其它工业应用包括作为食物着色剂，以及用在动物饲料中。在植物、藻类、真菌和细菌中，胡萝卜素更常在光合作用中起作用。
类胡萝卜素的生物合成是个多步骤过程，涉及一系列的代谢酶。细胞中的起始材料是香叶基香叶基二磷酸(GGPP)，这是一种有20个碳的类异戊二烯分子。两个GGPP分子在八氢番茄红素合成酶的催化下发生缩合反应，形成40个碳的中间物八氢番茄红素。在产生类胡萝卜素的微生物中，通过细菌八氢番茄红素去饱和酶(也称为八氢番茄红素脱氢酶)的作用，在八氢番茄红素分子的C7、C7′、C11和C11′位置上对称引入4个双键，产生了该生物合成途径中的后一个中间物，即番茄红素。但是，在高等植物中，使用两种分离的酶形成番茄红素，一种是植物八氢番茄红素去饱和酶，另一种是z-胡萝卜素去饱和酶。最后，β-环化酶(也称为番茄红素环化酶)封闭了番茄红素分子的各端上的环形成β-胡萝卜素。也可在该生物合成途径中掺入不同的环化酶，形成不同的环化模式。通过存在于各种生物体中的下游修饰酶，可对该类胡萝卜素结构作进一步的衍生。
编码成单一的核酸转录物的β-胡萝卜素生物合成酶(包括八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素去饱和酶、z-胡萝卜素去饱和酶和番茄红素环化酶)的基因融合构建物和修饰的基因融合构建物可用于真核系统(如植物系统)的转化。已存在类胡萝卜素代谢途径的植物系统中β-胡萝卜素的生产将得到增强。此外，通常不合成β-胡萝卜素的植物系统如稻米、谷类通过表达这种代谢途径而可富含这类营养物。用于这些和其它类胡萝卜素生物合成酶的核酸序列可从GenBank获得，如登记号为M84744(番茄，Lycopersicon esculentum)、AF220218(温州蜜柑，Citrusunshiu)、Z37543(甜瓜，Cucumis melo)、X78814(黄水仙，Narcissus pseudonarcissus)、X68017(辣椒，Capsicum annuum)、AB032797(杜库斯属，Docus carota)、U32636(玉蜀黍，Zea mays)；和其它用于植物八氢红素合成酶的相关序列登记号AF195507(番茄，Lycopersicon esculentum)、AJ224683(黄水仙，Narcissus pseudonarcissus)、X89897(辣椒，Capsicum annuum)、AF047490(玉蜀黍，Zea mays)；以及其它用于植物z-胡萝卜素去饱和酶的相关序列登记号为M88683(番茄，Lycopersiconesculentum)、X78815(黄水仙，Narcissus pseudonarcissus)、X68058(辣椒，Capsicumannuum)、U37285(玉蜀黍，Zea mays)；以及其它用于植物八氢番茄红素去饱和酶的相关序列登记号为X86452(番茄，Lycopersicon esculentum)、X86221(辣椒，Capsicum annuum)、U50739(鼠耳芥，Arabidopsis thaliana)、AF152246(葡萄柚，Citrusx paradisi)和X81787(烟草，Nicotiana tabacum)；以及用于植物番茄红素环化酶的其它相关序列(参见WO99/07867和本文所引用的参考文献)。
此外，可从GenBank中获得从产生类胡萝卜素的微生物中获得的类胡萝卜素生物合成酶群的核酸序列，例如登记号M87280(草生欧文氏菌，Erwinia herbicolaEho10)、D90087(噬夏孢欧文氏菌，Erwinia uredovora)、U62808(黄杆菌，Flavobacterium)、D58420(橙黄琼脂杆菌，Agrobacterium aurantiacum)和M90698(草生欧文氏菌，Erwinia herbicola Eho10)(以及相关序列)。
由于大多数的类胡萝卜素是有色的，所以，通过其特征光谱和其它分析方法，可肉眼观察和测定所需的类胡萝卜素产物。
可采用的其它分析技术包括但不限于质谱、薄层层析(TLC)、高压液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳(CE)和NMR光谱法。外蛋白生物合成有利于在真核系统(尤其是植物系统)中进行生产的其它代谢系统是外蛋白(1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸)的生物合成。外蛋白是一种无毒的环状氨基酸，它的存在有渗透保护性(osmoprotective)特征，如赋予体外细胞增加的盐耐受性。此外，外蛋白似乎保护各种蛋白质和酶的体外活性在应力条件下免受损失。因此，具有外蛋白生物合成装置的植物系统的转化，将提高植物对应力环境(如高盐、高或低温度、干蝻等等)的耐受力。提高对这些不理想条件的耐受力，将增加农作物的产量。此外，外蛋白可用作蛋白质/酶稳定剂，或者所谓的化学陪伴蛋白。酶与这种陪伴蛋白分子的联合将有助于使该酶在反复冷冻/解冻循环、热处理和/或干燥后维持其活性。因而，外蛋白还具有作为稳定剂的潜力，在药物、化妆品和营养组合物中使用。
外蛋白的生物合成涉及3种酶二氨基丁酸氨基转移酶(也称为转氨酶)、二氨基丁酸乙酰转移酶和外蛋白合成酶(图5)。在合成途径的第一个反应中，氨基转移酶将天冬氨酸-半醛和L-谷氨酰胺转化成二氨基丁酸。接着，乙酰转移酶催化二氨基丁酸的乙酰化，形成N-乙酰基二氨基丁酸。在最后的反应中，通过外蛋白合成酶的作用，N-乙酰基二氨基丁酸被环化，产生外蛋白。
已从嗜盐菌属中分离得到外蛋白生物合成途径中的三个基因(分别为ectA、ectB和ectC)。这些酶的序列也可从GenBank中获得，如登记号U66614(嗜盐海球菌，Marinococcus halophilus)和AJ011103(伸长盐单胞菌，Halomonas elongata)。这些酶的优选pH范围为8.2-9.0，表明在真核系统(如植物系统)中表达之前，对肽的主要序列进行一些修饰是需要的。这可通过如在编码这些酶结构域的核酸序列上进行循环重组，然后如上述将修饰的序列掺入修饰的基因融合构建物中而实现。
选择编码外蛋白生物合成的酶的基因融合构建物和/或修饰的基因融合构建物，可通过如选择对环境应力(如高盐浓度)具有耐受性提高的转化宿主而实现。例如，野生型大肠杆菌可在NaCl浓度达3％(0.52M)的环境中生长，而用编码外蛋白生物合成途径的基因(导致体内合成外蛋白)转化大肠杆菌，在较高的NaCl浓度(如5％NaCl，0.86M)的环境下仍能生长。通过用从基因融合或改组获得的文库DNA转化生长的大肠杆菌，我们将能选择出原始功能性克隆。
作为选择方法的另一例子，酵母可用于选择具有所需特性的基因融合构建物和/或修饰的基因融合构建物。酵母可在宽的pH范围(pH低到～3)和盐浓度(高达～1M)中存活，但具有剔除了gpd(甘油磷酸脱氢酶)的酵母则是盐敏感的。外蛋白生物合成途径在剔除了gpd的酵母中的表达，以及外蛋白的合成使该酵母恢复(或者部分恢复)了盐抗性。但是，如果生长培养基的pH对于野生型酶不是最佳的话，携带低表达水平的野生型外蛋白生物合成途径酶的gpd缺失株仍不能在高盐环境中生长。外蛋白生物合成途径仅在改变的最适pH条件下才能产生必需量的外蛋白产物，从而恢复盐敏感株的生长。因此，可将盐敏感的酵母株用作初次选择具有改变的最适pH的克隆的宿主。聚羟基链烷酸酯生物合成可掺入本发明的基因融合构建物和修饰的基因融合构建物中的又一代谢途径，是产生聚羟基链烷酸酯(PHA)的生物合成途径。PHA(如聚-3-羟基丁酸)是生物可降解的聚合物，它是由诸如单胞菌属(Aeromonas)、产碱菌属(Alcaligenes)、芽胞杆菌属、伯克霍尔德德氏菌属、着色菌属(Chromatium)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、诺卡氏菌属(Nocardia)、假单胞菌属、罗尔斯通菌属(Ralstonia)和红螺菌属(Rhodospirillum)之类的微生物生产的，作为碳和能量的储藏。这些可由各种单体单元形成的生物聚合物，具有多种工业和医学用途，包括生产热塑性塑料和药物传递基质。这些聚合物的物理和化学性质部分是由其侧链的长度决定的；侧链较短的聚合物往往是半晶体状态，具有相当好的热塑性，而侧链较长的聚合物则是更好的弹性材料。
短侧链PHA的生物合成涉及3种酶和作为起始材料的乙酰辅酶A(图6)。第一种酶是酮硫解酶，它将两个构件分子(如乙酰辅酶A)分子缩合，形成中间物底物(如乙酰基乙酰辅酶A)。接着，通过NADH-或NADPH依赖性机制，由还原酶将该中间物底物还原成羟基链烷酸酯-辅酶A分子。最后，由PHA合成酶将该羟基链烷酸酯-CoA聚合，形成PHA聚合物。这些PHA，其分子量为103-108道尔顿，在细胞内通常以颗粒的形式，或者从“包涵体”的形式储存。通过以不同长度的构件分子和/或组合物开始，可产生其它类型的聚合物。所得的聚合物的物理特性部分受到掺入最终产物内的侧链长度的影响。
这些酶的序列可从GenBank中获得，包括但不限于登记号AF153086(伯克霍尔德氏菌属，Burkholderia sp DSMZ 9242)、U47026(广泛产碱菌，Alcaligenes latus)、AF109909(巨大芽胞杆菌，Bacillus megaterium)、AB009273(食酸丛毛单胞菌，Comamonas acidovorans)和相关的序列。
因为PHA通常积聚成颗粒，所以使用特殊的化学品进行免疫荧光，可肉眼观察到基于细胞的系统中PHA的生产。也可采用其它分析方法来测定聚合物组合物，如NMR光谱(包括LC/NMR)、质谱〔包括电子电离、快速原子/离子轰击、基质辅助的激光解吸/离子化(MALDI)、电喷射电离、串联MS、GC/MS等等〕、高压液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)。芳族聚酮化合物的生物合成可由本发明的基因融合构建物或修饰的基因融合构建物编码的另一代谢途径包括最小的芳族聚酮化合物合成酶，该途径是个多酶系统，它合成了大量产物的前体，包括抗生素、杀真菌剂、抗肿瘤剂、心血管剂和雌激素受体拮抗剂。芳族聚酮化合物的例子包括但不限于蒽醌、阿霉素、烯二亚基(enediyene)、大环内酯聚酮化合物〔如红霉素和利福平、蒽环类抗生素、诺拉霉素、阿克醌霉素(aklavinone)和其它阿克拉霉素〕、光神霉素和其它基于金霉酸的抗生素。
最小的聚酮化合物合成酶系统包括酮合成酶-乙酰转移酶、链长度因子和酰基载体蛋白。这个系统的辅助成分包括各种酮还原酶、芳香酶和环化酶〔例如可参见Carreras等(1997)，Topics in Current Chemistry，18885-126和本文所引用的参考文献)。可从各种来源中分离得到聚酮化合物合成装置，包括细菌、真菌和植物。在参与性酶的数量和酶结构域的排列根据来源而不同时，可如下描述在这些聚合物的合成中涉及的化学反应。可从GenBank获得示范性聚酮化合物合成酶的序列，包括但不限于登记号X63449(天蓝色链霉菌，Streptomyces coelicolor)、X77865(灰色链球菌，Streptomyces griseus)、AF126429(委内瑞拉链霉菌，Streptomyces venezuelae)、AF098965(沙场链霉菌，Streptomyces arenae)和相关的序列。
聚酮化合物代谢途径(图7)从短链羧酸“起始单元”(如乙酸盐或丙酸盐)开始。起始单元的辅酶A-硫酯通过酮合成酶-酰基转移酶的作用，与二羧酸“延伸基团”(extender group)(如丙二酸盐或甲基丙二酸盐)的辅酶A-硫酯缩合。初生的聚酮化合物链由酮合成酶-乙酰转移酶维持，同时，在各轮缩合/链延伸时，酰基载体蛋白进一步提供连接了辅酶A的延伸基团，用于加到生长的聚酮化合物链上。链长度因子支配聚酮化合物所延长的长度。链长度(酮还原的程度，如果有的话)以及最终产物的环化的区域特异性可通过该生物合成中涉及的代谢酶来确定。
不依赖基于酶的催化作用，可对生长的聚酮化合物链作出进一步修饰。由最小的芳族聚酮化合物合成酶产生的线性聚酮化合物前体可在无特殊的环化酶存在的情况下自动环化，形成不同类型的芳族聚酮化合物〔例如，可参见Yuemao Shen等(1999)，《最小的whiE聚酮化合物合成酶的异位表达产生不同大小和形状的芳族聚酮化合物的库》，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，963622-3627〕。
编码各种酮合成酶-酰基转移酶和链长度因子的核酸序列在许多不同物种中存在序列相似性。这些序列的改组将获得用于本发明的修饰的基因融合构建物的修饰的核酸序列。具体而言。将链长度因子改组，可用于产生能合成新颖的聚酮化合物(如具有不同链长度的线性芳族聚酮化合物前体)的酶。作为变异的其它来源，这些酶结构域与可用于产生上述核苷酸序列修饰物的脂肪酸合成酶具有序列相似性。
可采用常规的分析方法和技术，检测由编码聚酮化合物生物合成装置的基因融合构建物和/或修饰的基因融合构建物的表达而产生的代谢物和/或产物，这些方法和技术如质谱、NMR光谱等等。或者，可根据针对感兴趣的靶标的生物活性筛选代谢物或者合成这些代谢物的宿主细胞。例如，可针对靶标(如致病微生物、疾病相关细胞类型或全动物)具有抗生素或其它杀生物剂相关活性的芳族聚酮化合物。
本发明方法和组合物的用途在不偏离本发明的精神或范围的情况下，可对上述方法和材料作出改动，本发明具有许多不同的用途，包括本文所述的任何方法在生产本文所述的任何组合物或转基因生物中的用途。
方法或整合的系统在生产转基因生物(如转基因原核生物、转基因真核生物、转基因植物等)中的用途。
方法或整合的系统在生产基因融合构建物或修饰的基因融合构建物中的用途。
方法或整合的系统在表达原核系统或真核系统中多种酶活性中的应用。
根据本文所述方法以及本领域已知的技术，用一种或多种本发明的基因融合构建物或修饰的基因融合构建物转化的转基因生物的用途。
在另一方面，本发明通过实施本文所述方法和组合物、利用任何一种或多种上文所述的选择策略、材料、组分、方法或底物的试剂盒。本发明的试剂盒任选地含有以下一种或多种物种(1)本文所述的基因融合构建物或修饰的基因融合构建物；(2)实施本文所述的方法的说明，和/或操作本文所述的选择方法的说明；(3)一种或多种检测成分，包括但不限于一种或多种缓冲液、酶、辅因子、底物、抑制剂、催化剂等；(4)用于存放核酸、植物、细胞等的容器；以及任选地(5)包装材料。
另一方面，本发明提供用于本文所述的试剂盒的任一组分的用途、本文所述的任一种方法或检测的实施，和/或任何装置或试剂盒在实施本文所述的任何检测或方法中的用途。
实施例提出下述实施例进行阐述，但不应认为它们限制了本发明。实施例1编码三个酶结构域的基因融合构建物——外蛋白合成酶的制备和功能评估野生型外蛋白合成酶操纵子的克隆从ATCC获得含有感兴趣的外蛋白合成酶操纵子的嗜盐海球菌(ATCC27964)。已表征了包含ect A(二氨基丁酸乙酰转移酶)、ect B(二氨基丁酸氨基转移酶)和ect C(外蛋白合成酶)基因的该操纵子，并可从GenBank中获得(登记号U66614)。使用Herculase酶增强的DNA聚合酶(Stratagene(图8)和以下引物对，从基因组DNA中扩增得到3.26kb的操纵子，该操纵子从ect A起始密码子的0.7kb上游延伸到ect C终止密码子的0.15kb下游ectP-5′(5′-TAAGAATTCGGGTAGTACACGCAAGGAT GGG-3′)(SEQ ID NO1，划线的为EcoR I位点)和ect-3′(5′-CGTTTCCATGGTCTTA CCACCTTTTAAAAGTAATAG-3′)(SEQ ID NO2，划线的为Nco I位点)，这对引物对用于PCR出0.7kb的片段，将 EcoR I和Nco I位点引入；ect-5′(5′-AGGTGGTAAGACCATGGAAACGAAAATGACTGGAACG-3′)(SEQ ID NO3，划线部分为Nco I位点)和In-3′(5′-AGGAGAAACTCGAGACTTCGCGCTTTACTTCTTCCGG-3′)(SEQID NO4，划线部分为Xho I位点)，这对引物对用于PCR出2.56kb的片段，将NcoI和Xho I位点引入。
用EcoR I和Sal I(与Xho I相匹配的末端)限制酶消化大肠杆菌载体pBR322，得到用于上述获得的EcoR I/Nco I(0.7kb)和Nco I/Xho I(2.56kb)片段的克隆载体。在将三个片段连接后，将所得物转化到Top10大肠杆菌感受态细胞中，形成pBR322-wt构建物。
外蛋白合成酶基因融合构建物的制备将ect A、ect B和ect C组合起来，形成基因融合构建物(图9)。该过程需要除去ect A和ect B的终止密码子、基因间空间以及ect B和ect C的起始密码子，并使ect A、ect B和ect C按照阅读框与由4个甘氨酸组成的接头序列融合。进行下述PCR操作实现上述构建使用引物对ect-5′(SEQ ID NO3)和031-25(5′-CGCTGAGATCATTCTGGCCACCGCCACCCTTTGTAAATGGTCCTATTCGAAATGTC-3′)(SEQ ID NO5，划线部分为编码由4个甘氨酸组成的接头的位点)产生ectA片段；使用引物对031-24(5′-CCATTTACACAAGGGTGGCGGTGGCCAGAATGATCTCAGCGTTTTTAATGAATACG-3′)(SEQ ID NO6，划线部分为编码由4个甘氨酸组成的接头的位点)和031-27(5′-GTTTAATTACTTTACCGCCACCGCCTTTGGCTACGAGGTTGCTTTCAGCGGTAAC-3′(SEQ ID NO7，划线部分为编码由4个甘氨酸组成的接头的位点)产生ect B片段；使用引物对031-26(5′-CCTCGTAGCCAAAGGCGGTGGCGGTAAAGTAATTAAACTCGAAGATTTGCTCGGC-3′)(SEQ ID NO8，划线部分为编码由4个甘氨酸组成的接头的位点)和In-3′(SEQ IDNO4)产生ect C片段。
在没有引物的情况下，进行5-10轮如下的PCR95℃熔化温度30秒、60℃退火温度30秒和72℃延伸温度1分钟，装配这三条重叠的PCR片段。然后使用ect-5′和In-3′引物，在55℃的退火温度扩增所得的装配产物。在装配和随后的PCR扩增中都使用到Herculase酶增强的DNA聚合酶(Stratagene)。用Nco I和Nde I限制酶消化所得的PCR产物，然后将其克隆到Nco I/Nde I消化的pBR322中。通过测序分析确定该构建物的接头区域。将所得质粒转化到Top10大肠杆菌感受态细胞中。
用外蛋白合成酶基因融合构建物转化的大肠杆菌对盐的耐受能力测试用wt外蛋白操纵子和外蛋白合成酶融合构建物转化的Top10′细胞在各种盐浓度中生长的能力。测试涉及使细胞在37℃的下述培养基中生长36小时MM63〔100mM KH2PO4，75mM KOH，15mM(NH4)2SO4，1mM MgSO4，3.9μMFeSO4，22mM葡萄糖，1.5ml/l维生素溶液，pH7.4；维生素溶液10mg生物素、35mg烟酰胺、30mg二氯硫胺(thiamine dichloride)、20mg对氨基苯甲酸、10mg盐酸吡哆醛、10mg泛酸钙，5mg维生素B12在100ml水中〕，加上10％LB和不同量的盐(0-5％NaCl)。用分光光度计在600nm测量培养物的细胞密度。
结果(图10)显示，三个基因融合构建物赋予大肠杆菌具有与野生型外蛋白操纵子可比的耐受盐的能力。
虽然为了清楚和理解的目的，已对前述本发明作了一定程度的详细描述，但是，本领域熟练的技术人员阅读本公开内容后应理解，在不偏离本发明的实质范围的情况下，可对本发明的形式和细节作出修改。例如，上述所有的技术和组合物可以各种组合使用。出于所有的目的，与所有的出版物、专利文献(如申请、专利等)或本申请中所引用的其它参考文献在文中被单独提到的程度那样，都被完整地纳入本文作为参考。
权利要求
1.一种生产修饰的基因融合构建物的方法，其特征在于，该方法包括使两条或更多条异源核酸序列互接，所述各异源核酸序列编码一个或多个酶结构域，并且所述两条或更多条核酸序列中至少有一条被修饰，从而产生修饰的基因融合构建物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少两条或更多条核酸序列中至少有一条在所述两条或更多条核酸序列互接之前被修饰。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两条或更多条核酸序列中至少有一条在所述两条或更多条核酸序列互接之后被修饰。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一个或多个酶结构域参与相同的代谢途径。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两条或更多条核酸序列中的至少一条是通过改组至少一条核酸序列而被修饰。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述改组至少一条核酸序列包括循环性序列重组。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两条或更多条核酸序列编码选自八氢番茄红素合成酶、八氢番茄核酸去饱和酶、z-胡萝卜素去饱和酶和β-环化酶的酶结构域。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两条或更多条核酸序列编码选自二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰转移酶和外蛋白合成酶的酶结构域。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两条或更多条核酸序列编码选自β-酮硫解酶、D-还原酶和聚(羟基链烷酸酯)合成酶的酶结构域。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两条或更多条核酸序列编码选自酮合成酶-酰基转移酶、链长度因子、酰基载体蛋白和环化酶的酶结构域。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述两条或更多条核酸序列互接包括使所述两条或更多条核酸序列直接相互连接。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述两条或更多条核酸序列互接包括使所述两条或更多条核酸序列与一条或多条核苷酸接头序列连接。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述一条或多条核苷酸接头序列各自含有约3-300个核苷酸。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述一条或多条核苷酸接头序列各自含有约12-90个核苷酸。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述一条或多条核苷酸接头序列中至少有一条含有一个或多个内含子序列。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述一条或多条核苷酸接头序列中至少有一条含有编码肽接头的核苷酸序列。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述肽接头含有可切割的肽序列或内含肽序列。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述肽接头中至少约有80％的氨基酸残基选自丙氨酸和甘氨酸残基。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述修饰的基因构建物含有一条或多条转录调节序列。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述一条或多条转录调节序列含有一条或多条植物转录调节序列。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述修饰的基因融合构建物导入真核系统中。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述真核系统是植物系统。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述植物系统选自草莓属、百脉根属、苜蓿属、驴食豆、车轴草属、胡卢巴属、豇豆属、柑桔属、亚麻属、老鹳草属、木薯属、胡萝卜属、拟南芥属、芸苔属、萝卜属、白芥属、颠茄属、辣椒属、天仙子属、番茄属、烟草属、茄属、碧冬茄属、毛地黄属、甘牛至属、菊苣属、向日葵属、莴苣属、雀麦属、天门冬属、金鱼草属、龙骨角属、龙面花属、天竺葵属、稷属、狼尾草属、毛茛属、千里光属、蛾蝶花属、香瓜属、博洛瓦阿拉属、大豆属、黑麦草属、玉蜀黍属、小麦属、蜀黍属、苹果属、旱芹属、水仙属、杜库斯属和曼陀罗属。
24.一种转基因植物，其特征在于，该转基因植物由权利要求22所述的方法制得。
25.一种修饰的基因融合构建物，其特征在于，所述构建物含有两条或更多条异源的核酸序列，其中，各核酸序列编码一个或多个酶结构域，且所述两条或更多条核酸序列中至少有一条被修饰。
26.如权利要求25所述的修饰的基因构建物，其特征在于，所述两条或更多条核酸序列中至少有一条被改组。
27.如权利要求25所述的修饰的基因融合构建物，其特征在于，所述两条或更多条异源的核酸序列编码至少两个选自八氢番茄红素合成酶、八氢番茄核酸去饱和酶、z-胡萝卜素去饱和酶和β-环化酶的酶结构域。
28.如权利要求25所述的修饰的基因融合构建物，其特征在于，所述两条或更多条核酸序列编码至少两个选自二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰转移酶和外蛋白合成酶的酶结构域。
29.如权利要求25所述的修饰的基因融合构建物，其特征在于，所述两条或更多条核酸序列编码至少两个选自β-酮硫解酶、D-还原酶和聚(羟基链烷酸酯)合成酶的酶结构域。
30.如权利要求25所述的修饰的基因融合构建物，其特征在于，所述两条或更多条核酸序列编码至少两个选自酮合成酶-酰基转移酶、链长度因子、酰基载体蛋白和环化酶的酶结构域。
31.一种载体，其特征在于，该载体含有权利要求25所述的修饰的基因融合构建物和启动子。
32.一种生产基因融合构建物的方法，其特征在于，该方法包括使参与相同代谢途径的两条或更多条异源核酸互接，其中所述互接的核酸序列至少有一条从真核生物得到，而另一条互接的核酸序列从不同物种的真核生物得到，或者从原核生物得到。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，至少有一条所述互接的核酸序列从植物得到。
34.如权利要求32所述的方法，其特征在于，至少有一条所述互接的核酸序列从原核生物得到。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，至少有一条所述互接的核酸序列从植物得到。
36.如权利要求32所述的方法，其特征在于，至少有两条所述互接的核酸序列从不同的植物物种得到。
37.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述方法包括使参与相同代谢途径的三条或更多条异源核酸序列互接。
38.如权利要求32所述的方法，其特征在于，至少一条所述异源核酸序列被修饰。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，至少一条所述异源核酸序列被改组。
40.如权利要求32所述的方法，其特征在于，两条或更多条核酸序列编码选自八氢番茄红素合成酶、八氢番茄核酸去饱和酶、z-胡萝卜素去饱和酶和β-环化酶的酶结构域。
41.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述两条或更多条核酸序列编码选自二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰转移酶和外蛋白合成酶的酶结构域。
42.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述两条或更多条核酸序列编码选自β-酮硫解酶、D-还原酶和聚(羟基链烷酸酯)合成酶的酶结构域。
43.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述两条或更多条核酸序列编码选自酮合成酶-酰基转移酶、链长度因子、酰基载体蛋白和环化酶的酶结构域。
44.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述互接的核酸序列直接相互连接。
45.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述互接的核酸序列用一条或多条核苷酸接头序列相连。
46.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述修饰的基因融合构建物含有一条或多条转录调节序列。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述一条或多条转录调节序列含有一条或多条植物转录调节序列。
48.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述修饰的基因融合构建物导入真核系统中。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述真核系统是植物系统。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述植物系统选自草莓属、百脉根属、苜蓿属、驴食豆、车轴草属、胡卢巴属、豇豆属、柑桔属、亚麻属、老鹳草属、木薯属、胡萝卜属、拟南芥属、芸苔属、萝卜属、白芥属、颠茄属、辣椒属、天仙子属、番茄属、烟草属、茄属、碧冬茄属、毛地黄属、甘牛至属、菊苣属、向日葵属、莴苣属、雀麦属、天门冬属、金鱼草属、龙骨角属、龙面花属、天竺葵属、稷属、狼尾草属、毛茛属、千里光属、蛾蝶花属、香瓜属、博洛瓦阿拉属、大豆属、黑麦草属、玉蜀黍属、小麦属、蜀黍属、苹果属、旱芹属、水仙属、杜库斯属和曼陀罗属。
51.一种转基因植物，其特征在于，该转基因植物采用权利要求49所述的方法制备。
52.一种基因融合构建物，其特征在于，它含有两条或更多条参与相同代谢途径的互接的异源核酸序列，其中所述互接的核酸序列中至少有一条是从真核生物得到，而另一条互接的核酸序列是从不同物种的真核生物得到，或者从原核生物得到。
53.如权利要求52所述的基因构建物，其特征在于，所述核酸序列至少有一条被修饰。
54.如权利要求53所述的基因构建物，其特征在于，所述核酸序列至少有一条被改组。
55.如权利要求52所述的基因融合构建物，其特征在于，所述两条或更多条异源核酸序列编码至少两个选自八氢番茄红素合成酶、八氢番茄核酸去饱和酶、z-胡萝卜素去饱和酶和β-环化酶的酶结构域。
56.如权利要求52所述的修饰的基因融合构建物，其特征在于，所述两条或更多条核酸序列编码至少两个选自二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰转移酶和外蛋白合成酶的酶结构域。
57.如权利要求52所述的基因融合构建物，其特征在于，所述两条或更多条核酸序列编码至少两个选自β-酮硫解酶、D-还原酶和聚(羟基链烷酸酯)合成酶的酶结构域。
58.如权利要求52所述的基因融合构建物，其特征在于，所述两条或更多条核酸序列编码至少两个选自酮合成酶-酰基转移酶、链长度因子、酰基载体蛋白和环化酶的酶结构域。
59.一种载体，其特征在于，该载体含有权利要求52所述的修饰的基因融合构建物和启动子。
60.一种基因融合构建物，其特征在于，它含有两条或更多条互接的异源核酸序列，其中所述两条或更多条核酸序列编码至少两个选自二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰转移酶和外蛋白合成酶的酶结构域。
61.如权利要求60所述的重组核酸序列，其特征在于，所述至少两个互接的核酸序列中至少有条被修饰。
62.如权利要求61所述的重组核酸序列，其特征在于，所述至少两条互接的核酸序列中至少有一条被改组。
63.一种基因融合构建物，其特征在于，它含有三条或更多条互接的异源核酸序列，其中所述三条或更多条核酸序列编码至少三个选自β-酮硫解酶、D-还原酶和聚(羟基链烷酸酯)合成酶的酶结构域。
64.如权利要求63所述的重组核酸序列，其特征在于，所述至少三条互接的核酸序列中至少有一条被修饰。
65.如权利要求64所述的重组核酸序列，其特征在于，所述至少三条互接的核酸序列中至少有一条被改组。
66.一种基因融合构建物，其特征在于，它含有两条或更多条互接的异源核酸序列，其中所述两条或更多条核酸序列编码至少两个选自选自酮合成酶-酰基转移酶、链长度因子、酰基载体蛋白和环化酶的酶结构域。
67.如权利要求66所述的重组核酸序列，其特征在于，所述至少两条互接的核酸序列中至少有一条被修饰。
68.如权利要求67所述的重组核酸序列，其特征在于，所述至少两条互接的核酸序列中至少有一条被改组。
69.一种基因融合构建物，其特征在于，它含有两条或更多条互接的异源核酸序列，其中所述两条或更多条核酸序列编码至少两个选自八氢番茄红素合成酶、八氢番茄核酸去饱和酶、z-胡萝卜素去饱和酶和β-环化酶的酶结构域。
70.如权利要求69所述的重组核酸序列，其特征在于，所述至少两条互接的核酸序列中至少有一条被修饰。
71.如权利要求70所述的重组核酸序列，其特征在于，所述至少两条互接的核酸序列中至少有一条被改组。
72.一种杂交蛋白质，其特征在于，它含有两个或更多个参与相同代谢途径的异源酶结构域，其中所述两个或更多个酶结构域中至少有一个被已修饰的核酸序列编码。
73.如权利要求72所述的杂交蛋白质，其特征在于，所述两个或更多个酶结构域中至少有一个被已改组的核酸序列编码。
74.如权利要求72所述的杂交蛋白质，其特征在于，所述两个或更多个酶结构域通过一条或多条肽接头序列连接。
75.如权利要求74所述的杂交蛋白质，其特征在于，所述一条或多条肽接头序列中至少有一条含有可切割的肽序列或内含肽序列。
76.如权利要求72所述的杂交蛋白质，其特征在于，所述参与相同代谢途径的酶结构域含有八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素去饱和酶、z-胡萝卜素去饱和酶或β-环化酶中的一种或多种。
77.如权利要求72所述的杂交蛋白质，其特征在于，所述参与相同代谢途径的酶结构域含有二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰转移酶和外蛋白合成酶中的一种或多种。
78.如权利要求72所述的杂交蛋白质，其特征在于，所述参与相同代谢途径的酶结构域含有β-酮硫解酶、D-还原酶和聚(羟基链烷酸酯)合成酶中的一种或多种。
79.如权利要求72所述的杂交蛋白质，其特征在于，所述参与相同代谢途径的酶结构域含有酮合成酶-酰基转移酶、链长度因子、酰基载体蛋白和环化酶中的一种或多种。
80.一种生产基因融合构建物的方法，其特征在于，该方法包括将编码至少两个酶结构域的两条或更多条核酸序列互接，从而产生基因融合构建物，其中至少一条所述核酸从植物得到。
81.如权利要求80所述的方法，其特征在于，所述植物酶选自八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素去饱和酶、z-胡萝卜素去饱和酶或β-环化酶。
82.如权利要求80所述的方法，其特征在于，所述一个或多个酶结构域参与相同的代谢途径。
83.如权利要求80所述的方法，其特征在于，所述两条或更多条核酸序列中至少有一条被修饰。
84.如权利要求83所述的方法，其特征在于，所述两条或更多条核酸序列中至少有一条被改组。
85.如权利要求84所述的方法，其特征在于，所述改组至少一条核酸序列包括循环性序列重组。
86.如权利要求80所述的方法，其特征在于，将两条或更多条所述核酸序列互接包括使所述两条或更多条核酸序列直接相互连接。
87.如权利要求80所述的方法，其特征在于，将两条或更多条所述核酸序列互接包括使所述两条或更多条核酸序列与一条或多条核苷酸接头序列连接。
88.如权利要求87所述的方法，其特征在于，所述一条或多条核苷酸接头序列各自含有约3-300个核苷酸，
89.如权利要求88所述的方法，其特征在于，所述一条或多条核苷酸接头序列各自含有约12-90个核苷酸。
90.如权利要求87所述的方法，其特征在于，所述一条或多条核苷酸接头序列中至少有一条含有一个或多个内含子序列。
91.如权利要求87所述的方法，其特征在于，所述一条或多条核苷酸接头序列中至少有一条含有编码肽接头的核苷酸序列。
92.如权利要求91所述的方法，其特征在于，所述肽接头含有可切割的肽序列或内含肽序列。
93.如权利要求91所述的方法，其特征在于，所述肽接头中至少有约80％的氨基酸残基选自丙氨酸和甘氨酸残基。
94.如权利要求80所述的方法，其特征在于，所述修饰的基因融合构建物含有一条或多条转录调节序列。
95.如权利要求94所述的方法，其特征在于，所述一条或多条转录调节序列含有一条或多条植物转录调节序列。
96.如权利要求80所述的方法，其特征在于，该方法还包括将所述修饰的基因融合构建物导入真核系统中。
97.如权利要求96所述的方法，其特征在于，所述真核系统是植物系统。
98.如权利要求97所述的方法，其特征在于，所述植物系统选自草莓属、百脉根属、苜蓿属、驴食豆、车轴草属、胡卢巴属、豇豆属、柑桔属、亚麻属、老鹳草属、木薯属、胡萝卜属、拟南芥属、芸苔属、萝卜属、白芥属、颠茄属、辣椒属、天仙子属、番茄属、烟草属、茄属、碧冬茄属、毛地黄属、甘牛至属、菊苣属、向日葵属、莴苣属、雀麦属、天门冬属、金鱼草属、龙骨角属、龙面花属、天竺葵属、稷属、狼尾草属、毛茛属、千里光属、蛾蝶花属、香瓜属、博洛瓦阿拉属、大豆属、黑麦草属、玉蜀黍属、小麦属、蜀黍属、苹果属、旱芹属、水仙属、杜库斯属和曼陀罗属。
99.一种转基因植物，其特征在于，该转基因植物由权利要求97所述的方法制得。
100.一种基因融合构建物，其特征在于，它含有两条或更多条互接的异源核酸序列，其中所述各核酸序列编码一个或多个酶结构域，所述两条或更多条核酸序列中至少有一条从植物得到。
101.如权利要求100所述的基因融合构建物，其特征在于，所述两条或更多条异源核酸序列中至少有一条被修饰。
102.如权利要求101所述的基因融合构建物，其特征在于，所述两条或更多条异源核酸序列中至少有一条被改组。
103.如权利要求100所述的基因融合构建物，其特征在于，所述两条或更多条异源核酸序列编码至少两个选自八氢番茄红素合成酶、八氢番茄核酸去饱和酶、z-胡萝卜素去饱和酶和β-环化酶的酶结构域。
104.一种载体，其特征在于，它含有权利要求100所述的基因融合构建物和启动子。
全文摘要
本发明总的涉及用于代谢途径表达的方法和技术、编码多功能性酶结构域的新颖的基因融合构建物，以及相关的杂交蛋白质。
文档编号C12N15/09GK1468313SQ01816668
公开日2004年1月14日 申请日期2001年8月16日 优先权日2000年8月24日
发明者L·刘, G·朱, L 刘 申请人:麦克西根股份有限公司