抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法

专利名称：抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法
技术领域：
本发明涉及单克隆抗体，特别涉及一种抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法。
背景技术：
神经菌毛素1 (NeuropiIin-I，简称NRP1)是细胞表面的I型跨膜糖蛋白， 其相对分子质量为130KDa，由位于染色体10pl2的基因编码。NRPl基因的开放阅读框由17个外显子禾口 16 个内含子组成(1、Rossignol M, Gagnon ML, Klagsbrun Μ. Genomic organization of human neuropilin-1 and neuropilin-2 genes identification and distribution of splice variants and soluble isoforms [J] · Genomics，2000，70 :211-222.)。NRP1 在脊椎动物中高度保守，由胞内区、跨膜区和胞外区三部分组成，其中胞外段包括860个氨基酸， 由3个不同的结构域组成，分别称为ala2结构域、blb2结构域和c结构域。ala2结构域位于第27个到第264个氨基酸，又称为CUB结构域(Clr/Cls，uEGF，and bone morphogenetic protein), blb2结构域位于第274个到第583个氨基酸，其与凝血因子V和VIII的结构相似且同源，c结构域位于第650个到803个氨基酸，其中部含有MAM结构域(m印rin，A5，and m-phosphatase)。NRPl胞外段的3个结构域能与不同的分子结合，介导不同的信号传导。 神经生长抑制因子3A (Sema3A)通过ala2结构域与NRPl结合，血管生长因子165 (Vascular endothelial growth factor, VEGF165)能与 NRPl 的 blb2 结构域结合，肝素亦通过 blb2 结构域与NRPl结合。NRPl基因缺陷的小鼠在胚胎期就死于严重的神经及心血管系统异常 (2、Narazaki M, Tosato G. Ligand-induced internalization selects use of common receptor neuropilin-1 by VEGF165 and semaphorin3A[J] · Blood, 2006,107 :3892_3901)。 NRPl的跨膜区包括20个氨基酸，胞内区只有40个氨基酸。去除了胞内区的NRPl仍然能与共受体神经丛素2Al(pleXinS2Al)结合，但是不能够介导信号传导，提示NRPl的C端在保护Sema3A受体功能完整上不可或缺的作用(3、Giordano S，Corso S，Conrotto P，et al. The semaphorin 4D receptor controls invasive growth by coupling with Met[J]· N at Cell B iol，2002，10 :720_724.)。体外试验亦显示NRPl在细胞间的黏附、相互作用上起着重要的作用(4、Takagi S, Kasuya Y, Shimizu M, et al. Expression of a cell adhesion molecule, neuropilin, in the developing chick nervous system[J]. Dev B iol, 1995，170 :207_222)。NRPl最早是作为神经细胞导向调节因子的受体而发现，而近年来的大量研究结果显示表达于内皮细胞，可作为VEGF165及与血管新生相关的其它几种血管生长因子(VEGF) 家族成员的受体，从而在血管新生方面发挥重要调节作用。通过用抗VEGF抗体筛选突变的噬菌体文库得到一段7个氨基酸的多肽ATWLPPR，它能够抑制VEGF165与NRPl的结合，但不抑制VEGF165与VEGFR-2的结合，结果发现肿瘤血管的发生和肿瘤生长受到抑制，说明NRPl 在VEGF165调节肿瘤血管的发生和生长过程中，是一个非常重要的受体，因此为肿瘤的药物和基因靶向治疗提供了一个潜在的特异性较高的靶点，它可与其它抗肿瘤药物、毒素、放射性核素等交联，用于肿瘤血管靶向治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法。所述抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法包括以下步骤1)克隆人神经菌毛素1的blb2结构域(人神经菌毛素1的blb2结构域简称为 NRPl/blb2)基因序列，将其导入载体，构建重组载体，并将重组载体转化到宿主细菌中进行发酵培养，分离纯化发酵液，即得NRPl/blb2蛋白；2)用NRPl/blb2蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞融合；3)筛选融合后的细胞，获得可分泌抗人神经菌毛素1单克隆抗体的杂交瘤细胞， 即得抗人神经菌毛素1单克隆抗体。在步骤1)中，所述blb2结构域基因序列为ccatgggcaa atgtatggaa gctctgggca tggaatcagg agaaattcat tctgaccaga 60tcacagcttc ttcccagtat agcaccaact ggtctgcaga gcgctcccgc ctgaactacc 120ctgagaatgg gtggactccc ggagaggatt cctaccgaga gtggatacag gtagacttgg 180gccttctgcg ctttgtcacg gctgtcggga cacagggcgc catttcaaaa gaaaccaaga 240agaaatatta tgtcaagact tacaagatcg acgttagctc caacggggaa gactggatca 300ccataaaaga aggaaacaaa cctgttctct ttcagggaaa caccaacccc acagatgttg 360tggttgcagt attccccaaa ccactgataa ctcgatttgt ccgaatcaag cctgcaactt 420gggaaactgg catatctatg agatttgaag tatacggttg caagataaca gattatcctt 480gctctggaat gttgggtatg gtgtctggac ttatttctga ctcccagatc acatcatcca 540accaagggga cagaaactgg atgcctgaaa acatccgcct ggtaaccagt cgctctggct 600gggcacttcc acccgcacct cattcctaca tcaatgagtg gctccaaata gacctggggg 660aggagaagat cgtgaggggc atcatcattc agggtgggaa gcaccgagag aacaaggtgt 720tcatgaggaa gttcaagatc gggtacagca acaacggctc ggactggaag atgatcatgg 780atgacagcaa acgcaaggcg aagtcttttg agggcaacaa caactatgat acacctgagc 840tgcggacttt tccagctctc tccacgcgat tcatcaggat ctaccccgag agagccactc 900atggcggact ggggctcaga atggagctgc tgggctgtct cgag944所述载体可为pET22b(+)，所述宿主细菌可为大肠杆菌BL21，所述分离纯化可采用镍柱纯化；所述NRPl/blb2蛋白的氨基酸序列为Lys Cys Met Glu Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu lie His Ser Asp151015Gln lie Thr Ala Ser Ser Gln Tyr Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu Arg202530Ser Arg Leu Asn Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Asp Ser354045Tyr Arg Glu Trp lie Gln Val Asp Leu Gly Leu Leu Arg Phe Val Thr505560
Ala Val Gly Thr Gln GlyAla lie Ser Lys Glu Thr Lys Lys Lys Tyr6570 7580Tyr Val Lys Thr Tyr Lyslie Asp Val Ser Ser Asn Gly Glu Asp Trp859095lie Thr lie Lys Glu GlyAsn Lys Pro Val Leu Phe Gln Gly Asn Thr100105110Asn Pro Thr Asp Val ValVal Ala Val Phe Pro Lys Pro Leu lie Thr115120125Arg Phe Val Arg lie LysPro Ala Thr Trp Glu Thr Gly lie Ser Met130135140Arg Phe Glu Val Tyr GlyCys Lys lie Thr Asp Tyr Pro Cys Ser Gly145150 155160Met Leu Gly Met Val SerGly Leu lie Ser Asp Ser Gln lie Thr Ser165170175Ser Asn Gln Gly Asp Arg Asn Trp Met Pro Glu Asn lie Arg Leu Val180185190Thr Ser Arg Ser Gly TrpAla Leu Pro Pro Ala Pro His Ser Tyr lie195200205Asn Glu Trp Leu Gln lieAsp Leu Gly Glu Glu Lys lie Val Arg Gly210215220lie lie lie Gln Gly GlyLys His Arg Glu Asn Lys Val Phe Met Arg225230 235240Lys Phe Lys lie Gly TyrSer Asn Asn Gly Ser Asp Trp Lys Met lie245250255Met Asp Asp Ser Lys Arg Lys Ala Lys Ser Phe Glu Gly Asn Asn Asn260265270Tyr Asp Thr Pro Glu LeuArg Thr Phe Pro Ala Leu Ser Thr Arg Phe275280285lie Arg lie Tyr Pro GluArg Ala Thr His Gly Gly Leu Gly Leu Arg290295300Met Glu Leu Leu Gly Cys305310在步骤2)中，所述免疫BALB/c小鼠的具体方法如下将NRPl/blb2蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，制成油包水抗原乳剂，再将油包水抗原乳剂注射到雌性BALB/c小鼠腹腔进行免疫，14天后再用油包水抗原乳剂腹腔注射，共加强免疫3次。本发明采用RT-PCR技术，获得了 NRPl/blb2的基因序列，并构建了原核表达载体 pET22b(+)-NRPl/blb2，进行NRPl/blb2蛋白表达、纯化、复性。以NRPl/blb2蛋白作为免疫原，通过细胞融合技术，制备得到灵敏性高、特异性强的鼠源性抗人NRPl单克隆抗体。


图1为NRPl/blb2基 因RT-PCR产物的电泳图。在图1中，1为NRPl/blb2基因， M 为分子量标记物，1500bp、IOOObp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp
为分子量大小。图2为重组质粒pET22b(+)_NRPl/blb2诱导表达产物的电泳图。在图2中，1 3为经IPTG诱导后的重组质粒pET22b(+)-NRPl/blb2的表达情况，4为未经IPTG诱导的重组质粒pET22b(+)-NRPl/blb2的表达情况，M为蛋白分子量标记物，94. 0KDa、66. 2KDa、 66. 2KDa、45. 0KDa、33. 0KDa、26. 0KDa、20. 0KDa、14. 4KDa 为蛋白分子量大小。图3为纯化后的NRPl/blb2蛋白的电泳图。在图3中，1为经镍柱纯化后的NRPl/ blb2蛋白，2为经高效液相色谱纯化后的NRPl/blb2蛋白，M为蛋白分子量标记物，94. OKDa, 66. 2KDa、66. 2KDa、45. 0KDa、33. 0KDa、26. 0KDa、20. 0KDa、14. 4KDa 为蛋白分子量大小。图4为亲和层析法纯化后的NRPl/blb2抗体的电泳图。在图4中，1 2为亲和层析法纯化后的NRPl/blb2抗体，M为蛋白分子量标记物，116. OKDa,66. 2KDa、45. OKDa, 35. OKDa,25. OKDa为蛋白分子量大小。图5为NRPl/blb2抗体的效价测定图。在图5中，横坐标为滴度，纵坐标为吸光值 OD490, 为腹水，■为纯化后的NRPl/blb2抗体。图6为免疫印记检测NRPl/blb2抗体特异性的电泳图。在图6中，1为BGC-823人类胃癌细胞，2为Anip 973人类肺腺癌细胞，M为蛋白分子量标记物，170KDa、130KDa、100KDa、 70KDa、55KDa、40KDa、35KDa、25KDa、15KDa 为蛋白分子量大小。
具体实施例方式实施例lNRPl/blb2基因的克隆及其蛋白的表达、纯化与复性通过RT-PCR (RT-PCR试剂盒购自东洋纺生物科技有限公司Τ0Υ0Β0)从人类胃癌细胞株BGC-823中获取人神经菌毛素1的blb2结构域(简称NRPl/blb2)基因序列，NRPl/ blb2基因序列为ccatgggcaa atgtatggaa gctctgggca tggaatcagg agaaattcat tctgaccaga60tcacagcttc ttcccagtat agcaccaact ggtctgcaga gcgctcccgc ctgaactacc120ctgagaatgg gtggactccc ggagaggatt cctaccgaga gtggatacag gtagacttgg180gccttctgcg ctttgtcacg gctgtcggga cacagggcgc catttcaaaa gaaaccaaga240agaaatatta tgtcaagact tacaagatcg acgttagctc caacggggaa gactggatca300ccataaaaga aggaaacaaa cctgttctct ttcagggaaa caccaacccc acagatgttg360tggttgcagt attccccaaa ccactgataa ctcgatttgt ccgaatcaag cctgcaactt420gggaaactgg catatctatg agatttgaag tatacggttg caagataaca gattatcctt480gctctggaat gttgggtatg gtgtctggac ttatttctga ctcccagatc acatcatcca540accaagggga cagaaactgg atgcctgaaa acatccgcct ggtaaccagt cgctctggct600gggcacttcc acccgcacct cattcctaca tcaatgagtg gctccaaata gacctggggg660aggagaagat cgtgaggggc atcatcattc agggtgggaa gcaccgagag aacaaggtgt720tcatgaggaa gttcaagatc gggtacagca acaacggctc ggactggaag atgatcatgg780atgacagcaa acgcaaggcg aagtcttttg agggcaacaa caactatgat acacctgagc840
tgcggacttt tccagctctc tccacgcgat tcatcaggat ctaccccgag agagccactc 900atggcggact ggggctcaga atggagctgc tgggctgtct cgag944RT-PCR上行引物序列为TACCATGGGCAAATGTATGGAAGCTC ；下行引物序列为 TACTCGAGACAGCCCAGCAGCTCCAT。凝胶电泳结果显示，RT-PCR产物中有1条明显的条带(参见图1)，条带大小约为 950bp，与预期的NRPl/blb2基因序列相符，证明RT-PCR产物为NRPl/blb2基因。使用限制性内切酶Nco I和Xho I对NRPl/blb2基因和质粒载体pET22b(+)(购买自Novagen)进行酶切，用T4连接酶将酶切后的NRPl/blb2基因连接到质粒载体pET22b (+) 载体上，获得重组质粒载体pET22b (+) _NRPl/blb2，其表达的重组NRPl/blb2蛋白氨基酸序列为Lys Cys Met Glu Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu lie His Ser Asp151015Gln lie Thr Ala Ser Ser Gln Tyr Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu Arg202530 Ser Arg Leu Asn Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Asp Ser3540 45Tyr Arg Glu Trp lie Gln Val Asp Leu Gly Leu Leu Arg Phe Val Thr5055 60Ala Val Gly Thr Gln Gly Ala lie Ser Lys Glu Thr Lys Lys Lys Tyr6570 7580Tyr Val Lys Thr Tyr Lys lie Asp Val Ser Ser Asn Gly Glu Asp Trp859095lie Thr lie Lys Glu Gly Asn Lys Pro Val Leu Phe Gln Gly Asn Thr100105110Asn Pro Thr Asp Val Val Val Ala Val Phe Pro Lys Pro Leu lie Thr115120 125Arg Phe Val Arg lie Lys Pro Ala Thr Trp Glu Thr Gly lie Ser Met130135 140Arg Phe Glu Val Tyr Gly Cys Lys lie Thr Asp Tyr Pro Cys Ser Gly145150 155160Met Leu Gly Met Val Ser Gly Leu lie Ser Asp Ser Gln lie Thr Ser165170175Ser Asn Gln Gly Asp Arg Asn Trp Met Pro Glu Asn lie Arg Leu Val180185190Thr Ser Arg Ser Gly Trp Ala Leu Pro Pro Ala Pro His Ser Tyr lie195200 205Asn Glu Trp Leu Gln lie Asp Leu Gly Glu Glu Lys lie Val Arg Gly210215 220lie lie lie Gln Gly Gly Lys His Arg Glu Asn Lys Val Phe Met Arg
225230235240Lys Phe Lys lie Gly Tyr Ser Asn Asn Gly Ser Asp Trp Lys Met lie245250255Met Asp Asp Ser Lys Arg Lys Ala Lys Ser Phe Glu Gly Asn Asn Asn260265270Tyr Asp Thr Pro Glu Leu Arg Thr Phe Pro Ala Leu Ser Thr Arg Phe275280285lie Arg lie Tyr Pro Glu Arg Ala Thr His Gly Gly Leu Gly Leu Arg290295300Met Glu Leu Leu Gly Cys305310将重组质粒载体pET22b(+)-NRPl/blb2转化到大肠杆菌BL21，并将大肠杆菌BL21 置于37°C培养箱培养过夜，以体积比1 100的比例，接种于含新鲜的氨苄西林的LB培养基中扩大培养，37°C振荡培养至菌液0D_为0. 6 0. 8，加入IPTG诱导表达4h ；收集菌体并裂解，取上清液，加入到已预装好的镍柱(购买自GE Healthcare)中，用pH为5. 8的 8mol/L尿素缓冲液洗去非特异结合的蛋白，再用pH为2. 8的8mol/L尿素洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，并将洗脱的蛋白上样至高效液相色谱仪(购买自Varian)，使用Dior柱(购自 GL Science)，以8mol/L尿素洗脱缓冲液为流动相，收集目的蛋白峰，将收集蛋白注入透析袋中，置于梯度尿素(4mOl/L、2mOl/L、lmOl/L、0mOl/L)的透析液中，每8h更换一个梯度，待梯度透析复性结束后，将复性蛋白分装保存在-80°C冰箱。SDS-PAGE电泳结果显示，经IPTG诱导后，重组质粒pET22b (+) _NRPl/blb2表达的蛋白中有明显的条带(参见图2)，蛋白分子量(39KDa)大小与预期的相符。提示IPTG诱导表达的蛋白是NRPl/blb2蛋白。NRPl/blb2经镍柱和高效液相色谱纯化后的纯度及表达量参见图3。实施例2NRP1单克隆抗体杂交瘤细胞的筛选l)SP2/0细胞的处理复苏冻存的SP2/0细胞，待状态稳定后，继续培养，待细胞长至将70% 80%融合时，收集细胞，用无血清的DMEM培养基悬浮，备用。2)免疫方案将纯化复性的NRPl/blb2蛋白作为抗原，与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，制成油包水抗原乳剂。再将油包水抗原乳剂于雌性BALB/c小鼠腹腔注射，50 μ g/只；14天后再用该抗原加等体积弗氏不完全佐剂腹腔注射，50 μ g/只；共加强免疫3次。 剪鼠尾取血，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清抗体效价，滴度较高者备用；在取小鼠脾脏前3天，尾静脉注射抗原水溶液25 μ g/只。3)细胞融合尾静脉注射抗原水溶液免疫后第3天，无菌取小鼠脾脏并制备脾细胞悬液；将SP2/0骨髓瘤细胞[(1 2) X IO7个细胞]和免疫的小鼠脾细胞(1 X IO8个细胞)充分混合，离心，尽量吸尽上清并置于40°C水浴中预热；加入预热至40°C的ImL 50% PEG(购自Sigma)助融；融合90s后，缓慢加入无血清的DMEM培养基，离心，用含20%胎牛血清的HAT DMEM培养基(购自Sigma)重悬，将重悬后的悬液直接接种在96孔板上；37°C CO2 培养才苜中培养ο
4)克隆转移 和检测每天仔细观察步骤3)融合后的细胞，挑出单克隆，做好标记， 待单克隆孔的细胞长至覆盖至2/3孔时用ELISA筛选，选取滴度较高的单克隆孔，重复克隆筛选3次，将阳性克隆细胞移入含有HT培养液的24孔中，用移液器吹打分散均勻。选择抗体滴度高的单克隆抗体进行扩增、冻存或制备腹水型抗体。5)腹水型抗体的制备使用液体石蜡对BALB/c小鼠进行预处理。10天后，收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，用无血清DMEM培养基调整至2. 5 X IO6个细胞/mL，给予小鼠腹腔注射。7 10天后，待小鼠腹部明显膨大收集腹水。腹水在4°C，2500r/min离心lOmin， 取上清液_20°C冻存备用。实施例3抗人神经菌毛素1单克隆抗体的纯化采用亲和层析法纯化抗人神经菌毛素1单克隆抗体。根据GE Healthcare公司提供的操作说明，将收集的腹水加入到已预装好的蛋白A柱中，用pH为8. O的缓冲液A洗去非特异结合的蛋白，再用PH为3. O的缓冲液B洗脱目的抗体，收集目的抗体并加入5 %体积的Tris-HCl缓冲液调整pH值，分装保存于_20°C冰箱。抗体纯度较高，无其他杂蛋白条带出现(参见图4)。实施例4抗人神经菌毛素1单克隆抗体稀释度的检测用间接ELISA法检测诱生腹水抗体及纯化后抗体的免疫学效价。用紫外线照射处理酶标板30min，加10 μ g/ml抗原溶液4°C包被过夜，用含5%脱脂奶粉的磷酸缓冲液于 37°C封闭2h，PBST (于常规磷酸缓冲液中加入吐温20即得，磷酸缓冲液与吐温20的体积比为1000 1，)冲洗3遍。每个包被孔加稀释腹水或纯化抗体ΙΟΟμ 1，37°C孵育2h，PBST 冲洗3遍，加1 10000的酶标二抗，37°C孵育lh，最后加底物-1，2-二氨基苯(OPD)、底物_双氧水(H2O2)室温显色lOmin，以PBS为阴性对照。随着抗体浓度的下降，在490nm波长处的吸光值OD49tl逐渐降低，表明腹水抗体及纯化后抗体均能与包被在板上的蛋白进行特异性结合，诱生腹水法获得的抗体效价在1 X 10_6 5 X 10_6之间，纯化后的抗体效价未提升但纯度提高(参见图5)。实施例5抗人神经菌毛素1单克隆抗体特异性检测免疫印迹(Western Blot)使用BGC-823人类胃癌细胞，同时用Anip 973人类肺腺癌细胞作对照。收获培养好的细胞、裂解并进行SDS-PAGE电泳。以90V电压转膜lh，用 1 1000稀释的纯化后抗人神经菌毛素1单克隆抗体分别检测细胞中NRPl的表达情况。结果显示，抗人神经菌毛素1单克隆抗体能够检测到BGC-823中的NRPl的表达，且条带位置与预期相符，而Anip 973却未见条带，提示抗人神经菌毛素1单克隆抗体是特异性的(参见图6)。
权利要求
1.抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)克隆人神经菌毛素1的bll32结构域基因序列，将其导入载体，构建重组载体，并将重组载体转化到宿主细菌中进行发酵培养，分离纯化发酵液，即得NRPl/blM蛋白；2)用NRPl/blM蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合；3)筛选融合后的细胞，获得可分泌抗人神经菌毛素1单克隆抗体的杂交瘤细胞，即得抗人神经菌毛素1单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法，其特征在于在步骤 1)中，所述bll32结构域基因序列为ccatgggcaaatgtatggaagctctgggcatggaatcaggagaaattcattctgaccaga60tcacagcttcttcccagtatagcaccaactggtctgcagagcgctcccgcctgaactacc120ctgagaatgggtggactcccggagaggattcctaccgagagtggatacaggtagacttgg180gccttctgcgctttgtcacggctgtcgggacacagggcgccatttcaaaagaaaccaaga240agaaatattatgtcaagacttacaagatcgacgttagctccaacggggaagactggatca300ccataaaagaaggaaacaaacctgttctctttcagggaaacaccaaccccacagatgttg360tggttgcagtattccccaaaccactgataactcgatttgtccgaatcaagcctgcaactt420gggaaactggcatatctatgagatttgaagtatacggttgcaagataacagattatcctt480gctctggaatgttgggtatggtgtctggacttatttctgactcccagatcacatcatcca540accaaggggacagaaactggatgcctgaaaacatccgcctggtaaccagtcgctctggct600gggcacttccacccgcacctcattcctacatcaatgagtggctccaaatagacctggggg660aggagaagatcgtgaggggcatcatcattcagggtgggaagcaccgagagaacaaggtgt720tcatgaggaagttcaagatcgggtacagcaacaacggctcggactggaagatgatcatgg780atgacagcaaacgcaaggcgaagtcttttgagggcaacaacaactatgatacacctgagc840tgcggacttttccagctctctccacgcgattcatcaggatctaccccgagagagccactc900atggcggactggggctcagaatggagctgctgggctgtctcgag944 ο
3.如权利要求1所述的抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法，其特征在于在步骤 1)中，所述载体为pET22b(+)。
4.如权利要求1所述的抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法，其特征在于在步骤 1)中，所述宿主细菌为大肠杆菌BL21。
5.如权利要求1所述的抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法，其特征在于在步骤 1)中，所述分离纯化采用镍柱纯化。
6.如权利要求1所述的抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法，其特征在于在步骤 1)中，所述NRPl/blM蛋白的氨基酸序列为Lys Cys Met Glu Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu lie His Ser Asp 151015Gln lie Thr Ala Ser Ser Gln Tyr Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu Arg202530Ser Arg Leu Asn Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Asp Ser 354045
7.如权利要求1所述的抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法，其特征在于在步骤 2)中，所述免疫BALB/c小鼠的具体方法为将NRPl/blM蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，制成油包水抗原乳剂，再将油包水抗原乳剂注射到雌性BALB/c小鼠腹腔进行免疫，14天后再用油包水抗原乳剂腹腔注射，共加强免疫3次。
全文摘要
抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法。涉及单克隆抗体，提供抗人神经菌毛素1单克隆抗体的制备方法。包括克隆人神经菌毛素1的b1b2结构域基因序列，并将其导入载体，构建重组载体，并将其转化到宿主细菌中进行发酵培养，分离纯化发酵液即得NRP1/b1b2蛋白；用NRP1/b1b2蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合；筛选融合后的细胞，获得可分泌抗人神经菌毛素1单克隆抗体的杂交瘤细胞，即得抗人神经菌毛素1单克隆抗体。所得抗人神经菌毛素1单克隆抗体灵敏性高、特异性强。
文档编号C12N5/20GK102161703SQ20101061839
公开日2011年8月24日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者李响, 王生育, 颜江华 申请人:厦门大学