重组猪圆环病毒2型Cap抗原的制备方法

专利名称：重组猪圆环病毒2型Cap抗原的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组猪圆环病毒2型Cap抗原的制备方 法及其酵母表达的Cap抗原为基础制备的疫苗。
背景技术：
PCV2是近年来新发现的感染猪的最小病毒之一，临床上主要表现为消瘦、皮肤苍 白、生长缓慢、呼吸困难、皮炎腹泻、黄疸等，自20世纪90年代加拿大首次报道以来，此病已 在世界范围内广泛流行，给世界各国养猪业造成了巨大的损失，我国这个养猪大国也深受 其害。有研究证明，猪圆环病毒病与多种因素共同作用导致疾病。该病与其他病原共同入 侵机体时，有利于PCV2在靶细胞内复制增殖，从而引起免疫抑制。目前并没有治疗PCV2的 特效药，疫苗预防接种仍是防控PCV2的首选措施，亚单位疫苗安全、有效，国外已有免疫效 果良好的商品化亚单位疫苗，国内尚无亚单位疫苗注册上市，进口的亚单位疫苗价格相当
曰虫 印贝。圆环病毒2型对外界环境抵抗力较强，在酸性环境中及氯仿中可以存活较长时 间。基因组为单股环状DNA，全长为1，767bp或1，768bp，含11个开放性阅读框，其中ORFl、 0RF2、0RF3研究比较多，0RF2由702个碱基组成。其主要抗原由病毒DNA互补链转录，编 码含氨基酸234个，大小约27. 8ku的核衣壳蛋白(Cap蛋白)。PCV2 cap蛋白第65位 87 位，113位 139位和193位 207位氨基酸，为PCV2特异性抗原表位。PCV2 Cap蛋白作为主要保护性免疫蛋白，与PCVl Cap蛋白无交叉保护性，国内外 研究人员都以表达出Cap蛋白为研究热点。目前探索过各种表达方式，如大肠杆菌表达、杆 状病毒表达、重组腺病毒载体等，较为成功的例子有杆状病毒表达系统，重组杆状病毒在昆 虫细胞中表达出的Cap蛋白，分子量为30KD左右，在电镜下观察，发现和分离纯化得到的病 毒核衣壳蛋白一致，表明Cap蛋白在外源表达系统中自我组装成类病毒粒子，试验证明，免 疫动物后可诱导产生高水平特异性抗体和引发特异性免疫反应。国外已有商品化的亚单位 疫苗上市，能产生保护性免疫反应，显著降低病毒血症。国内部分高校和科研机构用于制备 猪圆环病毒2型亚单位疫苗的方法有构建重组腺病毒和重组杆状病毒表达Cap蛋白，前者 免疫效果有待验证，后者生产成本较高。酵母表达系统已是一个较为成熟的外源表达系统之一，其操作简单方便，成功率 高，既满足原核表达高密度生长、易培养的优点，又具备真核表达系统翻译后修饰的功能。 表达的蛋白产量高，可以存在于细胞内，也可以分泌至胞外。自身产生的蛋白极少，且不具 有毒性，近年来，已有大量生物制品在酵母表达系统里得到成功表达，并进行规模化发酵生 产，作为生产成本低，产出量高的外源表达系统，酵母表达系统非常具有优势。根据酵母密 码子偏嗜性改造目的基因，不断优化表达条件，有提高表达量的巨大空间。

发明内容
本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒2型亚单位抗原的制备方法。
本发明的另一目的是提供包括根据上述制备方法所得猪圆环病毒2型亚单位抗 原的疫苗。一种猪圆环病毒2型亚单位抗原的制备方法，是采用酵母表达系统制备。具体步骤如下
(1)扩增PCV2-0RF2 基因；
(2)构建表达工程菌扩增序列插入酵母表达载体，形成重组表达载体，线性化后转化 毕赤酵母宿主细胞，构建表达工程菌；
(3)重组酵母菌分泌表达。步骤(1)中所述PCV2-0RF2基因为PCV2-0RF2全基因或根据酵母密码子偏嗜性改 造的PCV2-0RF2基因。扩增PCV2-0RF2 基因的引物为 SEQ ID NO: IfPSEQ ID NO: 2。步骤(2)中所述酵母表达载体为pGAPZ α A、pGAPZ α B或pGAPZ α C。步骤(2)中所述毕赤酵母宿主细胞为酵母菌Χ33、SMD1168。一种猪圆环病毒亚单位疫苗，是包括上述制备方法所得抗原。疫苗中抗原有效成 分浓度为200 35(^g/mL。上述述疫苗的制备方法，是将所得抗原溶液与防腐剂、稳定剂、抗菌药混合，加入 佐剂，调节pH为7. 0 7. 5，即得到亚单位疫苗。其中防腐剂为制备疫苗常用防腐剂，如LL37抗菌肽、甲醛、苯酚、苯甲醇、乳酸链 球菌素、尼泊金类、硼砂等。稳定剂为乙二胺四乙酸二钠。抗菌药物包括如硫酸庆大霉素、
青链霉素等。上述佐剂为铝胶、卡伯波971、皂角甙、脂质体、CpG-ODN、纳米佐剂或油乳佐剂。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
采用酵母表达系统操作简单、表达量较高，生产成本低，可以进行大规模生产。构建重 组质粒后，通过电穿孔转化，利用Z抗性即可筛选出阳性转化子，提高kocin 抗性浓度，可 以筛选高拷贝量的转化子。实验操作获得重组酵母工程菌简单易行，成功率高，此表达系统 质粒转化时，是将质粒整合到酵母基因组，较为稳定，避免目的基因丢失，能够稳定的遗传。 酵母表达系统与昆虫细胞表达系统、哺乳细胞表达系统同样对表达的蛋白有加工折叠和翻 译后修饰的功能，从而使表达的蛋白具有生物活性，比起大肠杆菌更有优势，但比哺乳细胞 表达系统操作更简便。而与酿酒酵母相比，毕赤酵母不易过度糖基化。该病毒主要引起免 疫组织病变，是其他细菌、病毒入侵的门户，目前存在的猪圆环病毒灭活苗的安全性还有待 验证，昆虫细胞表达系统表达的PCV2-Cap已制备成商品化疫苗，且临床效果良好，由于生 产工艺复杂，生产成本的原因，导致其价格昂贵，难以推广。毕赤酵母表达系统可以采用基 础培养基发酵，仅提供酵母生长所需营养即可高密度发酵，细胞干重可达100g/l，同时酵母 细胞自身分泌的蛋白很少，分离纯化往往需要较为复杂的工艺，而酵母表达系统表达的蛋 白分离纯化只需分离上清、微滤、浓缩除盐3步即可。在优化后的培养条件下，表达量高，生 产成本低，有利于猪圆环病毒亚单位疫苗的推广使用。


图1 构建重组酵母工程菌的技术路线4图2 :PCV2-Cap表达的SDS-PAGE电泳图，M为预染蛋白分子量标准，1为未经浓缩 pGAPZ α A-0RF2-X33表达上清，2为pGAPZ α Α-Χ33空载体的表达上清；
图3 检测PCV2-Cap免疫原性的免疫印迹分析图。M为预染蛋白分子量标准，1-2为未 经浓缩pGAPZ α A-0RF2-X33表达上清，3为pGAPZ α Α-Χ33空载体的表达上清。
具体实施例方式下面实施例中使用的生物材料为Ze0CinTM抗性、表达载体pGAPZaA、/^Aia pas tor is 受体菌 X33、SMDl 168 购于 hvitrogen 公司 xrTap DNA 聚合酶、T4 DNA Ligase、 限制性内切酶炀ο I ,Not I ,Avr II为TaKafei公司产品疋.coli DH5 α由华南农业大学兽 医学院传染病实验室保存。质粒提取试剂盒、PCR纯化试剂盒、胶回收试剂盒购自PR0MEGA 公司。其余生化试剂购于鼎国生物有限公司。病毒来源为ELISA检测为血清学阳性的病猪 肺脏。实施例1
以质粒pGAPZ α A为酵母表达载体，以酵母菌Χ33为表达宿主菌，制备方法包括以下步
骤
1.从圆环病毒2型感染猪肺脏分离病毒，全基因组扩增得到目的基因0RF2。上游引物 为SEQ ID Ν0:1，下游引物为SEQ ID NO: 2，反应条件为94°C预变性5min，然后开始30个 循环，90°C 30S,50°C 40S，72°C 45S，最后 72°C延伸 lOmin。2.PCV2 0RF2基因与pMD18_T克隆载体的连接和转化，将pMD18_T载体0. 5μ 与步 骤1中扩增得到的目的基因0RF2 4. 5μ 及Solution I 5.0 PL轻轻混勻后，16°C连接过 夜，连接产物标记为PMD18-0RF2。连接产物5μ 转化制备的DH5 α感受态细胞150μ ，转化 的菌液均勻铺LB平板(氨苄青霉素=10(^g/mL)，次日挑取单菌落摇菌，送hvitrogen公司 测序，并抽提质粒，损ο /和Afoi /双酶切鉴定成功后，质粒保存于-20°C备用。3.将酵母表达载体pGAPZa A与pMD18-0RF2作损ο I^WNot /双酶切，经1%琼脂 糖凝胶电泳分离基因片段，胶回收表达载体和目的基因，再使用T4 DNA连接酶连接，构建重 组表达载体，标记为pGAPZ a A-0RF2,按步骤2中转化方式转化DH5 α感受态细胞，抽提重组 质粒，ZAo /和Afoi /双酶切鉴定成功后，重组质粒保存于_20°C备用。4.重组表达载体pGAPZ a A-0RF2转化宿主细胞毕赤酵母X33，构建重组表达工程 菌。将感受态A/^1Siori1S X33 (80 μ L)与 Jkt #单酶切 pGAPZ a A-0RF2 (10 μ g)相混合， 1.5 kV、200Q电击5 ms。将转化后的酵母细胞均勻平铺于新鲜制备YPDS平板(含kocin 抗性10(^g/mL)，待平板把液体吸收(约15min)，将平板倒置，于30°C温箱中培养至单菌落 出现(2天左右)。采用煮一冻一煮法制备菌液PCR模板分析A/^astoris转化子，上游引 物为SEQ ID N0:1，下游引物为SEQ ID N0:2能扩增出700 bp左右的单菌落为阳性转化子。 得到重组酵母工程菌pGAPZ a A-0RF2-X33。5. pGAPZ a A _0RF2_X33用YPDS培养液做分泌表达。挑取表面光滑、边缘整齐的白 色单菌落于4mL YPD培养液作为种子液，培养约1 菌液浑浊，吸取ImL重悬于50mLYPDS培 养基中(装量为10%)，220r/min, 30°C震荡培养。72h后5000r/minX IOmin离心收集培养上 清作SDS-PAGE或保存于_80°C备用。PCV2_Cap表达的SDS-PAGE电泳图见图2，在^KDa附 近有一条特异条带，而空载体没有，表明PCV2 0RF2基因已在酵母菌X33中成功分泌表达。检测PCV2-Cap免疫原性的免疫印迹分析图见图3，以PCV2感染猪血清作为一抗，辣根过氧 化物酶标记羊抗猪IgG作为二抗，经DAB-H2A显色后，在26KDa附近出现一条特异性条带， 空载体没有出现。表明PCV2 0RF2基因在酵母中表达的Cap蛋白具有一定的抗原性。pGAPZ α A载体以pGAP为组成型强启动子，在葡萄糖存在的情况下即可诱导酵母 进入蛋白表达状态，即在YPDS培养基中，酵母细胞生长，同时表达目的蛋白，不需要甲醇诱 导表达，甲醇是一种无色、透明、易燃、易挥发的有毒液体，在运输、保存过程中比较危险，表 达产物也难以避免甲醇污染。培养基碳源可分批一次性添加，也可以初始碳源适当降低，经 过6-10h左右流加碳源，流加碳源的优势在于提高酵母细胞的碳源利用率。高拷贝数不必 定能得到高表达量，单拷贝比2拷贝子和3拷贝子低，原因可能在于高拷贝子翻译效率亦 高，营养供应不足，对表达的蛋白加工折叠和翻译后修饰不能有序进行，选择合适的多拷贝 子也是提高表达量的重点。本实验可以选择磷酸盐缓冲液控制表达过程溶液PH值为6. 5。 尽可能的提高溶氧量，试验证明，表达量随着溶氧量增加而升高。表达时菌液初始OD值应 达到在1.5以上，一般在营养充足的情况下，菌液密度越高，表达量越高。先以YPD培养液 培养重组酵母菌至0D=2 6，吸取菌液重悬于YPDS培养液，使OD > 1. 5，或当达到0D=2 6时，5000r/min离心收集菌体，重悬于YPDS培养液，表达时间可为3 5天，培养过程中， 要保证充足的溶氧值(D0)，表达温度控制在28 V 30°C之间，高于30°C，不利于酵母细胞 生长。温度初期可控制在观 30°C，随着菌液浓度增加，适当降低培养温度，缓解酵母细胞 生长速度过快，以及蛋白水解酶活性过高，从而影响目的蛋白的产量。表达过程中要注意防 止过量泡沫产生，会影响DO值，收集表达上清时培养菌湿重可以达到40g/L，甚至100 g/L， 甚至150 g/L，甚至更高。表达的过程可调控，可优化，使表达量飙升有非常大的空间，这需 要在生产过程中不断的进行摸索。实施例2
以质粒pGAPZa A为酵母表达载体，以酵母菌SMDl 168为表达宿主菌，制备方法包 括以下步骤
1.从圆环病毒2型感染猪肺脏分离病毒，全基因组扩增得到目的基因0RF2。上游引 物为SEQ ID N0:1，下游引物为SEQ ID NO: 2，反应条件为94°C预变性5min，然后开始30 个循环，90°C 30S，50°C 40S，72°C 45S，最后72°C延伸lOmin。根据酵母密码子偏嗜性改造 0RF2基因，送生工生物工程(上海)有限公司全基因合成得到目的基因。重组质粒标记为 pBluescript II SK+-0RF2。目的基因序列如 SEQ ID NO:3 所示，共 734bp。2. pBluescript II SK+-0RF2 质粒 2μ 转化制备的 DH5 α 感受态细胞 150μ ，转 化的菌液均勻铺LB平板(氨苄青霉素=10(^g/mL)，次日挑取单菌落摇菌，抽提质粒，Xho I 和/双酶切鉴定成功后，将质粒保存于-20°C备用。3.如实施例1步骤3所述将酵母表达载体pGAPZ α A与含目的基因的重组质 粒pBluescript II SK+-0RF2作炀ο /和Λ^ /双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳分离基 因片段，胶回收表达载体和目的基因，再使用Τ4 DNA连接酶连接，构建重组表达载体 pGAPZa A-0RF2。pGAPZ a A-0RF2转化DH5 α感受态细胞，抽提重组质粒，损ο /和Λ^ /双 酶切鉴定成功后，重组质粒保存于-20 V备用。4.重组表达载体pGAPZa A-0RF2转化宿主细胞毕赤酵母SMDl 168，构建重组表达 工程菌。将感受态A/^1Siori1S SMDl 168 (80 μ L)与 Jkt #单酶切 pGAPZ a A-0RF2 (10 μ g)相混合，1.5 kV、200Q电击5 ms。将转化后的酵母细胞均勻平铺于新鲜制备YPDS平板(含 kocin 抗性lOOPg/mL)，待平板把液体吸收，将平板倒置，于30°C温箱中培养至单菌落出 现(2天左右)。采用煮一冻一煮法制备菌液PCR模板分析A/^astoris转化子，上游引物 为SEQ ID NO: 1，下游引物为SEQ ID N0:2能扩增出700 bp左右的单菌落为阳性转化子。 得到重组酵母工程菌pGAPZ α A-0RF2-SMD1168。5.pGAPZaA-0RF2_SMD1168用YPDS培养液做分泌表达。挑取表面光滑、边缘 整齐的白色单菌落于4mLYPD培养液作为种子液，培养约24h菌液浑浊，吸取ImL重悬于 50mLYPDS 培养基中(装量为 10%)，220r/min, 30°C振荡培养。72h 后 5000r/min 离心 lOmin， 收集培养上清作SDS-PAGE或保存于-80°C备用。pGAPZ a A载体以pGAP为强启动子，在培养基中加入葡萄糖即可诱导酵母进入蛋 白表达状态，在YPDS培养基中，酵母细胞生长，同时表达目的蛋白，培养基碳源可分批一次 性添加，也可以初始碳源适当降低，经过1 左右流加碳源，流加碳源的优势在于提高酵母 细胞的碳源利用率。温度控制在^ 30°C，SMD1168生长速度较为缓慢，但也有优势，不 至于使菌繁殖过快，缺陷蛋白酶，降低分泌的蛋白降解率，从而提高目的蛋白的表达量。表 达时菌液密度应达到OD值在1. 5以上，一定范围内在营养充足的情况下，菌液密度越高，表 达量越高。先以YPD培养液培养重组酵母菌至0D=2 6，吸取菌液重悬于YPDS培养液，使 OD彡1. 5，或当达到0D=2 6时，5000r/min离心收集菌体，重悬于YPDS培养液，表达时间 可为3 5天，但培养过程中，要保证充足的溶氧值(D0)，表达pH为6. 0,6. 5更优，7. 0更 优，不可超过8. 0。表达过程中要注意防止培养液产生过量泡沫影响DO值，培养菌液浓度可 以达到40g/L，甚至100g/L，甚至150g/L，甚至更高。在表达时，培养液应调控在需要范围内，并加入磷酸缓冲液，保持pH的稳定，有利 于目的蛋白的稳定存在，并且远离Cap蛋白的等电点pl，本实验中，不可低于pH6.0。适量 添加蛋白酶抑制剂和蛋白酶底物也是可取的，如EDTA、氨基酸、蛋白胨等，以不影响酵母细 胞生长增殖为原则。同时要考虑酵母细胞在培养液中的渗透压。分离和纯化
表达完成分离上清后，上清存于-80°C待用，或不经浓缩直接进行SDS-PAGE检测目 的蛋白表达分析，以空载体表达做对照，杂蛋白极少，清晰可见目的蛋白条带时，可进行纯 化蛋白用于制备亚单位疫苗。纯化方法较多，少量纯化Cap蛋白，可以将酵母连同上清 5，000r/min离心10分钟，上清用分子量10，000透析袋在pH7. 4灭菌PBS缓冲液中透析直 至平衡，期间换5 7次缓冲液，有条件可以使用机械搅拌，加快透析速度。再以PEG8000 浓缩透析产物，将透析产物保留在透析袋内置于PEG8000粉末中，直到浓缩量达到要求。大 量分离纯化，建议采取离心收集上清-陶瓷膜微滤-纳滤膜去盐浓缩纯化，也可以选择膜过 滤分离上清，上清进行超滤浓缩，再纳滤除盐。本实验在生物反应器中表达，培养上清透析 后用Bradford法A595nm处测定总蛋白浓度，计算所表达的蛋白可高达0. 08 lg/L，凝胶 薄层扫描仪扫描，重组蛋白占总蛋白40% 80%，蛋白表达量及其依赖于菌种保存情况和表 达条件的控制，当菌体污染或活力降低时，可能分泌较多杂蛋白，而目的蛋白分泌较少或降 解，故从构建筛选阳性转化子到分泌表达目的蛋白的整个过程应严格控制无菌，否则直接 严重影响表达量，甚至不表达。由于不受污染的理想情况下表达，杂蛋白极少，所以本发明 下游加工至多需3步，能保持蛋白活性，简单易行，表达量高，生产成本较低，使普遍应用已验证其有效性的亚单位疫苗成为可能。实施例3.亚单位疫苗的制备
将防腐剂、保护液、稳定剂、抗菌药等一种或几种成分与分离纯化的Cap蛋白混合，加 入佐剂同生理盐水或PBS混合，将混合物pH值调至生理值，即pH7. 0 7. 5，组成猪圆环病 毒亚单位疫苗。佐剂可以选用铝胶、卡伯波971、皂角甙、脂质体、CpG-ODN、纳米佐剂、油乳 佐剂等，可选择加入细胞因子如干扰素、白细胞介素等，其中Cap蛋白的有效成分浓度应达 200-35(^g/mL，每剂量 200_350μβ。试验结果将本发明实施例1制备的Cap蛋白按照本文所述少量分离纯化蛋白方 法纯化后，测量Cap蛋白浓度，用生理盐水稀释为100(^g/mL作为抗原。此亚单位疫苗有 效抗原量为20(^g/mL，LL37抗菌肽终含量为100U/mL，加入铝胶原液含量为约20%，按照兽 用生物制品规程要求进行成品疫苗的检验，用合格制品进行临床试验。选取表现健康的25 日龄断奶仔猪20头，25日龄时称重，各组仔猪体重差异不显著，随机分成4组，血清学检测 PCV2为阴性的仔猪有10头。初次免疫后14天加强免疫，经2周，使用猪圆环病毒2型强毒 株病毒液(104TCID5(1/mL) 2mL对A、B、C、D组滴鼻攻毒。按照以下表1进行免疫试验
表权利要求
1.一种重组猪圆环病毒2型Cap抗原的制备方法，是采用酵母表达系统，制备步骤如下(1)扩增PCV2-0RF2 基因；(2)构建表达工程菌扩增序列插入酵母表达载体，形成重组表达载体，线性化后转化 毕赤酵母宿主细胞，构建表达工程菌；(3)重组酵母菌分泌表达，得到重组猪圆环病毒2型Cap抗原蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述PCV2-0RF2基因为 PCV2-0RF2全基因或根据酵母密码子偏嗜性改造的PCV2-0RF2基因。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于扩增PCV2-0RF2基因的引物核苷 酸序列为 SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID NO:2。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述酵母表达载体为 pGAPZ α A、pGAPZ α B 或 pGAPZ α C。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述毕赤酵母宿主细胞为 酵母菌Χ33或酵母菌SMDl 168。
6.一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗，其特征在于包括权利要求1所述制备方法获得的 抗原。
7.权利要求6所述疫苗的制备方法，是将所得抗原溶液与防腐剂、稳定剂、抗菌药混 合，加入佐剂，调节ρΗ为7. 0 7. 5，即得到亚单位疫苗。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于抗原有效成分浓度为200 350μβ/mLo
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于所述防腐剂为LL37抗菌肽、甲 醛、苯酚、苯甲醇、乳酸链球菌素、尼泊金类或硼砂；所述稳定剂为乙二胺四乙酸二钠；所 述抗菌药物为硫酸庆大霉素或青链霉素；所述佐剂为铝胶、卡伯波971、皂角甙、脂质体、 CpG-ODN,纳米佐剂或油乳佐剂。
全文摘要
本发明公开了一种重组猪圆环病毒2型Cap抗原的制备方法，是采用酵母表达系统，先扩增PCV2-ORF2基因，然后构建表达工程菌，即将扩增序列插入酵母表达载体，形成重组表达载体，线性化后转化毕赤酵母宿主细胞，构建表达工程菌，最后重组酵母菌分泌表达，得到重组猪圆环病毒2型Cap抗原蛋白。酵母表达系统对表达的蛋白有加工折叠和翻译后修饰的功能，从而使表达的蛋白具有生物活性，比起大肠杆菌更有优势，但比哺乳动物细胞表达系统操作更简便。而与酿酒酵母相比，毕赤酵母不易过度糖基化，因此分离纯化步骤简单。采用酵母表达系统操作简单、表达量较高，生产成本低，可以进行大规模生产，有利于猪圆环病毒亚单位疫苗的推广使用。
文档编号C12N15/33GK102127533SQ20101061822
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者刘娜, 刘德辉, 吴锋, 黄毓茂 申请人:华南农业大学