己糖激酶2作为鼻咽癌放疗预后预测的生物标志物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物标记物，具体是将介导鼻咽癌中有氧糖酵解异常活化的己糖激酶 2作为预测鼻咽癌放射治疗预后的新生物标志物。
【背景技术】
[0002] 肿瘤细胞内存在一套有别于正常细胞的异常代谢模式，为其无限增殖、侵袭转移 等恶性表型快速而有效的提供生物合成所需的能量及原料，肿瘤细胞代谢异常主要涉及到 糖酵解、三羧酸循环、氧化磷酸化、氨基酸代谢、脂肪酸代谢和核酸代谢等，这种异常的代谢 模式改变成为为肿瘤细胞的代谢重编程（Metabolic reprogramming)。
[0003] 糖是一类化学本质为多羟醛或多羟酮及其衍生物的有机化合物，其最主要的生理 功能是为生命体提供能量，并且是生物大分子合成过程中碳骨架的重要来源。以葡萄糖的 分解代谢为例，多糖类物质经由消化系统分解为葡萄糖等单糖；单糖经由消化道吸收进入 细胞内，经糖酵解途径分解成少量ATP和丙酮酸；在氧气充足的情况下，丙酮酸脱羧生成乙 酰辅酶A，经过氧化磷酸化途径，最终生成ATP及其他生物合成所需的中间体；但在无氧的 状况下，丙酮酸则还原生成乳酸，就此完成葡萄糖代谢全过程。
[0004] 肿瘤细胞中，细胞主要通过增强有氧酵解途径获得能量（ATP)，葡萄糖代谢至丙酮 酸后不再进入三羧酸循环进行有氧氧化，而是通过乳酸脱氢酶，转变成乳酸。肿瘤中的这种 有氧糖酵解特征命名为肿瘤细胞瓦伯格效应（Warburg Effect)。
[0005] 在糖酵解途径中，葡萄糖分子首先通过细胞膜上的葡萄糖转运子（Glucose transporter)将葡萄糖转运至细胞内，葡萄糖在己糖激酶（Hexokinase)的催化下 通过消耗ATP磷酸化为6-磷酸葡萄糖。进一步，6-磷酸葡萄糖在磷酸己糖异构酶 (Glucose-6-phosphate isomerase)的催化下生成6-磷酸果糖；接着6-磷酸果糖会在磷 酸果糖激酶（Phosphofructokinase)的作用下通过消耗ATP磷酸化生成1，6_二磷酸果 糖，ATP则转变为ADP。两个磷酸基团可以进一步在醛缩酶（Aldolase)的参与下分解为 磷酸二轻丙酮和3-磷酸甘油醛。磷酸二轻丙酮会在磷酸丙糖异构酶（Triose-phosphate isomerase)帮助下转化为3-磷酸甘油醛。两分子3-磷酸甘油醛会被NAD+和3-磷酸甘油 酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)氧化生成 1，3_ 二磷酸甘油酸。 1，3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸，高能磷酸键由1，3-二磷酸甘油酸转移到ADP上， 生成两分子ATP。磷酸甘油酸变位酶（Phosphoglycerate)推动3-磷酸甘油酸生成磷酸稀 醇式丙酮酸。最后，在丙酮酸激酶的作用下磷酸烯醇式丙酮酸生成ATP和丙酮酸。在糖酵 解途径异常活化的肿瘤细胞中，目前的研宄证实多个糖酵解相关酶在多种肿瘤组织中高表 达，如己糖激酶 2(Hexokinase 2)、丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase muscle，PKM2)、乳酸脱 氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH)等。上述糖酵解相关基因在肿瘤细胞中异常活化，既 是肿瘤细胞瓦伯格效应的分子基础，同时也为开发新的肿瘤分子诊断和靶向治疗提供了可 能。因此，肿瘤代谢研宄作为肿瘤学研宄的快速发展的前沿领域，其研宄成果已经开始转化 成为肿瘤诊断和治疗的新手段和新策略。
[0006] 鼻咽癌是中国南方人群高发的恶性肿瘤，每年全球近8万例新发病例，其中50% 以上的新发病例来自于中国。鼻咽癌病理类型主要为低分化鳞癌，鼻咽解剖部位的特点 及组织特性决定了放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方式。临床上发现放疗抵抗、复发、转移 是导致治疗失败的主要原因。因此，开发新的用于预测鼻咽癌放疗预后的的分子标志物 (Bio-marker)以及放疗增敏的策略是降低鼻咽癌复发、转移、提高病人生存率，降低死亡率 的关键。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于确定鼻咽癌中糖酵解途径是否异常活化及其异常活化的分子 机制，明确介导鼻咽癌糖酵解异常活化基因与鼻咽癌放疗预后的相关性。
[0008] 本发明利用代谢组学分析平台，分析了永生化鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞中的代 谢状态。发现乳酸（lactate)和山梨醇（sorbitol)的含量在鼻咽癌细胞中显著增加。乳 酸是糖酵解途径（glycolysis pathway)的最终产物，山梨醇是细胞储存葡萄糖的重要代谢 物质。乳酸和山梨醇在鼻咽癌细胞中含量增加，提示糖酵解途径可能在鼻咽癌细胞中异常 活化，且鼻咽癌细胞中葡萄糖的摄入能力高于永生化鼻咽上皮细胞。进一步我们通过临床 生化检测仪证明，鼻咽癌细胞的葡萄糖摄取速率和乳酸生成速率显著增加。
[0009] 通过PCR array方法筛选在鼻咽癌细胞中异常高表达的糖酵解相关分子，发现鼻 咽癌细胞中己糖激酶2(Hexokinase 2，HK2)转录显著增高。Western Blot实验证实HK2在 多种鼻咽癌细胞中高表达。抑制HK2能显著抑制鼻咽癌细胞的增值速率，诱导细胞凋亡，并 增加鼻咽癌细胞对于放射处理的敏感性。
[0010] 进一步，我们在鼻咽癌临床组织样本中用免疫组组化学方法检测了 HK2,证实约 50%的鼻咽癌患者组织中HK2呈高表达水平。对鼻咽癌患者的预后进行回顾性分析发现 HK2高表达的鼻咽癌患者的平均生存周期显著低于HK2低表达的患者。因此，鼻咽癌细胞中 高表达的HK2是鼻咽癌细胞中糖酵解途径异常活化的重要分子基础。在鼻咽癌组织中HK2 的高表达水平，可用于预测鼻咽癌患者的放疗预后。
[0011] 基于上述研宄结果，本发明提出生物标志物HK2(己糖激酶2)可应用在鼻咽癌放 疗敏感性诊断试剂和/或鼻咽癌放疗预后预测试剂的制备中。
[0012] 具体的，该诊断试剂和/或预测试剂通过检测被试者（鼻咽癌患者）组织中HK2 的表达水平或基因转录水平，并与正常水平相比较来诊断鼻咽癌放疗敏感性以及预测放疗 预后情况，从而为鼻咽癌放射治疗提供参考指标。在一些实施方案中，可以使用定量PCR的 方法来检测鼻咽癌组织中HK2基因的转录水平，转录水平与鼻咽癌对放射治疗的敏感性负 相关；还可以利用免疫组织化学检测鼻咽癌组织中HK2的表达水平，鼻咽癌组织中HK2的高 表达量与鼻咽癌临床预后不良正相关。
[0013] 进一步的，本发明提供一种检测鼻咽癌放疗敏感性和/或预测鼻咽癌放疗预后的 试剂盒，包括：
[0014] (l)mRNA 提取试剂；
[0015] (2)逆转录试剂；
[0016] (3)定量 PCR 试剂；
[0017] 其中，定量PCR试剂中包含所述生物标志物HK2基因的特异性引物。优选的，所述 定量PCR试剂中包含的HK2特异性定量PCR引物序列是：
[0018] 上游引物：5' -GAGCCACCACTCACCCTACT-3'（SEQ ID No :5);
[0019] 下游引物：5' -CCAGGCATTCGGCAATGTG-3'（SEQ ID No :6)。
[0020] 本发明还提供的一种检测鼻咽癌放疗敏感性和/或预测鼻咽癌放疗预后的免疫 组化试剂盒，包括特异性针对HK2的抗体。该试剂盒利用抗原与抗体特异性结合的原理，通 过化学反应使标记抗体的显色剂（例如荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细 胞内抗原（HK2)，对其进行定位、定性及定量。
[0021] 另一方面，生物标志物HK2(己糖激酶2)或其基因可应用于治疗鼻咽癌药物的制 备中。途径之一是设计特异性靶向HK2的siRNA，有效干扰鼻咽癌细胞中HK2的表达，由此 抑制鼻咽癌细胞的增值和诱导鼻咽癌细胞发生凋亡，增加鼻咽癌细胞对于放射处理的敏感 性。
[0022] 所述特异性靶向