专利名称：一株高温、厌氧的纤维素分解细菌菌种和培养基及其培养产物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域。特别是涉及具有高温条件下有效降解纤维素能力的厌氧细菌复合系及其培养，以及该菌系对纤维素分解的产物作为培养 SRB(Sulfate-reducing Bcteria)的碳源。
背景技术：
木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素三种成分组成，它们相互结合形成复杂的超分子复合物。木质纤维素被分解为小分子有机物后，可用作肥料以改善和保持土壤肥力，可用作畜禽饲料以促进畜牧业发展，可用作沼气发酵以及乙醇生产的原料而获得清洁能源。因此，分离培养具有纤维素分解能力的微生物，将廉价的可再生植物纤维素资源转化为对环境友好的产品，变废为宝，是解决我国能源与环境问题、实现我国农业的可持续发展的有效途径之一。
此外，利用硫酸盐还原菌处理酸性矿山废水具有成本低、适用性强、无二次污染、 可以回收酸性矿山废水中的重金属等特点。该方法中的工作主体硫酸盐还原菌的生长需要外加额外的碳源才能完成，目前现有工艺中使用的碳氮源通常为化学药品，价格较贵，药剂消耗成本高，不利于在工业生产中的推广应用。因此选择适于细菌生长的、廉价的、甚至于作为废弃物的有机质，作为硫酸盐还原菌的碳源用以培养菌种是实现工业应用的重要环节。发明内容
本发明的第一个目的是提供一株高温、厌氧的纤维素分解细菌菌种，菌种名称为 Thermoanaerobacterium sp. L_D，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址武汉大学内， 保藏日2008年10月17日，保藏登记号CCTCC NO :M208166)该菌系对滤纸具有很强的分解能力，对稻草亦表现了较强的分解能力。
本发明的第二个目的是提供一种可以富集、分离、培养纤维素分解菌的培养基。
本发明的第三个目的是提供一种利用该纤维素分解菌系高温发酵稻草的分解产物作碳源培养SRB的方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的
本发明所用的富集分离纤维素分解菌的样品为活性污泥。
本发明使用的菌种富集分离培养基为
酵母粉(Yeastextract)1-5. OOg
氯化铵(NH4Cl)0. 5-2. 5g
硫酸镁(MgS04x7H20)0. 5_2g
滤纸条12X120_
磷酸氢二钾(K2HPO4)0. 1-0. 5g
三氯化铁(FeCl3)
氯化钠(NaCl)
普通自来水
pH1000. OOml
鉴于以上两点，本发明通过富集分离的一株高温、厌氧的纤维素分解细菌菌种 (该菌名称为ThermoanaercAacterium sp. L-D，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址武汉大学内，保藏日2008年10月17日，保藏登记号CCTCC NO :M208166)有效降解纤维素，并利用降解纤维素的小分子产物作为碳源培养硫酸盐还原菌(SRB)。
本发明采用16S rDNA克隆文库技术对纤维素分解复合菌系中微生物种群组成进行分析。
图1为本发明菌种的相差显微镜照片
图2为复合菌系对滤纸和稻草的分解情况
图3SRB的生长情况(大量FeS黑色沉淀形成)
本发明利用该复合菌系高温降解稻草的产物作为碳源培养SRB。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、高温降解纤维素厌氧复合菌系L-D的获得
培养基制作每升培养基(自来水)含有如下组分酵母粉，3g;K2HP04，1.5g; MgSO4 · 7H20, Ig ；NaCl，2g ；NH4Cl, 0. 6g ；FeCl3,0. 005g ；ρΗ7· 5。
称取相应药品倒入事先装有部分蒸馏水的烧杯中，药品充分溶解后用蒸馏水定容至990ml，调pH到7. 2，最后定容到1000ml。将20ml培养基分装到18X 150mm的螺口厌氧管(预先放置12X 120mm的滤纸条)中，并用真空抽换气装置除氧，121°C高压蒸汽灭菌。
FeCl3配制成lg/L的储存液。按比例称取剩余相应药品倒入事先装有部分自来水的烧杯中，药品充分溶解后用自来水定容至990ml，加入6ml的FeCl3储存液，调pH至7. 2， 最后定容到1000ml。
复合菌系的富集培养将1. Og厌氧活性污泥接入到灭好菌的培养基中，放入65°C 培养箱中静置培养。滤纸分解后用相同培养条件逐次转接培养。在转接过程中，菌系对滤纸的分解能力不断加强。转接4-5次后，最终在20小时之内即可将滤纸条完全泥化。将富集分离到的纤维素分解复合菌系保藏(该菌名称为菌种名称为ThermoanaercAacterium sp.L-D保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址武汉大学内，保藏日2008年10月17日， 保藏登记号CCTCC NO :M208166)。
实施例2、复合菌系中微生物种群组成进行分析
本发明采用16S rDNA克隆文库技术分析复合菌系中微生物种群组成。技术路线为
总DNA提取一16S rDNA片段扩增一与载体连接一转化大肠杆菌一
筛选阳性克隆一酶切分型一测定序列一Blast比较分析
总DNA 的提取将 Iml 培养液放入 1. 5ml Eppendorf 管中，12000rpm，4°C离心 5min 收集菌体，用IXTES洗涤菌体2-3次。将菌体重新悬浮于435 μ 1 TES中打散菌体，加入溶菌酶(20mg/ml)125y 1，蛋白酶K(10mg/ml)2. 5μ 1，37°C水浴轻振保温4小时，加入50 μ 1 20% SDS,于37°C水浴轻振保温30分钟，加入5M NaC104 125 μ 1，用等体积(560 μ 1)酚一氯仿一异戊醇05 24 1)抽提3-4次至界面无蛋白膜出现。吸取上层水相置于冰浴中加入1/10体积的3Μ NaAc-EDTA-Na2,加入2倍体积冷无水乙醇，翻转混勻，冰浴5min。 12000rpm离心20min沉淀DNA。加入70%乙醇脱盐，4°C过夜放置，7000rpm离心lOmin，吸出乙醇。风干，加二次蒸馏水溶解。电泳检查，调DNA浓度为25 μ g/ml。
PCR扩增16S rDNA部分序列
选取通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘)和 1492R(5' -GGTTAC CTTGTT ACG ACT T_3')
PCR反应体系(50 μ 1)
5Xbuffer10 μ 1
Mg2+(25mM)3 μ 1
dNTP(IOmM)1 μ 1
530F(50yM)0. 5μ 1
1490R(50yM)0. 5μ 1
Template DNA1 μ 1
GoTaq(Promega)0. 25 μ 1
ddH2033. 75 μ 1
PCR反应条件
95 °C 2min
权利要求
1.一株高温、厌氧的纤维素分解细菌菌种，其名称为HiermoanaercAacterium sp. L-D, 保藏登记号为CCTCC NO :M208166，保藏日2008年10月17日，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址武汉大学内。
2.一种厌氧的纤维素分解细菌菌种的富集、分离培养方法。
3.—种纤维素分解菌降解稻草的方法。
4.复合菌系分解稻草所得的产物作为碳源培养SRB的方法。
5.权利要求1所述的一株高温、厌氧的纤维素分解细菌菌种，其特征在于该菌种是厌氧细菌复合菌系，通过利用16S rDNA克隆文库技术分析菌种中微生物种群组成表明， iM M M Thermoanaerobacterium polysaccharoIyticum> Τ. thermosaccharoIyticum> Τ. aciditolerans、Τ. thermosulfurigenes 4种不同的细菌组成，所占比例分别为37. 5%, 37. 5% 12. 5 和 12. 5%。
6.权利要求1所述的一株高温、厌氧的纤维素分解细菌菌种，其特征在于该菌种的工作温度为60-70°C。
7.根据权利要求2所述方法，其特征在于富集、分离培养该纤维素分解菌的培养基成分为酵母粉，l"5g ；氯化铵，0. 5-2. 5g ；硫酸镁，0. 5-2g ；磷酸氢二钾，0. 1-0. 5g ；三氯化铁， l-5mg ；氯化钠，2-4g ；普通自来水，IOOOml ；ρΗ，7· 0-8. 0。滤纸
8.权利要求3所述的一种纤维素分解细菌菌种对稻草分解的方法，其特征在于将稻草切成Icm的小段，加入1 % NaOH溶液浸泡M小时后用0. 5%的HCl清洗3次，将3% (w/ ν)装入厌氧管中替代滤纸条，用酵母粉，3g ;Κ2ΗΡ04,1. 5g ；MgSO4 · 7H20, Ig ；NaCl,2g ；NH4Cl, 0.68疋冗13，0.0058;仏自来水，？!1为7.5配制成培养基并分装、除氧、灭菌，5(% (ν/ν)的量接种本发明的厌氧复合菌系，65°C培养箱中静置培养，2-3周后大部分稻草被分解。
9.权利要求4所述的复合菌系分解稻草所得的产物作为碳源培养SRB的方法，其特征在于培养SRB时，降解产物用量为20-40% (10-20ml)
全文摘要
本发明提供一株高温、厌氧的纤维素分解细菌菌种(Thermoanaerobacterium sp.L-D，保藏登记号为CCTCC NOM208166，保藏日2008年10月17日，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址武汉大学内)，该菌种对滤纸具有很强的分解能力，对稻草亦表现了较强的分解能力，同时提供该种厌氧的纤维素分解细菌菌种的富集、分离培养的培养基，并将该复合菌系降解稻草的产物用于培养SRB的方法。
文档编号C12N1/20GK102533580SQ20101061853
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日
发明者刘兴宇, 刘文彦, 张跃红, 陈勃伟 申请人:北京有色金属研究总院