Pes1的单克隆抗体及其应用的制作方法

专利名称：Pes1的单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，具体地涉及针对PESl的单克隆抗体或者来源于该抗体的能够特异性结合PESl的生物活性片段及其制备方法，以及分泌该抗体的杂交瘤细胞系， 本发明还涉及包含所述抗体或其生物活性片段的试剂盒、抗肿瘤药物和检测试剂，所述抗体或其生物活性片段在检测样品中PESl蛋白水平的应用，以及所述抗体在辅助诊断肿瘤、 监测肿瘤和/或肿瘤患者预后判断中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤的发病率近年来在全球范围内继续呈上升之势。由于恶性肿瘤的发病大多较为隐匿，早期没有明显症状，病人就诊时往往已经到了晚期，并且许多在临床传统病理及 m分期表现相近的病人，其预后也有较大的差异，反映出恶性肿瘤发生、发展的复杂性。目前尚缺乏能用于诊断或预后判断的理想肿瘤标志物。如几十年来作为消化道肿瘤的标志物癌胚抗原CEA，在一些非肿瘤性疾病如胃炎、肝硬化、溃疡性结肠炎中也可有升高，其特异性并不理想。因此，寻找与恶性肿瘤发生、发展相关的肿瘤标志物和/或肿瘤抗原，对恶性肿瘤的临床诊断、监视病情发展及判断预后均有重要意义，同时对肿瘤发生的分子机制也有重要意义。Pescadillo基因是在研究逆转录病毒诱发的斑马鱼胚胎发育缺陷中发现的，该基因在酵母、小鼠和人类均有表达，且高度保守，分别被命名为YPHI/Nop7p、Pesl和PES1， 其中小鼠和人的pescadillo分子同源性高达89%。PESl基因(GenBank Accession No. ΝΜ_014303)定位于人染色体22ql2. 1，含有11个外显子和10个内含子，编码588个氨基酸，表达分子量约为70kD的蛋白。PESl蛋白具核定位信号序列，C端有一个小泛素化样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifyer，SUMO)位点，在第 315 412aa 区域具有一典型的乳腺癌敏感蛋白 IC 末端(breast cancer susceptibility protein lC—terminal， BRCT)结构域。有研究表明，具有BRCT结构域的许多分子参与DNA修复、重组以及细胞周期的控制。研究表明，在斑马鱼胚胎发育过程中，pescadillo基因突变会导致头部、眼睛、肝脏等器官的发育受到明显抑制；酵母细胞中pescadillo基因发生突变后其生长受到明显抑制，细胞被阻滞于Gl或G2期，表明pescadillo在细胞增殖和细胞周期进程中起着极其重要的作用。细胞增殖包括细胞体积增加和细胞分裂两个相互协调的过程，前一过程主要进行核糖体的合成，其合成的效率受到RNA聚合酶I及其调节蛋白的调控；而细胞分裂的进行则需要启动细胞周期程序，许多蛋白质分子能同时参与这两个过程。研究表明PESl蛋白是在核糖核蛋白的生成中极为重要的关键蛋白质，在有丝分裂的后期它还参与早期核仁的形成，在有丝分裂结束后，它参与核糖核蛋白体的前体的形成，PESl突变或缺陷导致细胞周期阻滞。研究表明，成体的小鼠肝脏经部分切除之后，残留的实质细胞迅速增殖以恢复正常的肝体积，在16 48小时内这些处于增殖阶段细胞中的Pescadillo表达水平迅速升高。外源性过量表达的Pescadillo能够转化人和小鼠的成纤维细胞，使其在软琼脂中发生锚着非依赖性生长。PESl在许多肿瘤细胞中发现有过量表达，如乳腺癌、胶质瘤、前列腺癌及胃癌等。上述研究表明PESl与细胞的增殖、转化、恶变密切相关，并且在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要的功能。现有技术中关于PESl的研究多是利用PESl的多克隆抗体进行的，未见PESl单克隆抗体的报道。多克隆抗体的特异性差，用于免疫组化时显色背景高，质量不易控制，难以在临床应用推广。目前临床迫切需要特异性强、敏感性高的PESl单克隆抗体，以及能够分泌高效价所述单克隆抗体的杂交瘤细胞，以便有助于肿瘤的临床诊断、预后判断，并指导临床治疗。 同时，单克隆抗体可作为PESl生物学功能研究的重要工具，用于Western blot、免疫沉淀、 免疫细胞化学等实验。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种PESl的单克隆抗体或者来源于该抗体的能够特异性结合PESl的生物活性片段；本发明的另一目的是提供分泌本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系；本发明的另一目的是一种检测PESl水平的试剂盒。本发明的另一目的是提供本发明的单克隆抗体或其生物活性片段在制备用于检测样品中PESl水平的试剂或试剂盒中的应用。本发明的另一目的是提供本发明的单克隆抗体或其生物活性片段在制备用于辅助诊断肿瘤、监测肿瘤和/或肿瘤患者预后判断的试剂或试剂盒中的应用。本发明的另一目的是提供一种抗肿瘤药物。本发明的另一目的是提供一种PESl水平的检测试剂。一方面，本发明提供一种PESl的单克隆抗体或者来源于该抗体的能够特异性结合PESl的生物活性片段，所述单克隆抗体由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为CGMCC No. 3646或CGMCC No. 3647的杂交瘤细胞分泌。本发明人通过大量实验以及丰富技术经验获得了本发明的单克隆抗体(单抗)。经鉴定，本发明单克隆抗体的亚类是IgGl。本发明的单克隆抗体具有较高的灵敏度和特异性，可识别内源性PESl蛋白并可用于免疫印迹、免疫沉淀、免疫细胞化学、免疫荧光、免疫组织化学(免疫组化)等免疫学检测，可应用于临床组织标本中PESl蛋白表达水平的检测，以预测肿瘤的转移趋势及患者的预后；可应用于疑似或肿瘤(如乳腺癌、胶质瘤、前列腺癌或胃癌)患者体液中PESl蛋白的检测，以帮助肿瘤的诊断；也可与检测其它肿瘤标志物的试剂联合能提高肿瘤诊断的敏感性和特异性，也有助于动态观察肿瘤进程，为个体化的治疗方案提供参考依据；亦也可用于 PESl的相关研究和药物开发。另一方面，本发明提供一种分泌本发明所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其已于2010年03月05日以保藏号CGMCC No. 3646或CGMCC No. 3647被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)。本发明的杂交瘤细胞系具有较强的分泌单克隆抗体的能力，能稳定、大量分泌本发明的单克隆抗体。本领域普通技术人员已知，可以直接采用PESl蛋白作为抗原，获得本发明的单克隆抗体。也可以将本发明PESl蛋白与已知的标签形成重组蛋白作为抗原，获得对PESl有反应性、对标签没有反应性的本发明的单克隆抗体。在本发明的一个实施方式中，本发明通过原核表达获得纯化的GST-PESl融合蛋白，并通过杂交瘤技术获得PESl蛋白的单克隆抗体。因此，本发明还提供本发明单克隆抗体的制备方法，本发明还提供了制备所述的单克隆抗体的方法，该方法包括用融合蛋白GST-PESl免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对PESl有反应性、对谷胱苷肽巯基转移酶没有反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，优选为本发明所述的CGMCC No. 3646或CGMCC No. 3647杂交瘤细胞， 然后将杂交瘤细胞注入适宜的哺乳动物并从动物腹水中获取抗体。该方法仅是示例性的， 例如可以用同样的方法免疫其他哺乳动物，大鼠、兔子、豚鼠或仓鼠等。在本发明的一个实施方式中，以PESl基因的cDNA为模板，用PCR方法扩增PESl 基因的cDNA片段。将PCR扩增产物克隆到原核表达载体pGEX4T-l上，构建原核重组质粒PGEX4T-1-PES1，并在大肠杆菌中表达。挑选单克隆阳性菌，大量诱导表达GST-PESl 蛋白并纯化。参照Kohler和Milstein建立的B淋巴细胞杂交瘤技术(Kohler G， Milstein C,Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975Aug 7 ；256 (5517) :495-7)，本发明用纯化的 GST-PES1 蛋白免疫BALB/c小鼠。将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，制备杂交瘤细胞。用 ELISA方法筛选阳性细胞克隆。本发明人经过多次试验，获得了多株阳性细胞克隆。对这些阳性克隆所分泌的单克隆抗体进行分析鉴定，发现两株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株 CGMCCNo. 3646或CGMCC No. 3647，其分泌的PESl单克隆抗体3B1和1H5具有较高的灵敏度和特异性，可识别内源性PESl蛋白并可用于免疫印迹、免疫沉淀、免疫细胞化学、免疫荧光、免疫组织化学(免疫组化)等免疫学检测；可应用于临床组织标本中PESl蛋白表达水平的检测。另一方面，本发明提供一种检测PESl水平的试剂盒，其含有本发明的单克隆抗体或其活性片段；优选所述的试剂盒还含有第二抗体和用于检测的酶或荧光或放射标记物， 以及缓冲液；优选优选所述第二抗体为本发明所述的单克隆抗体或抗本发明所述单克隆抗体的抗抗体(例如本领域常用的羊抗鼠IgG)或按本领域已知技术制备的抗PESl的多抗。作为检测信号的荧光和/或放射标记可以是放射性同位素、荧光化合物、生物素和酶等。所述酶包括，但不限于，辣根过氧化物酶(horseradish Peroxidase，HRP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatease，AP)、葡萄糖氧化酶、β _D_半乳糖苷酶和脲酶等，优选辣根过氧化物酶和/或碱性磷酸酶。本领域普通技术人员已知，针对不同的酶，可使用不同的底物。HRP作用的底物包括，但不限于，邻苯二胺(0PD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS、二氨基联苯胺(diamino benzidine,DAB)等。碱性磷酸酶的底物一般采用对硝基苯磷酸酯(p_NPP)、 碱性磷酸酶红(alkaline phosphatase-red，AP-Red，又称Fast Red，快红)，AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮)。本发明的试剂盒可用于检测乳腺癌、胶质瘤、前列腺癌或胃癌等肿瘤及多种癌症细胞系及血清中的PESl表达水平，进而用于对上述多种癌症的辅助诊断和相关的实验研究以及指导临床治疗。在本发明的另一具体实施方式
中，所述试剂盒用于检测组织细胞中PESl的表达水平，特别是对乳腺癌、胶质瘤、前列腺癌或胃癌等肿瘤组织中PESl的检测，其包括本发明所述单克隆抗体或其活性片段，还包括用于检测本发明所述单克隆抗体或活性片段的抗抗体及酶或荧光标记物和相应的缓冲液；在本发明的优选实施方式中，所述组织细胞为来自肿瘤组织的活检细胞或培养细胞或为已建系培养细胞。另一方面，本发明提供本发明的单克隆抗体或其生物活性片段在制备检测样品中 PESl水平的试剂或试剂盒中的应用。所用检测方法包括可以使用本发明抗体的所有免疫方法，例如Western Blot、免疫沉淀、免疫组化、免疫荧光等。优选为免疫沉淀。本发明的单克隆抗体可检测任何样品的PESl的表达水平，优选所述样品为受试个体(如人体)体液样品、或细胞蛋白提取液；可为来自受试个体的生物流体和组织样品(例如乳腺癌组织、胶质瘤组织、前列腺癌组织或胃癌组织)。另一方面，本发明提供本发明的单克隆抗体或其生物活性片段在制备用于辅助诊断肿瘤、监测肿瘤和/或肿瘤患者预后判断的试剂和/或试剂盒中的应用。可单独使用本发明抗PESl单抗进行辅助诊断肿瘤、监测肿瘤和/或肿瘤患者预后判断，也可以组合检测本领域已知的肿瘤标志物的试剂，以进一步提高辅助诊断肿瘤、监测肿瘤和/或肿瘤患者预后判断。另一方面，本发明提供一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物含有本发明所述的单克隆抗体或其生物活性片段。本发明的PESl单克隆抗体能够与PESl特异性、高效结合。因此， 给予肿瘤患者本发明的单克隆抗体或该抗体的能够与PESl蛋白特异性结合的生物活性片段，可能抑制肿瘤细胞内PESl的活性，从而起到抑制肿瘤浸润、转移的作用。因此，本发明还提供一种治疗动物(包括人)肿瘤的方法，包括给予需要治疗的动物治疗有效量的本发明单克隆抗体或其生物活性片段。对此处所用“肿瘤”或“癌症”没有特别限制，只要与PESl 的过表达相关即可，优选为乳腺癌、胶质瘤、前列腺癌或胃癌。所述药物的制备方法可以是本领域技术人员熟知的任何方法，例如将本发明的单克隆抗体或其生物活性片段与适当的赋形剂混合。所述赋形剂是本领域常规用于抗体药物制备的赋形剂，如水、盐水、缓冲剂等。所述药物的给药途径可以是任何抗体药物的常规给药途径，例如，静脉内注射、皮下注射、肿瘤内注射等。另一方面，本发明提供一种检测试剂，该检测试剂含有本发明所述的单克隆抗体或其生物活性片段。所述检测试剂的制备方法可以是本领域技术人员熟知的任何方法，例如将本发明的单克隆抗体或其生物活性片段与适当的载体混和，如水、盐水、缓冲剂等。本发明的检测试剂可应用于临床组织标本中PESl蛋白表达水平的检测，预测早期肿瘤的转移趋势及患者的预后；亦可应用于早期肿瘤患者血清PESl蛋白表达的检测，同时可动态检测肿瘤进展过程中PESl蛋白水平的变化，给临床医生制定个体化的治疗方案提供参考依据。


图1 用SDS-PAGE胶进行对纯化制备的1B7抗体、1H5抗体和3B1抗体进行定量分析并鉴定其纯度。结果显示纯化的到1B7抗体、1H5抗体和3B1抗体，SDS-PAGE胶未见杂蛋白带，可见制备抗体纯度较高，均可达95%以上；定量分析可知分别制备获得纯化1B7抗体 2mg/mLX 4mL、1H5 抗体 3mg/mLX3. 5mL 禾口 3B1 抗体 2mg/mLX 5mL。图2 用包被GST-PESl重组蛋白的微量滴定板以ELISA方法分析1B7抗体、1H5抗体和3B1抗体的效价。其中，用包被GST的微量滴定板为阴性对照。将浓度分别为2yg/ml 的纯化抗体加到微量滴定板中，并以鼠抗GST抗体为抗体阳性对照，以正常鼠IgG为抗体阴性对照。结果显示1B7抗体、1H5抗体和3B1抗体只特异结合GST-PESl，与其它蛋白如GST 无交叉反应。图3 用Wiestern-Blot的方法检测原核蛋白GST-PES1以及人胃癌细胞系AGS细胞中内源性PESl的表达。12% SDS-PAGE电泳，GST-PESl每孔上样量为100ng(GST纯化蛋白每孔IOOng为阴性对照)，AGS细胞总蛋白上样量50 μ g，一抗为1B7抗体、1H5抗体和3B1 抗体浓度1 μ g/ml (正常鼠IgG为阴性对照)检测。结果显示1B7抗体、1H5抗体和3B1抗体可与GST-PESl结合，而不结合GST (图片A)。同时应用1B7抗体、1H5抗体和3B1抗体可检测到AGS细胞中内源性PESl的表达(图片B)。图4 免疫沉淀(IP)检测AGS细胞中PESl的表达。结果提示，抗体3B1可用于免疫沉淀反应，而单抗1B7和1H5则不能进行免疫沉淀反应。图5 用1B7抗体、1H5抗体和3B1抗体进行免疫细胞化学方法以检测人胃癌细胞株AGS中PESl的表达。结果显示AGS的细胞核仁显色为棕黄色，说明AGS细胞株表达PES1。图6 用免疫荧光的方法检测人胃肠癌细胞株AGS细胞中PESl的定位。一抗为1B7 抗体、1H5抗体或3B1抗体，二抗为FITC标记的荧光二抗，同时应用DAPI染料染细胞核。结果绿色荧光主要分布于细胞核仁中，从而提示PESl主要定位于细胞核仁。图7 用免疫组化方法检测胃癌和食管癌组织芯片中PESl的表达。结果显示胃癌癌旁正常组织及食管癌癌旁正常组织中不表达PES1，而相应的癌组织中可检测到PESl表达。图8 应用Western-Blot检测胃癌和结肠癌远端正常组织、癌旁组织和癌组织中 PESl的表达。12% SDS-PAGE电泳，胃癌和结肠癌远端正常组织、癌旁组织和癌组织裂解液每孔上样量为50 μ g，常规SDS-PAGE电泳、转膜、封闭后，加入一抗，分别为3B1抗体或内参蛋白β-Actin抗体进行常规WesternBlot检测。结果显示胃癌和结肠癌癌组织中PESl的表达较相应远端正常组织和癌旁组织明显升高，其中18例胃癌配对组织中有14例癌组织中PESl高表达，有2例PESl在不同病变组织中表达无明显差异，有2例PESl在远端正常组织和癌旁组织较癌组织高表达(图片Α) ；14例结肠癌配对组织中有10例癌组织中PESl 高表达，有4例PESl在不同病变组织中表达无明显差异(图片B)。用于专利程序的微生物保存(一 )分泌本发明单克隆抗体:3Β1的杂交瘤细胞株α PES1_2_3B1保藏日期2010年03月05日；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏编号CGMCCNo. 3646 ；分类命名分泌抗Pescadillo (PESl)单克隆抗体的杂交瘤细胞系。( 二)分泌本发明单克隆抗体1H5的杂交瘤细胞株α PES1-1-1H5保藏日期2010年03月05日；
保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏编号CGMCCNo. 3647 ；分类命名分泌抗Pescadillo (PESl)单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
具体实施例方式为了更清楚地理解本发明的实质，下面通过具体实施例并配合附图进一步详细说明本发明，但本发明并不因此而受到任何限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(2002年第三版[美]萨姆布鲁克等著，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、抗人PESl单克隆抗体的制备1、PESl抗原的制备分别设计PESl 基因(GenBank Accession No.匪 014303) cDNA 片段的 5，端正义引物 5，-CGCGGATCCTTCCGCCTTTACCAGTTGC-3，(SEQ ID NO 1)和 3，端反义引物 5，-CCGGAA TTCTCACTCCGGCCTTGCCTTCTTG-3’ (SEQ ID NO :2)(引物由上海生工生物工程公司合成)，并于引物两端分别引入BamH I和EcoR I酶切位点。用Trizol (购自hvitrogen公司)提取人胃癌细胞AGS总RNA，逆转录成cDNA，并应用上述引物进行PCR扩增PESlcDNA片段，产物长度为 1062bp(SEQ ID NO :3)。将PCR产物和pGEX-4Tl载体(购自Amersham Biosciences公司)分别都用BamH I和EcoR I酶切后进行连接，将该连接产物转化入大肠杆菌BL21菌株(购自天根生化科技有限公司)并挑取单克隆进行酶切鉴定，同时送测序。原核表达载体PGEX-4T-1的SD序列下游就是谷胱甘肽巯基转移酶(GST)基因，而克隆的外源PESl基因片段则与GST基因相连。当基因表达时，表达产物为GST和PESl基因片段产物的融合体GST-PESl，以方便PESl 的纯化。挑选测序正确阳性克隆的BL21菌株进行GST-PESl重组蛋白的小量诱导表达。取小量诱导表达鉴定为阳性的菌株进行GST-PESl重组蛋白的大量诱导表达。发明人对PESl 的诱导表达条件进行了探索，使用大肠杆菌BL21菌株，温度为37°C，诱导剂IPTG的浓度为0. 25mmol/L，诱导时间为5小时。在此条件下，GST-PESl的表达量最高，GST-PESl主要以包涵体形式存在于表达菌内。在每200mL菌液离心后获得的沉淀中，加入IOmL 0.5% Triton X-100/PBS悬浮细菌；冰浴间歇超声50s，破菌；离心(10000g，4°C，IOmin)；弃上清， 沉淀中加入IOml 2%去氧胆酸钠，冰浴间歇超声50s，室温振摇30min，离心(10000g，4°C， IOmin)，弃上清；沉淀中加入 500 μ 1 变性液(Urea8M，DTT IOmM, Tris-HCl pH8. 5 50mM，上述材料均购自Amresco公司)，并加少量10M NaOH充分变性溶解沉淀，室温平缓摇动3h，液体变清亮后，离心(10000g，4°C，IOmin)，弃沉淀；将变性后的上清液加入9倍体积的复性液 (GSH 5mM, GSSG 2mM, EDTA 5mM, Tris-HCl ρΗ8· 5 50mM，上述材料均购自 Amresco 公司)， 边加边搅拌，室温复性Ih后，4°C继续复性4h，离心(10000g，4°C，5min)；上清用2000ml, 25mMTris-HCl pH 7. 4透析过夜，期间，换液一次，次日用蔗糖包埋浓缩，10% SDS-PAGE检测其含量和纯度，可见GST-PESl纯度在90%以上，其含量为0. 8mg/mL，分装，_80°C贮存。2、PESl单克隆抗体的制备(1)小鼠免疫
(a)抗原原核表达的GST-PESl融合蛋白，免疫时抗原量为50mg/只/次，背部每只注射总体积为200mL，尾静脉注射50mL。(b)动物6 8周龄雌性Balb/c小鼠，体重20g/只(购自维通利华实验动物中心)。(c)免疫方法初次免疫前，取Balb/c小鼠的尾静脉血2mL作为阴性对照；初次免疫时将纯化定量的GST-PESl融合蛋白和等量的完全弗氏佐剂(购自Sigma公司)充分混勻直至取一小滴在水中不扩散，背部皮下多点免疫Balb/c小鼠；四周后，进行第一次加强免疫，将纯化的融合蛋白和等量的不完全弗氏佐剂(购自Sigma公司)混勻乳化，同样背部皮下多点免疫；7 14天后，取小鼠尾静脉血通过ELISA方法检测抗体效价，如抗体效价达到10_410_5，以尾静脉免疫进行抗原冲击，3 4天后进行融合。(2)细胞融合(a)饲养细胞的制备取两只正常昆明小鼠，断颈取血(其血清即为正常鼠血清)， 酒精浸泡5min消毒，剪开腹腔皮肤，暴露腹膜，在腹膜上剪一小口，吸取适量含HAT (购自 Sigma公司)的选择性DMEM培养液(购自Hyclone公司)冲洗腹腔，收集腹腔饲养细胞备用。(b)骨髓瘤细胞SP2/0的准备于融合前一周复苏SP2/0细胞，在含15%灭活的胎牛血清的DMEM培养液中培养。融合前一天换液，使SP2/0处于良好的生长状态，取2 3 瓶已近铺满的SP2/0细胞，用15mL无血清培养液吹起细胞置于50mL无菌塑料离心管中备用。(c)脾细胞的制备将冲击免疫后小鼠，断颈取血(其血清即为阳性多抗血清)，酒精浸泡消毒，将小鼠左侧卧位，分层剪开皮肤及腹膜，暴露腹腔，摘取脾脏，置于盛有无血清 DMEM培养液的平皿中，剪去周围脂肪和筋膜，再将脾放入平皿中的钢丝网QOO目)上，加入有少量无血清的DMEM，剪破包膜，用注射器芯挤压脾细胞过网，收集过网后的脾细胞于玻璃试管中；垂直静置数分钟；轻轻吸出上层细胞放入50mL无菌塑料试管中。(d)清洗SP2/0细胞和脾细胞将上述收集的SP2/0细胞和脾细胞离心，800 1000g，3 5min，弃上清，轻轻敲击试管底部使离心沉淀的细胞团块分散，用无血清的DMEM 轻轻吹打细胞，800 lOOOg，离心3 5min，重复一次。(e)融合将SP2/0细胞与脾细胞混勻，使脾细胞与SP2/0细胞的比例约是10 1， 800 lOOOg，离心3 5min，弃上清，用无菌滤纸条吸净离心管壁的培养残液，轻轻敲击试管底部使离心沉淀的细胞团块分散。在37°C水浴中，将ImL 50% PEG慢慢加入细胞中，边加边轻轻搅拌，Imin内加完，继续搅拌30s，静置lmin，将1. 5mL无血清DMEM培养液在Imin 内加入细胞中，动作尽量轻柔，边加边搅，终止融合，再慢慢加入3mL的无血清DMEM培养液， 最后，补加培养液至20mL。800 lOOOg，离心3 5min，弃上清，用少量含20%胎牛血清的HAT选择培养液轻轻搅散沉淀细胞，使之悬浮，加到已配好的含腹腔饲养细胞的SOmL含 20%胎牛血清的HAT选择培养液中。最后铺96孔板，IOOmL/孔，于37°C，5% CO2培养箱中培养。(3)酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选特异性单抗原核表达的GST、GST-PESl融合蛋白分别用包被液稀释至5mg/mL，包被96孔板， 50mL/孔，4°C过夜。0. 05% Tween20/PBS洗两遍。4%的脱脂奶粉(PBS配制)200mL/孔，室温2h或4°C过夜，0. 05% Tween20/PBS洗两遍，_70°C保存备用。检测步骤如下(a)取杂交瘤上清，50mL/孔，室温Ih。(b)0. 05% Tween-20/PBS 洗 5 遍。(c)加 HP 标记的羊抗鼠 IgG(l 3000)，50mL/ 孔，室温 45min。(d)0. 05% Tween-20/PBS 洗 5 遍。(e)加入OPD底物反应液，IOOmL/孔，避光显色(f)显色充分后加终止液50mL/孔，观察结果并用酶标仪检测0D492nm。(4)阳性克隆筛选和亚克隆(a)阳性克隆的筛选融合后第6 8天可见明显的细胞集落，计算细胞融合率，并用含20%胎牛血清的HAT选择培养液进行全换液。融合后10天左右取杂交瘤上清进行ELISA筛选，选取只与 GST-PESl反应阳性而与GST反应阴性的细胞克隆进行亚克隆化。(b)亚克隆化(Subclone)采用有限稀释法。一般亚克隆后第7 10天后再进行ELISA筛选，对阳性克隆进行下一次亚克隆，如此亚克隆3 5次，直至所有受检克隆均为阳性，扩大培养，建株，收集上清，冻存。由于氨甲喋呤对细胞的毒性较大，在进行亚克隆的过程中，将HAT培养液逐渐改为HT (购自Sigma公司)培养液。建株之后，可将HT培养液换为普通培养液。对阳性的杂交瘤细胞进行多次亚克隆。选取强阳性的克隆扩大培养、建株。本发明中，将其中一株所分泌的抗PESl单克隆抗体命名为:3B1，而该杂交瘤细胞株即为ciPESl-2-3Bl细胞株，该杂交瘤细胞株已于2010年03月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号CGMCC No. 3646 ；另一株所分泌的抗PESl单克隆抗体命名为 1H5，而该杂交瘤细胞株即为α PES1-1-1H5细胞株，该杂交瘤细胞株已于2010年03月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号CGMCC No. 3647 ；另一株所分泌的抗PESl 单克隆抗体命名为1B7，而该杂交瘤细胞株即为1B7细胞株。将1B7细胞、α PES1-1-1H5细胞或α PES1-2-3B1细胞接种于10周龄经降殖烷处理的Bal b/c小鼠腹腔中，至腹水形成增多腹部特别膨隆时处死小鼠取腹水，其内含大量1B7、α PES1-1-1H5或α PES1_2_3B1抗体。实施例2、鉴定1B7抗体、1H5抗体和3B1抗体的纯化用常规ELISA方法鉴定1B7抗体、1H5抗体和3B1抗体的亚类(抗体亚类试剂盒购自Sigma公司)，证实其均为IgGl，因此选用ProteinG Sepharose-4B柱进行纯化。取实施例1中收集腹水各IOmL经12000Xg离心后，避开油脂吸取上清，以平衡buffer稀释 5倍，通过0. 45 μ m滤器过滤，应用Purify蛋白纯化仪(购自GE公司)进行纯化，将稀释的腹水以lmL/min的流速上样，经平衡buffer (PBS)洗去杂蛋白后，以pH2. 6的酸性洗脱液(IOOmmol/L Glycin-HCl (pH 2. 6))洗脱，收取0D280 > 0. 5的组分，最后每毫升中加入 100 μ 1 2Μ Tris-base中和液进行中和，以保持抗体稳定，将纯化的抗体分装冻存于-80°C， 部分加入50%甘油，4°C保存，另取4μ 1行12% SDS-PAGE胶进行定量并鉴定其纯度。结果请参见图1所示，纯化的到1B7抗体、1H5抗体和3B1抗体，SDS-PAGE胶未见杂蛋白带，可见制备抗体纯度较高(均可达95%以上)，定量分析可知分别制备获得纯化1B7抗体aiig/ mLX4mL、lH5抗体;3mg/mLX3. 5mL和3B1抗体ang/mLX 5mL，从另一个方面可见实施例1中小鼠腹水产生抗体的产量均可达lmg/mL以上。实施例3、测定1B7抗体、1H5抗体和3B1抗体的特异性分析用PBS缓冲液透析纯化的1B7抗体、1H5抗体和3B1抗体，用紫外线分光光度计在 280nm处测定抗体的浓度。在GST-PESl蛋白包被的微量滴定板中分别加入浓度为2 μ g/ml的1B7抗体、1H5 抗体或3B1抗体，并将同样浓度的抗体加入GST蛋白包被的微量滴定板中作为阴性对照，并以正常小鼠IgG(购自中杉生物公司)为抗体阳性对照，室温温育1小时；之后，用0.05% Tween-20/PBS洗涤反应孔3次，PBS洗涤反应孔2次；再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG的抗体(购自Jackson Research Laboratories公司)，室温温育1小时；之后用 0. 05% Tween-20/PBS洗涤反应孔3次，PBS洗涤反应孔2次；然后向反应孔中加入辣根过氧化物酶底物0PD，室温显色30分钟后，加入终止液(12. 5% H2SO4)。用酶标仪测量0D492 处的吸光度值。结果请参见图2所示，1B7抗体、1H5抗体和3B1抗体特异结合GST-PES1，并且与GST无交叉反应。实施例4、Western-Blot检测PESl的表达1、Western-Blot 检测 GST-PES1具体按照以下操作进行1)取纯化的GST-PESl和GST蛋白行12%的SDS-PAGE电泳，每孔蛋白上样量为 100ng。2)至溴酚蓝达到胶的最下缘时停止，进行电转移。3)转膜结束后，丽春红染色，检测转膜效果以及做好标记。4) 5%脱脂奶粉封闭，4°C过夜。5)加一抗1B7抗体、1H5抗体或3B1抗体，浓度为1 μ g/ml，正常鼠IgG为阴性对照，室温1小时。6)0. 1% Tween-20/PBS 洗涤 7 次。7)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG的抗体，室温温育40分钟。8)0. 1% Tween-20/PBS 洗涤 7 次，PBS 洗涤 1 次。9)发光显影。结果请参见图3中图片A所示，显示1B7抗体、1H5抗体和3B1抗体特异结合GST-PESl，并且与GST无交叉反应。2, Western-Blot检测AGS细胞中内源性PESl表达。细胞裂解液RIPA(Tris(pH7. 4)，150mM NaCl, 1 % Triton X-100，1 % sodiumdeoxycholate,0. 1% SDS)裂解人胃癌细胞系AGS细胞(购自中国科学院细胞库)， 提取细胞总蛋白，行12%的SDS-PAGE电泳，每孔蛋白上样量为50μ g。其余步骤同前。结果请参见图3中图片B所示，显示1B7抗体、1H5抗体和3B1抗体能检测到人胃癌细胞系AGS中内源性PESl的表达。实施例5、免疫沉淀(IP)检测AGS细胞中PESl的表达本实施例中按照以下操作进行
1、细胞裂解液RIPA裂解AGS细胞，提取细胞总蛋白。2、取200 μ g细胞总蛋白分别与单抗1B7抗体、1H5抗体或3B1抗体杂交瘤上清 0.5ml 4°C 孵育 2h。3、力口入Protein G Sepharose 4Fast Flow (GE Healthcare, Uppsala, Sweden), 4°C 孵育浊。4、反应混合物用PBST洗涤3遍后，行常规12 %的SDS-PAGE电泳。5、转膜封闭后，以单抗3B1抗体为一抗进行常规Western blot检测。结果参见图 4所示，单抗3B1抗体可与AGS细胞中天然构象的PESl反应，而单抗1B7抗体和单抗1H5抗体则不能进行免疫沉淀反应。实施例6、免疫细胞化学检测人胃癌细胞株AGS中PESl的表达本实施例中按照以下操作进行1、常规方法制备人胃癌细胞株AGS的细胞爬片，冷丙酮/甲醇(体积比1 1)固定。2、将爬片浸泡于3% H2O2 (PBS稀释)内10分钟，以去除内源性过氧化物酶。3、PBS洗涤爬片2次。然后用BSA (PBS稀释)在37°C下封闭30分钟。滴加 1B7抗体、1H5抗体或3B1抗体(抗体浓度为2 μ g/mL)，在37°C下反应1小时。4,PBS洗涤爬片3次，滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG的抗体工作液(DAK0 ENVISION +System HRP Mouse)，在 37°C下反应 1 小时。5、用PBS洗涤爬片3次，在辣根过氧化物酶底物DAB的溶液中显色20分钟。6、用PBS终止显色，将爬片反盖在载玻片上，显微镜下观察，以细胞浆内出现棕黄色颗粒状为阳性。结果参见图5所示，显示AGS细胞核内出现棕黄色，说明利用1B7抗体、1H5抗体或 3B1抗体能检测到AGS细胞株表达PESl。实施例7、免疫荧光检测PESl在胃癌细胞AGS中的定位本实施例中按照以下操作进行1、常规方法制备人胃癌细胞株AGS的细胞爬片，冷丙酮/甲醇(体积比1 1)固定。2、将爬片浸泡于3% H2O2 (PBS稀释)内10分钟，以去除内源性过氧化物酶。3、PBS洗涤爬片2次。然后用BSA (PBS稀释)在37°C下封闭30分钟。滴加 1B7抗体、1H5抗体或3B1抗体(抗体浓度为2 μ g/mL)，在37°C下反应1小时。4、用PBS洗涤爬片3次。5、滴加FITC标记的二抗(购自中杉生物公司)1 200稀释制成工作液，室温下反应40min。6、用PBS洗涤爬片3次。7、滴加 1 μ g/mL DAPI 染细胞核 5min。8、用PBS洗涤爬片3次。9、50 %甘油封片，荧光显微镜下观察照相。结果参见图6所示，AGS细胞核仁处可见绿色荧光，蓝色荧光为DAPI着染的细胞核(其空腔位置为细胞核仁)。结果显示PESl主要定位于细胞核仁中。
实施例8、免疫组化检测胃癌和食管癌组织芯片中PESl的表达本实施例中按照以下操作进行1、选取人胃癌和食管癌组织芯片(购自陕西超英公司)。用二甲苯对切片进行脱蜡处理，梯度酒精使切片水化，用PBS洗涤切片2次。2、将切片浸泡于3% H2O2 (PBS稀释)内10分钟，以去除内源性过氧化物酶。然后用PBS洗涤切片3次。3、将切片浸泡于pH9. 0的0. IM EDTA缓冲液中，使用高压锅进行常规高压90秒， 进行抗原修复。待切片自然冷却至室温后，用去离子水洗涤切片2次，再用PBS洗涤切片2 次。4、将5%脱脂奶粉(PBS稀释)滴加于切片上，在37°C下温育1小时，进行抗原封闭。5、在切片上滴加适宜浓度的3B1抗体，4°C孵育过夜。然后用PBS洗涤切片3次。6、在切片上滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG的抗体工作液(DAK0 ENVISION +System HRP Mouse)，在 37°C下温育 1 小时。7、用PBS洗涤切片2次，将切片浸泡于在辣根过氧化物酶底物DAB的溶液中显色 20分钟。8、用PBS终止显色，用苏木精对切片进行复染。用盐酸酒精分化切片，梯度酒精脱水，二甲苯透明，然后将盖玻片盖在组织切片上，显微镜下观察。结果参见图7所示，显示胃癌或食管癌旁正常组织中不表达PES1，而胃癌或食管癌组织中有PESl的高表达。实施例9、Western-Blot检测胃癌和结肠癌远端正常组织、癌旁组织和癌组织中 PESl的表达本实施例中按照以下操作进行1)取胃癌和结肠癌远端正常组织、癌旁组织和癌组织块(来自北京肿瘤医院标本库)各250mg，于液氮冷冻条件下研磨成粉末状，加细胞裂解液RIPACTris (pH7. 4)， 150mM NaCl, 1% Triton X-100,1 % sodium deoxycholate，0· 1 % SDS)，充分溶解组织粉末， 12000rpm, IOmin离心取上清，即为相应组织裂解液。采用BCA方法对组织裂解液进行定量。 行12%的SDS-PAGE电泳，每孔蛋白上样量为50 μ g。2)至溴酚蓝达到胶的最下缘时停止，进行电转移。3)转膜结束后，丽春红染色，检测转膜效果以及做好标记。4) 5%脱脂奶粉封闭，4°C过夜。5)加一抗3B1抗体，浓度为1 μ g/ml，正鼠IgG为阴性对照，β -Actin抗体为组织蛋白内参标准，室温1小时。6)0. 1% Tween-20/PBS 洗涤 7 次。7)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG的抗体，室温温育40分钟。8)0. 1% Tween-20/PBS 洗涤 7 次，PBS 洗涤 1 次。9)发光显影。结果参见图8所示，胃癌和结肠癌癌组织中PESl的表达较相应远端正常组织和癌旁组织明显升高，其中18例胃癌配对组织中有14例癌组织中PESl高表达，有2例PESl在不同病变组织中表达无明显差异，有2例PESl在远端正常组织和癌旁组织较癌组织高表达 (图片A) ；14例结肠癌配对组织中有10例癌组织中PESl高表达，有4例PESl在不同病变组织中表达无明显差异(图片B)。
权利要求
1.一种PESl的单克隆抗体或者来源于该抗体的能够特异性结合PESl的生物活性片段，所述单克隆抗体由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为 CGMCC No. 3646或CGMCC No. 3647的杂交瘤细胞分泌。
2.分泌权利要求1所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其保藏号为CGMCCNo. 3646或 CGMCC No. 3647。
3.制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，该方法包括用融合蛋白GST-PESl免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对PESl有反应性、对谷胱苷肽巯基转移酶没有反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从注射杂交瘤细胞后的动物腹水中获取单克隆抗体。
4.一种检测PESl水平的试剂盒，其含有权利要求1所述的单克隆抗体或其活性片段； 优选所述的试剂盒还含有第二抗体和用于检测的酶或荧光或放射标记物，以及缓冲液；优选所述第二抗体为权利要求1所述的单克隆抗体或抗权利要求1所述单克隆抗体的抗抗体或抗PESl的多抗。
5.如权利要求4所述的试剂盒，该试剂盒用于检测组织细胞中PESl的表达水平，特别是对乳腺癌、胶质瘤、前列腺癌或胃癌肿瘤组织中PESl的检测，其包括权利要求1所述单克隆抗体或其活性片段，还包括用于检测权利要求1所述单克隆抗体或活性片段的抗抗体及酶或荧光标记物和相应的缓冲液；优选所述组织细胞为来自肿瘤组织的活检细胞或培养细胞或为已建系培养细胞。
6.权利要求1所述的单克隆抗体或其生物活性片段在制备用于检测样品中PESl水平的试剂或试剂盒中的应用，优选所述样品为受试个体的体液样品或细胞蛋白提取液；所述受试个体的体液样品优选来自乳腺癌组织、胶质瘤组织、前列腺癌组织或胃癌肿瘤组织。
7.权利要求1的单克隆抗体或其生物活性片段在制备用于辅助诊断肿瘤、监测肿瘤和 /或肿瘤患者预后判断的试剂或试剂盒中的应用；优选所述的肿瘤为乳腺癌、胶质瘤、前列腺癌或胃癌；优选所述的试剂或试剂盒用于免疫沉淀检测中。
8.权利要求7所述的应用，其中，所述试剂或试剂盒用于通过检测体液样品或细胞蛋白提取液中PESl的水平，来辅助对肿瘤的诊断和监测肿瘤的进程；优选权利要求1所述的单克隆抗体或其活性片段和检测其它肿瘤标志物的试剂联合用于辅助诊断肿瘤、监测肿瘤和/或肿瘤患者预后判断。
9.一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物含有权利要求1的单克隆抗体或其生物活性片段； 优选所述的肿瘤为乳腺癌、胶质瘤、前列腺癌或胃癌。
10.一种PESl水平的检测试剂，其含有权利要求1所述的单克隆抗体或其生物活性片段。
全文摘要
本发明涉及PES1的单克隆抗体或者来源于该抗体的能够特异性结合PES1的生物活性片段，所述单克隆抗体由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为CGMCC No.3646或CGMCC No.3647的杂交瘤细胞分泌。本发明的单克隆抗体具有较高的灵敏度和特异性，可识别内源性PES1蛋白并可用于各种免疫学检测；本发明还涉及分泌该抗体的杂交瘤细胞系，包含所述抗体或其生物活性片段的试剂盒、抗肿瘤药物和检测试剂，所述抗体或其生物活性片段在检测样品中PES1蛋白水平的应用，以及所述抗体在辅助诊断肿瘤、监测肿瘤和/或肿瘤患者预后判断中的应用。
文档编号C12R1/91GK102532317SQ20101061845
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者冯勤, 吴健, 寿成超, 苏亚辉 申请人:北京市肿瘤防治研究所