一种判断鼻咽癌放疗敏感性的分子标志物及应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种判断鼻咽癌放疗敏感性的分子标志物及应用。

背景技术：

肉碱棕榈酰转移酶CPT1A(carnitine palmitoyltransferase 1A)是细胞代谢途径中参与脂肪酸β氧化的关键酶，定位于线粒体外膜。其生理功能是以肉碱为载体，将脂酰辅酶A转化为脂酰肉碱和辅酶A，促进细胞浆中的脂肪酸进入线粒体基质进行β氧化分解，最终生成乙酰辅酶A，为生物合成及ATP的产生提供原料。新近研究表明，前列腺癌、胶质瘤、白血病干细胞、MYC高表达的三阴性乳腺癌以及氧化磷酸化活跃的弥散性大B细胞淋巴瘤中脂肪酸β氧化异常活化。肿瘤细胞依赖脂肪酸β氧化代谢提供的NADPH、ATP抵抗氧化应激或氧、葡萄糖缺乏等代谢应激，促进肿瘤细胞的增殖和存活。

Etomoxir(ETO)是FDA批准的CPT1靶向抑制剂，通过增加脂肪细胞对胰岛素的敏感性、抑制肝细胞的糖异生而降低血糖，目前已应用于2型糖尿病的临床治疗。近年的研究表明，etomoxir在肿瘤的治疗中发挥重要作用。在三阴性乳腺癌和前列腺癌中，etomoxir可以抑制裸鼠移植瘤的增殖。在急性粒细胞白血病中，etomoxir能诱导白血病细胞凋亡，增加静息性白血病祖细胞对化疗药物阿糖胞嘧啶的敏感性。Etomoxir能抑制肝癌中干细胞的干性，增加肝癌干细胞对靶向药物索拉菲尼的敏感性。以上研究提示，CPT1的靶向抑制剂etomoxir在肿瘤治疗中具有潜在价值。

鼻咽癌是人群高发的肿瘤，放疗是治疗鼻咽癌的主要手段，但约20％的鼻咽癌患者仍出现局部复发或转移的情况，并且成为患者死亡的主要原因。因此，发现鼻咽癌治疗的分子靶标，研究靶向治疗方法，增加肿瘤对放疗的敏感性，是降低鼻咽癌患者死亡率的重要策略。

技术实现要素：

本发明的目的在于确定CPT1A可作为判断鼻咽癌放疗敏感性的分子标志物，etomoxir(ETO)作为CPT1A靶向抑制剂可应用于鼻咽癌的治疗，etomoxir通过诱导鼻咽癌放疗抵抗细胞凋亡，增加肿瘤细胞对放疗的敏感性，提高治疗效果。因此，分子标志物CPT1A可用于制备鼻咽癌放疗增敏治疗药物、制备抑制鼻咽癌放疗抵抗细胞脂肪酸代药物、制备诱导鼻咽癌放疗抵抗细胞凋亡药物。分子标志物CPT1A的靶向抑制剂etomoxir可用于制备鼻咽癌放疗增敏治疗药物、制备抑制鼻咽癌放疗抵抗细胞脂肪酸代药物、制备诱导鼻咽癌放疗抵抗细胞凋亡药物。

下面对本发明作进一步说明：

本发明以鼻咽癌放疗抵抗细胞为主要的体外研究模型，发现CPT1A的mRNA、蛋白表达和酶活性水平在放疗抵抗细胞中显著增高。TCGA数据库显示CPT1A的mRNA水平增高降低头颈部鳞癌患者的总生存期，鼻咽癌组织芯片显示CPT1A蛋白高表达降低放射治疗后鼻咽癌患者的总生存期。说明CPT1A可作为分子标志物用于评价鼻咽癌对放射治疗是否敏感。

本发明发现CPT1A介导的脂肪酸β氧化在放疗抵抗细胞中异常活化，表现为脂肪酸氧化活性增加，ATP和NADPH含量增加。Etomoxir处理鼻咽癌放疗抵抗细胞，用细胞内ATP含量、NADPH含量评价etomoxir对细胞代谢的影响，用JC-1荧光染料检测etomoxir对细胞线粒体膜电位的影响，用Annexin-V荧光染料研究etomoxir对细胞凋亡的影响。研究发现，etomoxir能抑制鼻咽癌放疗抵抗细胞的ATP、NADPH含量，降低线粒体膜电位，增加细胞凋亡。

发明人以临床常用的放疗增敏剂顺铂(Cisplatin)为阳性对照，用克隆形成实验评价etomoxir对鼻咽癌细胞放疗抗性的影响。研究发现，etomoxir与放疗联用组对放疗抵抗细胞克隆形成能力的抑制作用明显高于顺铂与放疗联用组。用鼻咽癌放疗抵抗细胞构建裸鼠移植瘤模型证实与单独放疗相比，etomoxir与放疗联用能显著抑制瘤体生长，增加肿瘤细胞凋亡。本发明通过体外和体内实验证明，etomoxir抑制鼻咽癌放疗抵抗细胞的脂肪酸β氧化，增加放疗抵抗细胞对放疗的敏感性，可作为靶向药物应用于鼻咽癌放射治疗。

附图说明

图1：

A显示鼻咽癌放疗抵抗细胞CNE2-IR、HK1-IR中CPT1A mRNA水平高于放疗敏感细胞CNE2、HK1；

B显示鼻咽癌放疗抵抗细胞CNE2-IR、HK1-IR中CPT1A蛋白表达水平高于放疗敏感细胞CNE2、HK1；

C显示鼻咽癌放疗抵抗细胞CNE2-IR、HK1-IR中CPT1A酶活性水平高于放疗敏感细胞CNE2、HK1。

图2：

A显示CPT1A mRNA水平增高降低头颈部鳞癌患者的总生存期；

B显示CPT1A蛋白表达水平增高降低放疗后鼻咽癌患者的总生存期；

图3：

A显示CNE2-IR细胞脂肪酸β氧化能力增强；

B显示etomoxir降低CNE2-IR、HK1-IR细胞的ATP含量；

C显示etomoxir降低CNE2-IR、HK1-IR细胞的NADPH含量；

图4：

A显示etomoxir降低CNE2-IR、HK1-IR细胞的线粒体膜电位；

B显示etomoxir增加CNE2-IR、HK1-IR细胞的凋亡水平；

图5：显示etomoxir单独或与放疗联用明显降低CNE2-IR、HK1-IR细胞的存活分数；

图6：

A显示etomoxir单独或etomoxir与放疗联合处理明显降低CNE2-IR裸鼠移植瘤的生长速率；

B显示etomoxir单独或etomoxir与放疗联合处理明显降低CNE2-IR裸鼠移植瘤的体积和重量。

具体实施方式

本发明所用鼻咽癌细胞系CNE2细胞为中国医学科学院肿瘤研究所建系，CNE2-IR是以CNE2为母细胞经过总剂量为80Gy照射建立的放疗抵抗细胞，为湘雅医院耳鼻喉科建系。HK1细胞为香港伊丽莎白医院放射与肿瘤科所建，HK1-IR是以HK1为母细胞经过总剂量为60Gy照射建立的放疗抵抗细胞，为中南大学肿瘤研究所建系。

实施例1.鼻咽癌放疗抵抗细胞中CPT1A mRNA、蛋白表达和酶活性水平增加

A CPT1A的mRNA反映基因的转录水平。

实验方法：鼻咽癌细胞在6孔板中培养，至80～90％融合时，抽提细胞RNA，再进行逆转录和定量PCR，检测CPT1A的mRNA水平。

实验结果：如图1A所示，CNE2-IR、HK1-IR细胞中CPT1A的mRNA水平高于CNE2、HK1细胞。

B CPT1A的蛋白表达反映基因的翻译水平。

实验方法：鼻咽癌细胞在6孔板中培养，至80～90％融合时，抽提细胞蛋白，用Western Blot检测CPT1A的蛋白表达水平。

实验结果：如图1B所示，CNE2-IR、HK1-IR细胞中CPT1A蛋白表达水平高于CNE2、HK1细胞。

C CPT1A是脂肪酸β氧化的关键酶，酶活性是CPT1A发挥生物学功能的关键。

实验方法：鼻咽癌细胞在6孔板中培养。实验分组为vehicle组和ETO。待细胞长至80～90％融合后，加ETO(40μM)2h后，抽提细胞总蛋白。取100μl蛋白裂解液，加入50μl DTNB显色剂，用酶标仪检测405nm波长的吸光度值，记为blank。再向上述体系中加入终浓度为5mM的L-肉碱和100μM的棕榈酰辅酶A，作为CPT1酶促反应的底物，37℃孵育20min后，检测吸光度值，用所得值减去blank即为检测结果，再用蛋白浓度进行归一处理即得到最终结果。

实验结果：如图1C所示，CNE2-IR、HK1-IR细胞中CPT1A酶活性显著高于CNE2、HK1细胞。

实施例2.CPT1A高表达与头颈部鳞癌或鼻咽癌患者预后不良呈正相关

A现已有多种肿瘤样本库公开数据供研究者分析。申请人调取TCGA数据库中CPT1A mRNA水平及头颈部鳞癌患者的总生存期与数据，进行分析统计。

实验方法：查询TCGA数据库，数据库包含287例头颈部鳞癌样本，其中有预后信息的为283例。采用mantel-cox函数分析283例样本中CPT1A mRNA水平与总生存期生存期数据，绘制Kaplan-Meier生存期曲线，并进行统计学分析。

实验结果：如图2A所示，CPT1A高表达降低头颈部鳞癌患者的总生存期，风险值为1.63(95％CI＝1.091-2.383)，结果具有统计学差异(P＝0.0165)。

B在48例鼻咽癌组织样本中，用免疫组化方法检测CPT1A的表达情况，用存活曲线表示CPT1A表达量与鼻咽癌患者预后的相关性。48例鼻咽癌病例均经过Co60放射治疗，病理分型均为未分化磷状上皮癌。

实验方法如下：将组织芯片在60℃恒温箱中烘烤30分钟，然后置于二甲苯中浸泡5分钟，更换新鲜二甲苯后浸泡5分钟，再依次放入无水乙醇、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇中各浸泡5分钟，蒸馏水洗涤3分钟。然后将芯片置于0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)中，放入微波炉内高火加热置沸腾5min，然后改用中高火继续加热15分钟。PBS洗5分钟×2次，在3％H₂O₂中室温静置10分钟，PBS洗5分钟×2次。5％驴血清封闭30分钟后，滴加一抗，稀释比例为1:500，4℃湿盒过夜。37℃复温45分钟，PBS洗5分钟×3次，滴加二抗40～50μL，室温静置1小时，PBS洗5分钟×3次，将DAB原液按1:200稀释，显色20-40秒(在显微镜下掌握染色程度)，自来水冲洗10分钟，苏木素复染10～20分钟(在显微镜下掌握染色程度)，自来水冲洗10～15分钟，干燥，中性树脂封片后阅片。免疫组化评分参考许良中的判断标准:根据着色的强弱程度评分:无着色0分,淡黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分；同时按阳性细胞所占的百分比计分:阳性细胞率≤10％为1分,阳性细胞率>10％且≤50％为2分,阳性细胞率>50％且≤75％为3分,阳性细胞率>75％为4分。利用SPSS 16.0软件分析免疫组织化学结果，相关性分析采用Spearman法，用Log-rank计算p值得出统计学差异。采用mantel-cox函数分析样本中CPT1A蛋白水平与总生存期生存期数据，绘制Kaplan-Meier生存期曲线，并进行统计学分析。

实验结果：如图2B所示，取48例鼻咽癌肿瘤组织CPT1A表达量的中位数，将样本分为CPT1A低表达和高表达两组。CPT1A高表达降低鼻咽癌患者的总生存期，风险值为0.396(95％CI＝0.157-0.996)，结果具有统计学差异(P＝0.019)。

实施例3.放疗抵抗细胞系脂肪酸β氧化能力增强

A由于CPT1A的代谢底物为棕榈酸，细胞氧化棕榈酸需要消耗氧气。采用seahorse代谢分析仪，在向细胞内添加棕榈酸后，检测CNE2和CNE2-IR细胞的耗氧率，即可反应细胞的脂肪酸β氧化效率。

实验方法：将细胞接种于seahorse仪器专用24孔培养板，37℃培养，保证第二天单层铺满。同时将电极板浸没于水化液，置于37℃无二氧化碳培养箱内孵育过夜。第二天，将细胞培养基换成饥饿培养基(DMEM，0.5mM葡萄糖，1.0mM谷氨酰胺，0.5mM肉碱，1％FBS)，培养4小时后，将培养基换成上机液(111mM NaCl，4.7mM KCl，2.0mM MgSO₄，1.2mM Na₂HPO₄，2.5mM葡萄糖、0.5mM肉碱、5mM HEPES)，继续培养45分钟。上机前20分钟将电极水化板放入仪器校准。上机前，向每种细胞中分别加入BSA或BSA-棕榈酸后，将培养板放入仪器。选择脂肪酸β氧化程序检测氧消耗率。将所得数值用对应细胞的蛋白浓度进行归一得到最终结果。

实验结果：如图3A所示，以BSA为对照组，比较加入棕榈酸的BSA-棕榈酸组的氧耗率是否增加。结果发现CNE2-IR细胞在加入棕榈酸的条件下氧耗率增加，而CNE2无明显变化，提示CNE2-IR细胞的脂肪酸β氧化效率高于CNE2细胞。

B脂肪酸β氧化终产物乙酰辅酶A进入三羧酸循环，并偶联线粒体氧化磷酸化生成ATP。因此细胞内ATP水平是评价脂肪酸β氧化活性的间接指标。用etomoxir单独或联合4Gy放疗处理细胞，研究etomoxir对鼻咽癌放疗抵抗细胞ATP含量的影响。

实验方法：提前一天将细胞种于96孔板中，细胞数不少于8×10³个/孔。实验分组为：未处理组(vehicle)、4Gy放疗单独处理组、ETO单独处理组和ETO与4Gy放疗联用组。第二天加etomoxir(40μM)2h后，给予4Gy放疗。24小时后，检测前将试剂盒(Perkin Elmer,6016947)温育至37℃。弃培养基，向细胞中加入100μl新鲜培养基，再加入50μl裂解液，放在震荡器上700rpm裂解5分钟。然后每孔加入50μl反应底物，700rpm震荡裂解5分钟。最后将孔板避光放置10分钟，将96孔板中的反应体系加底部透光的白板中，在酶标仪上选择化学发光法程序进行检测。所得荧光值用对应孔的蛋白浓度进行归一，得到最终结果。

实验结果：如图3B所示，ETO单独或联合4Gy放疗处理均能降低CNE2-IR、HK1-IR细胞的ATP含量，但ETO对CNE2、HK1细胞的ATP水平无明显影响。

C脂肪酸β氧化终产物乙酰辅酶A进入三羧酸循环后，经异柠檬酸脱氢酶或苹果酸脱氢酶代谢生成NADPH。细胞内NADPH含量是评价脂肪酸β氧化活性的间接指标。用etomoxir单独或联合4Gy放疗处理细胞，研究etomoxir对鼻咽癌放疗抵抗细胞NADPH含量的影响。

实验方法：提前一天将细胞种于12孔板中，细胞数不少于1.5×10⁴个/孔。实验分组为：未处理组(vehicle)、4Gy放疗单独处理组、ETO单独处理组和ETO与4Gy放疗联用组。第二天加etomoxir(40μM)2h后，给予4Gy放疗。24小时后，用NADPH定量检测试剂盒检测(Biovision,#K37-100)。胰酶消化细胞，收集细胞沉淀，加入50μl蛋白裂解液，冰上放置10分钟，10000g离心10分钟。取上清，60℃孵育30分钟。然后向每孔中加入98μl反应缓冲液和2μl反应酶。室温孵育5分钟后，加入5μl显色剂，继续室温孵育20分钟。在酶标仪上用450nm波长检测吸光度值。所得荧光值用对应孔的蛋白浓度进行归一，得到最终结果。

实验结果：如图3C所示，ETO单独或联合4Gy放疗处理均能降低CNE2-IR、HK1-IR细胞的NADPH含量，但ETO对CNE2、HK1细胞的NADPH水平无明显影响。

实施例4.Etomoxir降低鼻咽癌放疗抵抗细胞的线粒体膜电位，增加放疗抵抗细胞的凋亡水平

A线粒体膜通透性的改变是凋亡的重要早期事件，表现为线粒体跨膜电位降低。JC-1荧光染料在正常细胞中以多聚体形式聚集于线粒体并显红色荧光。在凋亡细胞中，由于线粒体膜电位降低，JC-1染料在线粒体的聚集减少，以单体形式存在于细胞浆并显绿色荧光。因此，JC-1染料红色荧光与绿色荧光强度的比值反映线粒体膜电位高低。

实验方法：提前一天将细胞种于12孔板中，细胞数不少于1.5×10⁴个/孔。实验分组为：未处理组(vehicle)、4Gy放疗单独处理组、ETO单独处理组和ETO与4Gy放疗联用组。第二天加etomoxir(40μM)2h后，给予4Gy放疗。24小时后，胰酶消化细胞，收集细胞沉淀。向细胞中加入用1XPBS配置的JC-1染料，终浓度为1-5μM。37℃避光孵育30分钟后，用流式细胞仪检测荧光强度。

实验结果：如图4A所示，ETO单独或联合4Gy放疗处理均能降低CNE2-IR、HK1-IR细胞的线粒体膜电位，但ETO对CNE2、HK1细胞的线粒体膜电位无明显影响。

B细胞凋亡的标志性改变是磷酯酰丝氨酸从细胞膜内转移到细胞膜外。Annexin V是一种磷脂结合蛋白，与磷酯酰丝氨酸高度亲和，与暴露在细胞膜外的磷酯酰丝氨酸结合，指示凋亡的发生。zVAD是泛caspase抑制剂，用于抑制凋亡。

实验方法：提前一天将细胞种于12孔板中，细胞数不少于1.5×10⁴个/孔。实验分组为：未处理组(vehicle)、4Gy放疗单独处理组、ETO单独处理组、ETO与4Gy放疗联用组、ETO与4Gy放疗联用组加zVAD组。第二天加etomoxir(40μM)2h后，给予4Gy放疗。24小时后，胰酶消化细胞，收集细胞沉淀。向细胞中加入用Annexin V-FITC染料(凯基生物，KGF001)，稀释比例为1:100。室温避光孵育20分钟后，用流式细胞仪检测绿色荧光强度。

实验结果：如图4B所示，ETO单独或联合4Gy放疗处理均能增加CNE2-IR、HK1-IR细胞的凋亡水平，并能被凋亡抑制剂zVAD逆转。ETO对CNE2、HK1细胞的凋亡无明显影响。

实施例5.Etomoxir增加放疗抵抗细胞对放疗的敏感性

平板集落形成实验是评价细胞放疗抵抗能力的金标准，其结果用存活分数或存活曲线表示。以临床上常用的与放疗联用的化疗药物顺铂(Cisplatin)为阳性对照，在4Gy放疗条件下，评价etomoxir对鼻咽癌细胞放疗抵抗能力的影响。

实验方法：将细胞种于6孔板，2000个/孔，细胞呈单克隆分布。实验分组为：未处理组(vehicle)、4Gy放疗单独处理组、ETO单独处理组和ETO与4Gy放疗联用组。第二天加etomoxir(80μM)2h后，给予4Gy放疗。待单个细胞生长至细胞数大于等于50的集落，约10-14天，用1XPBS洗细胞两遍，再用甲醇固定10分钟。然后，用结晶紫染色15分钟。流水冲洗，晾干后，扫描培养板，用Image J计数染色集落。根据以下公式，计算细胞存活分数：

克隆形成率＝克隆数/接种的细胞数

存活分数＝受照射细胞的克隆形成率/对照细胞的克隆形成率

实验结果：如图5所示，放疗抵抗细胞在4Gy放疗后存活分数明显高于放疗敏感细胞，说明CNE2-IR和HK1-IR细胞具有放疗抵抗能力。顺铂能降低四种鼻咽癌细胞的存活分数，但CNE2-IR和HK1-IR细胞对顺铂的敏感程度低于CNE2和HK1。而与顺铂相比，ETO能更明显地降低CNE2-IR和HK1-IR细胞的存活分数。以顺铂作为放疗增敏的阳性对照药物，以上结果说明，ETO联用放疗比顺铂联用放疗能更有效地抑制放疗抵抗细胞的存活。

实施例6.Etomoxir增加CNE2-IR细胞裸鼠移植瘤对放疗的敏感性，表现为瘤体生长速率减慢和瘤体体积减小

本实验用鼻咽癌放疗抵抗细胞系CNE2-IR构建裸鼠移植瘤模型，用体内实验验证etomoxir的放疗增敏作用。

实验方法：4周龄免疫缺陷小鼠Bclb共16只购自中南大学动物学部，经本室饲养一周后，将5x10⁶个CNE2-IR细胞，以100μl生理盐水悬浮后，接种于裸鼠右侧背部。待裸鼠成瘤并且瘤体体积约为130mm³时，将裸鼠分成4组，每组4只，分别为对照组、放疗组、etomoxir治疗组和放疗与etomoxir联用组。第一次放疗或给药的时间记为第一天。

对照组：从第一天开始，隔天腹腔注射100μl生理盐水，维持3周；

放疗组：从第一天开始，隔天腹腔注射100μl生理盐水，维持3周。并且在第1、3,、7、9天分别给予2Gy放疗；

Etomoxir治疗组：从第一天开始，隔天腹腔注射100μl etomoxir，按50mg/kg剂量给药，维持3周；

放疗与etomoxir联用组：在同上etomoxir治疗组基础上，在腹腔注射etomoxir后2h给予放疗，放疗方案同放疗组。

从分组后第一天开始测量裸鼠体重及瘤体体积，隔天测量一次，3周后二氧化碳窒息处死小鼠，剥离瘤体，并称量瘤体重量。

实验结果：

如图6A所示，单独放疗、Etomoxir治疗均能抑制裸鼠移植瘤生长。Etomoxir与放疗联用对裸鼠移植瘤的生长抑制作用最明显。

如图6B所示，单独放疗、Etomoxir治疗均能减少裸鼠移植瘤的体积和重量。Etomoxir与放疗联用对裸鼠移植瘤的体积和重量的抑制作用最明显；

以上结果说明etomoxir能增加放疗抵抗的移植瘤模型对放射治疗的敏感性。