一种控制菌丝体生长形态的方法与流程

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种控制菌丝体生长形态的方法。

背景技术：

丝状真菌在工业化生产中有着广泛的应用，产品涵盖了工业酶制剂(如淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶等)、有机酸、抗生素等。在产业化生产中，深层发酵的丝状真菌在通常情况下存在3种形态：团块状、絮状和球状。不同形态的丝状真菌会直接影响发酵体系中物性参数、基质传递等，所以生长形态对发酵产品的生成，发酵过程的控制至关重要。丝状真菌的生长形态对细胞代谢途径、产物积累及分离提取均有显著影响，因此如何控制丝状真菌的生长形态，最大化提高目标产物产量成工业生产研究的重点。

团块状的菌体形态在发酵过程中接种量难于控制，且极大地限制了菌体内部的传氧、传质，产物产量明显偏低，而且在搅拌式发酵罐发酵过程中，会缠绕在搅拌器上或者附壁，最终导致不能得到目标产品，发酵失败；絮状菌体营养物质和氧气在其内部传输较为顺利，但其能增加发酵液黏度，流变性相对较差，降低物质、氧气在发酵液中的传递效率，同时还极易缠绕搅拌桨，使发酵产物产量、发酵罐性能降低；球状形态可以克服以上不足，改善发酵液的流变特性，有效提高传质、传氧性能，降低能耗，但若菌球过大，菌球内部传质、传氧将发生困难，影响产物积累，因此规则的、适宜大小的球状真菌则有利于酶制剂、有机酸等产品的生产。

然而，生长形态发育作为丝状真菌生命体的一种本能表现形式，受到影响因素多且过程复杂，比如说菌种自身的影响、生长营养环境的影响、发酵操作条件的影响等等，最终使得丝状真菌的形态不能控制为理想的形态，或者菌球控制的重复性以及平行性不好。这就使得高效简便的形态控制技术显得尤其重要。在丝状真菌发酵过程中，不同代谢产物所适宜的形态不同，在不同形态下，代谢产物的积累差异明显，球状成为许多产品生产的首选形态，在固定化技术迅速发展的今天，控制菌体生长成为菌球的自固化技术得到了巨大的发展。

环境是影响菌球形成的重要因素，不同环境条件下获得的菌球结构及大小各异。影响菌球形成及特性的因素一般有pH、接种孢子、培养基成分、搅拌转速等，通过对这些因素的调控可以获得产物积累的最佳形态。

Liu Y,Liao W,Chen SL.“Study of pellet formation of filamentous fungi Rhizopus oryzae using a multiple logistic regression model.”Biotechnol Bioeng,2008,99(1):117-128.中报道了：综合考察了孢子浓度、葡萄糖、尿素、磷酸盐、金属离子的浓度、发酵体系pH、通风搅拌对丝状真菌生长形态的影响，pH和接种量是影响丝状真菌形态的主要原因，通过降低抱子浓度，严格调控范围，有效将丝状真菌控制为球状。该技术方案的策略是：通过改变微生物生长环境，抑制微生物的生长，最终达到控制菌球形态的目的。其缺点在于，对pH的调节要求很高，常常要求将酸度调整精确到小数点后两位，这使得难以在工业生产中放大。另外，一些产品的特性要求一定的酸度范围，也使该技术方案的应用受到限制。

Driouch H,Sommer B,Wittmann C.“Morphology engineering of Aspergillus niger for improved enzyme production.”Biotechnol Bioeng,2010,105(6):1058-1068.中报道了：利用微粒子在流场中与生产菌株的作用可以作为形态控制的有效策略。在利用黑曲霉产酶的时候，在发酵体系中加入二氧化硅等微粒子，有效将微生物体系的形态控制为丝状，达到了高产的目的。其技术方案的前提是，该类型的菌种由于自身的生长特性，不因为环境的改变而能很好的形成菌球。在不同的发酵体系中，进行有机酸及某些酶制剂等产品的发酵生产时，球状是最佳的生产形态，添加微粒子的技术路线并不能有效地将丝状真菌控制为菌球形态。

综上所述，现有技术工艺条件苛刻，操作方法繁复，不能解决有效控制丝状真菌发酵形态的问题。因此，设计高效便捷的技术方案以控制丝状真菌发酵生长形态，成为必然需求。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种控制菌丝体生长状态的方法，所述方法能够高效便捷地控制丝状真菌发酵过程中的生长形态，且该方法操作简单，普适性强，适宜在工业生产中放大。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种控制菌丝体生长形态的方法，所述方法包括：在丝状真菌发酵过程的菌丝体生长阶段，向发酵液中添加法尼醇，并继续发酵以获得球状的丝状真菌菌丝体；

其中，所述法尼醇添加的终浓度为150-1000μM。

所述法尼醇添加的终浓度为150μM、160μM、170μM、180μM、190μM、200μM、210μM、220μM、230μM、240μM、250μM、260μM、270μM、280μM、290μM、300μM、310μM、320μM、330μM、340μM、350μM、360μM、370μM、380μM、390μM、400μM、430μM、450μM、480μM、500μM、530μM、550μM、580μM、600μM、630μM、650μM、680μM、700μM、730μM、750μM、780μM、800μM、830μM、850μM、880μM、900μM、930μM、950μM、980μM或1000μM、。

本发明中，法尼醇作为真菌群体感应系统中研究最广泛的群体感应分子，它能有效改变白色念珠菌的菌体形态，抑制其从酵母形态向菌丝形态的转变，因此，将适当浓度的法尼醇作为外源添加物补充到发酵培养基中可以有效控制丝状真菌菌体形态。

本发明中，将特定浓度的法尼醇溶液加入到丝状真菌发酵培养基中，将丝状真菌菌丝体形态控制为球状。

优选地，所述法尼醇添加的终浓度180-800μM，优选为200-600μM。

优选地，以法尼醇溶液的形式向发酵液中添加法尼醇，所述法尼醇溶液的配制溶剂为乙醇、正丙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或至少两种的混合，优选为乙醇或异丙醇。

优选地，所述丝状真菌为曲霉属、根霉属、木霉属或栓菌属中的任意一种或至少两种的组合，优选为曲霉属、根霉属或木霉属中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述控制菌丝体生长形态的方法，具体包括如下步骤：

(1)将预培养的种子培养液接种到发酵培养基中，进行发酵培养；

(2)在所述发酵培养过程的菌丝体生长阶段，向发酵液中添加法尼醇溶液；

(3)在菌丝体生长结束后收集菌体，观察菌丝体生长形态。

优选地，所述步骤(1)中发酵培养基包括如下组分：碳源1-50g/L，氮源1-20g/L，KH₂PO₄ 0.5-5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-2g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01-0.1g/L，CaCl₂·2H₂O 0.01-0.1g/L。

优选地，所述碳源为甘油、葡萄糖或蔗糖中的任意一种或至少两种的混合。

优选地，所述氮源为大豆蛋白胨、尿素或(NH₄)₂SO₄中的任意一种或至少两种的混合。

优选地，所述种子培养液接种到发酵培养基，所述种子培养液按体积比的接种量为3-15％，例如可以是3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％，优选为4-12％，进一步优选为6-10％。

优选地，所述发酵培养的pH为4.0-6.0，例如可以是4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0，优选为4.5-5.5。

优选地，所述发酵培养的温度为20-40℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为23-36℃，进一步优选为26-32℃。

优选地，所述发酵培养的搅拌速率为50-200rpm，例如可以是50rpm、60rpm、70rpm、80rpm、90rpm、100rpm、110rpm、120rpm、130rpm、140rpm、150rpm、160rpm、170rpm、180rpm、190rpm或200rpm，优选为100-180rpm。

优选地，所述发酵培养的时间为48-168h，例如可以是48h、50h、52h、54h、55h、58h、60h、62h、65h、68h、70h、72h、75h、78h、80h、82h、85h、88h、90h、92h、95h、98h、100h、102h、105h、108h、110h、112h、115h、118h、120h、122h、125h、128h、130h、135h、138h、140h、142h、145h、148h、150h、155h、158h、160h、162h、165h或168h。

优选地，所述步骤(2)向发酵液中添加法尼醇溶液，所述法尼醇为一次性或分多次添加，优选一次性添加。

所述法尼醇溶液采用0.22μm滤膜过滤除菌。

优选地，所述法尼醇溶液的浓度为所述添加的终浓度的200-2000倍，例如可以是如200倍、400倍、600倍、800倍、1000倍、1200倍、1400倍、1600倍、1800倍、2000倍，优选为500-1500倍，进一步优选为800-1200倍。

优选地，所述法尼醇溶液的添加时间为所述步骤(1)中发酵培养过程的第0-48h，例如可以是0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h、38h、40h、42h、44h、46h、48h，优选为第4-36h，更优选为第12-24h。

优选地，所述发酵培养过程中菌丝体生长的时间为0-48h，例如可以是0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h、38h、40h、42h、44h、46h、48h，优选为12-40h，进一步优选为20-36h。

作为优选技术方案，所述控制菌丝体生长形态的方法，具体包括如下步骤：

(1’)在温度20-40℃、pH4.0-6.0、搅拌速率50-200rpm的条件下，将预培养的丝状真菌种子液以体积比3-15％接种到发酵培养基中，进行发酵培养；

(2’)在所述发酵培养过程的第0-48h，一次性向发酵液中添加法尼醇溶液至法尼醇的终浓度为110-400μM；

(3’)在菌丝体生长结束后收集菌体，观察菌丝体生长形态。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的控制菌丝体生长形态的方法，能够高效便捷地控制丝状真菌发酵过程中的生长形态，提高丝状真菌的发酵产率，洛伐他汀含量提高了1.6倍，胞外多糖含量提高了2.1倍；

(2)本发明的方法操作简单，易于放大生产，适于大规模发酵，从而有效控制丝状真菌菌体的形态，满足规模化应用的要求。

附图说明

图1为本发明实施例1培养的黑根霉的形态图；

图2为本发明实施例2培养的黑曲霉的形态图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

菌种：本实施例的菌种均是工业生产中常用的具有典型代表的丝状真菌：

黑根霉(Rhizopus nigricans 41346)孢子悬浮液；

黑曲霉(Aspergillus niger 2106)孢子悬浮液；

红曲霉(Monascus purpureus 5013)孢子悬浮液；

变色栓菌(Trametes versicolor 14001)。

实施例1

本实施例说明利用法尼醇控制菌丝体形态的方法：

(1)培养基的配制：基础培养基包括，葡萄糖20g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 4g/L，MgSO₄·7H2O 2g/L,FeSO₄·7H2O 0.1g/L,CaCl₂·2H₂O 0.5g/L，葡萄糖分开灭菌，115℃灭菌30min；

(2)种子培养：往步骤(1)所述培养基中加入黑根霉孢子悬浮液1mL，28℃、160rpm培养20小时，将培养物均质后即为种子液；

(3)将法尼醇按200mM的浓度溶解于乙醇中，0.22μm滤膜过滤除菌，制得法尼醇溶液；

(4)在整个培养过程的第0h，加入法尼醇溶液至发酵液中的浓度达到200μM，不加入法尼醇的培养基作为对照；

(5)发酵培养：将种子液按6％(v/v)接种量接入步骤(1)所述新鲜培养基，28℃、160rpm培养48小时，收集菌体。

结果如图1所示，显示加入法尼醇的培养基中菌丝体为表面光滑的球状。

实施例2

本实施例说明一种利用法尼醇控制菌丝体形态的方法：

(1)培养基的配制：基础培养基包括，蔗糖50g/L，尿素10g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，CaCl₂·2H₂O 0.05g/L，葡萄糖分开灭菌，115℃灭菌30min；

(2)种子培养：往步骤(1)所述培养基中加入黑曲霉孢子悬浮液1mL，30℃、150rpm培养36小时，将培养物均质后即为种子液；

(3)将法尼醇按200mM的浓度溶解于乙醇中，0.22μm滤膜过滤除菌，制得法尼醇溶液；

(4)在整个培养过程的第0h，加入法尼醇溶液至发酵液中的浓度达到150μM，不加入法尼醇的培养基作为对照，用HCl调控pH为6.0；

(5)发酵培养：将种子液按6％(v/v)接种量接入步骤(1)所述新鲜培养基，30℃、200rpm培养72小时，收集菌体。

结果如图2所示，显示加入法尼醇的培养基中菌丝体为表面多毛的球状。

实施例3

本实施例说明一种利用法尼醇控制菌丝体生长形态方法进行洛伐他汀发酵生产：

(1)培养基的配制：基础培养基包括，甘油5％，葡萄糖10g/L，大豆蛋白胨2g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L,FeSO₄·7H₂O0.05g/L，CaCl₂·2H₂O 0.05g/L，葡萄糖分开灭菌，115℃灭菌30min；

(2)种子培养：往步骤(1)所述培养基中加入红曲霉孢子悬浮液1mL，30℃、200rpm培养48小时，将培养物均质后即为种子液；

(3)将法尼醇按200mM的浓度溶解于乙醇中，0.22μm滤膜过滤除菌，制得法尼醇溶液；

(4)在整个培养过程的第48h，加入步骤(3)中的法尼醇溶液至发酵液中的浓度达到500μM，不加入法尼醇的培养基作为对照；

(4)发酵培养：将种子液按10％(v/v)接种量接入步骤(1)所述新鲜培养基，30℃、200rpm培养21天，获得表面光滑的球状菌体，该细胞菌体可以用作发酵生产洛伐他汀；

(5)洛伐他汀的提取和检测：取1体积的匀浆发酵液与4体积的无水甲醇，30℃、200rpm摇床振荡提取3h，12000rpm离心10min，上清液经0.22um滤膜过滤，HPLC上样检测。

HPLC检测条件：色谱柱250mm×4.6mm C18柱；紫外检测器：检测波长237nm；流动相为70％乙腈(色谱纯磷酸调pH至2.6-2.8)；流速0.6ml/min；进样量10uL；

结果显示：发酵液中的洛伐他汀含量为0.64g/L，对照组中洛伐他汀含量为0.4g/L。

实施例4

本实施例说明一种利用法尼醇控制菌丝体生长形态方法进行胞外多糖发酵生产：

(1)预培养：采用常用土豆培养基配制方法配制预培养用的培养基，其中土豆200g/L、葡萄糖20g/L；将变色栓菌菌丝体接种于该培养基中，于26℃、150r/min条件下培养7天；将培养物均质后按10％(v/v)接种量接入新鲜培养基，26℃、150r/min条件下培养5天，即得预培养的种子液。

(2)发酵培养基的配制：葡萄糖40g/L，大豆蛋白胨10g/L，KH₂PO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，葡萄糖分开灭菌，115℃灭菌30min；

(3)将法尼醇按200mM的浓度溶解于乙醇中，0.22μm滤膜过滤除菌，制得法尼醇溶液；

(4)在整个培养过程的第0h，加入法尼醇溶液至发酵液中的浓度达到1mM，不加入法尼醇的培养基作为对照；

(5)发酵培养：将种子液按10％(v/v)接种量接入步骤(2)所述新鲜培养基，26℃、50rpm培养168小时，获得表面毛茸茸的膨大的球状菌体，该细胞菌体可以用作发酵生产胞外多糖；

(6)胞外多糖的提取和检测：取1体积的发酵液与4体积的95％乙醇，振荡摇匀，4℃静止过夜，12000rpm离心10min，沉淀物经95％乙醇、70％乙醇各洗涤两次，即得粗胞外多糖。

检测：苯酚-硫酸法检测总糖含量，DNS法检测掺杂的还原糖含量，胞外多糖含量＝总糖含量-还原糖含量；

结果显示：发酵液中的胞外多糖含量为2.5g/L，对照组中胞外多糖含量为0.81g/L，相比提高了2.1倍。

对比例1

该对比例于实施例1的不同之处仅在于，所述加入法尼醇溶液至发酵液中的浓度达到120μM，除此之外，其余试剂和试剂用量以及培养方法均与实施例1相同。

结果显示培养基中菌丝体为絮状。

对比例2

该对比例于实施例2的不同之处仅在于，所述加入法尼醇溶液至发酵液中的浓度达到100μM，除此之外，其余试剂和试剂用量以及培养方法均与实施例2相同。

结果显示培养基中菌丝体为团簇状。

对比例3

该对比例于实施例3的不同之处仅在于，所述加入法尼醇溶液至发酵液中的浓度达到60μM，除此之外，其余试剂和试剂用量以及培养方法均与实施例3相同。

结果显示：发酵液中的洛伐他汀含量为0.5g/L。

对比例4

该对比例于实施例4的不同之处仅在于，所述加入法尼醇溶液至发酵液中的浓度达到60μM，除此之外，其余试剂和试剂用量以及培养方法均与实施例4相同。

结果显示：发酵液中的胞外多糖的含量为1.2g/L。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。