本发明涉及一种原多甲藻培养基配方及采用矿泉水桶充当容器的养殖方法。属于海洋微藻养殖领域。
背景技术：
贝类毒素因其强毒性和不可预见性等特点，对消费者健康安全和近海生态安全存在严重威胁，是近年来国际社会较为关注的生态灾害和重大海洋环境问题。氮杂螺环酸毒素（Azaspiracid，AZA）是现有的八大类贝类毒素中发现最晚但毒性最强的一类新型脂溶性贝类毒素，因其毒性强、残留高且代谢慢，成为欧盟、美国、加拿大等国家重点关注的对象，不仅将其限量标准设定为160 µg AZA-1 eq/kg（AZA1-3），数值普遍低于其他贝类毒素，且在国际贸易中重点加以监控。
因此，原多甲藻酸贝类毒素的检测工作，已成为出口贸易和保障消费者安全必要保证。目前国际上标准物质制备方法多是将阳性贝类样品经过萃取纯化后制备而成的，存在的主要问题是样品来源不稳定，批次间存在较大差异；且所需阳性贝类样品量大，运输及提取加工前处理复杂。而以产毒藻为来源的毒素标准品制备，不仅能保障这一毒素的稳定来源，而且由于基质干扰少，是目前最好的标准品制备原料。本申请人于2016年4月8日申请保藏一种氮杂螺环酸毒素的产毒原多甲藻，保藏于中国典型微生物保藏中心，分类命名为：Azadinium poporum AZDY06，生物保藏号为CCTCC NO：M 2016181。具有优良的产毒性状，已初步开发出毒素的提取纯化过程。而目前产毒藻的连续扩大培养、营养液循环与补充以及高浓度产毒藻的收集，成为这一技术的主要制约瓶颈。
目前，采用传统f/2培养基进行原多甲藻培养，藻细胞生长缓慢、细胞密度低、单细胞产毒能力弱（40fg/cell AZA2）、扩大培养时易污染且离心收集耗时。因此，急需开发产毒原多甲藻的扩大培养与毒素制备原料高效收集方法。传统藻细胞扩大培养的方法是露天开放水泥池式培养，藻细胞极易受到污染。本发明给出了原多甲藻培养的最适营养盐配方，采用矿泉水桶通CO2方法培养原多甲藻，最大藻细胞密度可达6.5×106cells/ml，最高产毒达（320fg/cell AZA2），整体毒素产量提高了6倍，通过沉降絮凝方式收集的产毒藻，大大降低工作量。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：提供一种原多甲藻的培养基和培养方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
本发明提供的原多甲藻培养基，包括下列重量的组分：
NH4NO3，20-100mg；CO(NH2)2(尿素)，20-60mg；KH2PO4，1-10mg；碳酸氢盐，100-800mg；MnCl2·4H2O，15-50g； FeC6H5O7·5H2O(柠檬酸铁)，10-30mg；VB12，1×10-5-1×10-3mg；VB1，50-200mg；KCl，0.5-5mg；Na2EDTA 10-15g；壳寡糖0.2-5g（分子量1500-2000Da）海水1000mL。
优选的，本发明提供的原多甲藻培养基，包括下列重量的组分：
NH4NO3，30mg；CO(NH2)2(尿素)，40mg；KH2PO4，5mg；碳酸氢盐，500mg； MnCl2·4H2O 26g、FeC6H5O7·5H2O(柠檬酸铁) 20g；VB12，1×10-4mg；VB1，100mg；KCl，3mg；Na2EDTA 12.4g，壳寡糖1g（分子量1500-2000Da），海水1000mL。
进一步的，本发明所述的碳酸氢盐选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、碳酸氢铵中的一种或多种的组合。优选的，所述的碳酸氢盐选自碳酸氢钠。
本发明还提供一种上述培养基的改进配方，特征在于，在上述培养基的基础上，还包括1-3mg的氨基酸。所述的氨基酸选自极性氨基酸（亲水氨基酸）中的组合。
本发明还提供一种原多甲藻培养基的制备方法，包括如下步骤：
1) 将海水灭菌待用；
2)按照权利要求1中的培养基配方中的顺序和剂量依次加入到灭菌的海水中，加入后再充分搅5分钟，即可接种使用。
利用本发明提供的培养基，本发明提供一种原多甲藻的扩大培养方法，包括如下步骤：
第一阶段：三角烧瓶培养；海水为经0.45μm纤维膜过滤后高温灭菌的海水，盐度为30-35；添加培养基组分后，调节pH为7.9±0.3；室内培养，空调控温，20±3℃；日光灯管照明，光强 5000-7000lux，光暗比12h：12h；
用 3000-5000mL 三角烧瓶培养，工作体积占瓶体积的 3/5，取对数生长期藻种接种；接种密度 2×104cell/mL-5×104cell/mL ；每天摇瓶6次；藻细胞密度达2×105cell/mL-3×105cell/mL，转入下一阶段培养；
第二阶段：矿泉水桶培养；使用18L矿泉水桶培养，用次氯酸钠消毒海水的方法消毒矿泉水桶；消毒方法为每立方米海水中加入含有效氯 20 毫克/千克的次氯酸钠，将添加次氯酸钠后的灭菌海水加入矿泉水桶中，充气 30分钟，停气，经 3-5 小时消毒后，用灭菌后的海水润洗3遍，测定无余氯存在即可使用；
海水为经0.45μm纤维膜过滤后灭菌的海水，盐度为30-35，添加8L培养基组分后，瓶口用灭菌封口膜封口；导入气石充含5%二氧化碳的压缩空气保持pH为7.9±0.3，室内培养，空调控温20±3℃，双侧连续光照6000±1000LUX，光照时间15h:9h；接种密度 2×103cell/mL-3×103cell/mL；每隔三天添加5L培养液，培养7-9天，藻液密度可达到1.0×106-6.5×106 cell/ml，藻液呈棕黄色，收集5L左右培养液；并继续每隔三天添加5L培养液，保持密封，即可循环培养，不断收集。
本发明的有益效果：
目前，原多甲藻规模化培养存在的主要问题是藻细胞生长缓慢、倍增时间长、在扩大培养时易污染。合适的培养基和扩培容器是实现原多甲藻高密度培养的重要因素之一。
以前使用的培养基没有加入碳酸氢钠，只是采用传统f/2培养基进行培养原多甲藻。本发明的技术方案表明，微藻除了能利用空气中游离的CO2，还能有效地利用培养液中的HCO3-作为碳源。添加NaHCO3不仅缩短了原多甲藻的倍增时间，而且延长了藻的生长时间。添加 0.5g/L 的 NaHCO3后的培养基，营养更加全面、均衡，能大大提高原多甲藻生长速度，产量最大能提高 150％。且用矿泉水桶方法培养原多甲藻，并添加0.5g/L的 NaHCO3的培养条件下原多甲藻最大藻细胞密度可达6.5×105cells/ml，相较于传统玻璃锥形瓶容器培养和传统水泥池养殖方法受体积、材质限制，此培养方法一次可培养25L藻液，且材质对环境要求较低，并能保证藻种不被污染。
本发明给出了原多甲藻培养的最适营养盐配方，可提高原多甲藻产量并降低养殖成本；通过提高Na2EDTA含量，并添加合适配比的壳寡糖以促进原多甲藻的分裂与生长；采用矿泉水桶通CO2的压缩空气的方式结合适量配比的KH2PO4缓冲溶液的调节作用，既可以中和原多甲藻生长过程中产生的次级代谢产物对于培养液的破坏，维持最适pH，且CO2能促进藻细胞光合作用。应用本法培养最大藻细胞密度可达6.5×106cells/ml，最高产毒达（320fg/cell AZA2），整体毒素产量提高了6倍。
采用矿泉水桶培养原多甲藻与传统的露天开放水泥池式扩大培养相比，成本低，不易污染，易于操作，大大降低了工作量，使原多甲藻生长速度大幅度提高，培养周期缩短。
总之，使用优化培养基并采用矿泉水桶方法培养中原多甲藻具有生长速度快、生产周期短、产量高、成本低、易于操作、不易污染、易于掌控、灵活多样、更加安全可靠的优势。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种原多甲藻培养基，该原多甲藻培养基配方如下：NH4NO3，30mg；CO(NH2)2(尿素)，40mg；KH2PO4，5mg；NaHCO3，500mg； MnCl2·4H2O 26g、FeC6H5O7·5H2O(柠檬酸铁) 20g；VB12，1×10-4mg；VB1，100mg；KCl，3mg；Na2EDTA 12.4g，壳寡糖1g（分子量1500-2000Da），海水1000mL。
原多甲藻培养基的制备方法，包括如下步骤：
1) 将海水灭菌待用；
2)按照所述的培养基配方中的顺序和剂量依次加入到灭菌的海水中，加入后再充分搅5分钟，即可接种使用。
实施例2
本实施例提供了一种原多甲藻的培养方法，包括如下步骤：
第一阶段：三角烧瓶培养；海水为经0.45μm纤维膜过滤后高温灭菌的海水，盐度为30-35，添加培养基组分后，调节pH为7.9±0.3；室内培养，空调控温，20±3℃；日光灯管照明，光强 5000-7000lux，光暗比12h：12h；
用 3000-5000mL 三角烧瓶培养，工作体积占瓶体积的 3/5，取对数生长期藻种接种；接种密度 2×104cell/mL-5×104cell/mL ；每天摇瓶6次；藻细胞密度达2×105cell/mL-3×105cell/mL，转入下一阶段培养；
第二阶段：矿泉水桶培养；使用18L矿泉水桶培养，用次氯酸钠消毒海水的方法消毒矿泉水桶。消毒方法为每立方米海水中加入含有效氯 20 毫克/千克的次氯酸钠，将添加次氯酸钠后的灭菌海水加入矿泉水桶中，充气 30分钟，停气，经 3-5 小时消毒后，用灭菌后的海水润洗3遍，测定无余氯存在即可使用；
海水为经0.45μm纤维膜过滤后灭菌的海水，盐度为30-35，添加8L培养基组分后，瓶口用灭菌封口膜封口。导入气石充含5%二氧化碳的压缩空气保持pH为7.9±0.3，室内培养，空调控温20±3℃，双侧连续光照6000±1000LUX，光照时间15h:9h。接种密度 2×103cell/mL-3×103cell/mL；每隔三天添加5L培养液，一般培养7-9天，藻液密度达到1.0×106-6.5×106 cell/ml，藻液呈棕黄色，收集5L左右培养液。并继续每隔三天添加5L培养液，保持密封，即可循环培养，不断收集。
产毒藻密度于第7天达到1.6×106 cell/ml，继续培养至第9天，密度达6.5×106cell/ml，且显微镜观察无污染现象。检测培养液pH为8.1，培养条件状态良好，继续添加灭菌培养液连续培养。收集50mL培养液，测定藻毒素含量为（320fg/cell AZA2）。收集5L培养液，进行6h沉降后，采用离心方式，收集藻细胞，盛放于样品袋中，待制备AZA毒素标准品。
随后第三天，取培养液技术藻细胞，发现藻细胞密度为6.2×106 cell/ml，且显微镜观察无污染现象。检测培养液pH为8.0，培养条件状态良好，继续添加灭菌培养液连续培养。收集50mL培养液，测定藻毒素含量为（316fg/cell AZA2）。收集5L培养液，进行6h沉降后，采用离心方式，收集藻细胞，盛放于样品袋中，待制备AZA毒素标准品。
直至接种后第30d，取培养液技术藻细胞，发现藻细胞密度为5.8×106 cell/ml，且显微镜观察无污染现象。检测培养液pH为7.8，培养条件状态良好，继续添加灭菌培养液连续培养。收集50mL培养液，测定藻毒素含量为（307fg/cell AZA2）。收集5L培养液，进行6h沉降后，采用离心方式，收集藻细胞，盛放于样品袋中，待制备AZA毒素标准品。
实施例3 对比实验
应用实施例1所述的培养基和使用常规f/2培养基，应用实施例2所述的的培养方法和现有技术的培养方法，对比不同培养基和培养方法的培养效果：
试验1：应用本发明的培养基和培养方法的培养效果：
如实施例2所示，应用本发明的培养基和培养方法，最高收集产毒藻量为6.5×106cells/ml，，单细胞产毒量大，最高产毒达（320fg/cell AZA2）。
试验2：现有技术的培养基和本发明的培养方法
使用常规f/2培养基，应用本发明中的培养方法，主要包括：
第一阶段：三角烧瓶培养；海水为经0.45μm纤维膜过滤后高温灭菌的海水，盐度为30-35，添加培养基组分后，调节pH为7.9±0.3；室内培养，空调控温，20±3℃；日光灯管照明，光强 5000-7000lux，光暗比12h：12h；
用 5L 三角烧瓶培养，工作体积占瓶体积的 3/5，取对数生长期藻种接种；接种密度 2×104cell/mL-5×104cell/mL ；每天摇瓶6次；藻细胞密度达2×105cell/mL-3×105cell/mL，转入下一阶段培养；
第二阶段：矿泉水桶培养；使用18L矿泉水桶培养，用次氯酸钠消毒海水的方法消毒矿泉水桶。消毒方法为每立方米海水中加入含有效氯 20 毫克/千克的次氯酸钠，将添加次氯酸钠后的灭菌海水加入矿泉水桶中，充气 30分钟，停气，经 3-5 小时消毒后，用灭菌后的海水润洗3遍，测定无余氯存在即可使用；
海水为经0.45μm纤维膜过滤后灭菌的海水，盐度为30-35，添加8L培养基组分后，瓶口用灭菌封口膜封口。导入气石充含5%二氧化碳的压缩空气保持pH为7.9±0.3，室内培养，空调控温20±3℃，双侧连续光照6000±1000LUX，光照时间15h:9h。接种密度 2×103cell/mL-3×103cell/mL；
结果表明，产毒藻最高密度达0.8×106cells/ml，最高产毒量为（92fg/cell AZA2）。比较试验1的结果表明，产毒藻量与最高产毒量均降低了。可见培养基是影响产毒量的主要因素。
试验3：本发明的培养基和现有技术的培养方法
现有技术的培养方法：将灭菌的海水置于5L三角烧瓶中，置于培养箱内，温度20 ℃，光照强度60 %，光暗比12 h：12 h。连续培养直至产毒藻细胞大于1.0×106cells/ml，收集藻液。
结果表明，产毒藻最高密度达2.0×106cells/ml，最高产毒量为（245fg/cell AZA2）。比较试验1的结果表明，产毒藻量降低3倍，最高产毒量也降低了1.3倍。由于现有的培养方法由于培养条件限制，最长培养时间为40d，后由于培养液pH过低，致使产毒藻死亡和沉降，不能满足连续培养要求。
试验4：现有技术的培养基和现有技术的培养方法
使用常规f/2培养基和现有技术的培养方法，结果表明，产毒藻最高密度达5.5×105cells/ml，最高产毒量为（47fg/cell AZA2）。比较试验1的结果表明，产毒藻数量和产毒量均较低，且不能连续培养。最长生长周期为30d之后，即需要进行传代培养。所以致使生长周期较长，AZA2毒素产量低。不能满足大批次标准品制备的目的。
实施例4
本实施例提供一种原多甲藻培养基，该原多甲藻培养基配方如下：NH4NO3，30mg；CO(NH2)2(尿素)，40mg；KH2PO4，5mg；NaHCO3，500mg； MnCl2·4H2O 26g、FeC6H5O7·5H2O(柠檬酸铁) 20g；VB12，1×10-4mg；VB1，100mg；KCl，3mg；Na2EDTA 12.4g，壳寡糖1g（分子量1500-2000Da），海水1000mL，
在上述培养基的基础上，还包括3mg的氨基酸。所述的氨基酸选自极性氨基酸中的甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸的组合，三者的比例是3:2:1。
原多甲藻培养基的制备方法，包括如下步骤：
1) 将海水灭菌待用。
2)按照所述的培养基配方中的顺序和剂量依次加入到灭菌的海水中，加入后再充分搅5分钟，即可接种使用。
利用本实施例改进的培养基，和实施例2的培养方法，最高收集产毒藻量为9.6×106cells/ml，，单细胞产毒量大，最高产毒达（365 fg/cell AZA2）。