本发明涉及一种联产丙酮酸和α-酮戊二酸的重组光滑球拟酵母，属于发酵工程技术领域。
背景技术：
酮酸是分子中同时含有羧基和酮基的化合物。根据分子中羧基和酮基的相对位置可分为α、β-酮酸，它们是一类在生物体内拥有重要作用的有机酸，同时目前社会对其需求量也不断在增加，其广泛应用于日化，食品，医疗，农业等行业。其中α酮酸是羧基在α碳原子上的的酮酸，丙酮酸是最简单的α酮酸。丙酮酸作为生物代谢的中间产物，处于各代谢途径的中间环节，是糖酵解的终产物；通过脱氢脱羧反应转化为TCA循环的起始物质乙酰-CoA；在丙酮酸羧化酶作用下生成TCA循环的中间产物草酰乙酸；通过转氨基作用生成丙氨酸等。同样，α-酮戊二酸作为例外一种重要的酮酸，是细胞内氮代谢的主要调控者。α-酮戊二酸作为谷氨酸的前体，与脯氨酸、精氨酸、鸟氨酸、多巴胺的分泌紧密相关，能有效维持胞内的“谷氨酸池”(glutamine pools)，并在中间代谢过程中决定着氮代谢流走向合成或者分解，有效的维持体内氮代谢平衡。α-酮戊二酸还与蛋白质、脂类、维生素合成以及能量代谢紧密相关。
目前对其上述两种重要的酮酸的生产主要是化学合成法和微生物发酵法两大类。其中微生物发酵法相对于其化学合成有更多的优点，如原料的转化率高、污染小、成本低等优点。但其两种酮酸的微生物发酵采用的是独立的发酵操作。由于微生物合成目标产物时，不可避免的存在副产物的积累，而两种酮酸在生物体的转化是极其容易，因而其单独发酵生产其中的某一种酮酸时，不可避免的要消除例外一种酮酸的存在，但是消除副产物的努力通常会显著降低转化率和生产强度，从而影响整个发酵过程的经济性。
如何将其两种酮酸在一种微生物中进行联产发酵，将对整个酮酸工业的发展有这重要的作用。联产发酵技术作为一种高效、经济的发酵技术成为了国内外研究的热门。通过微生物联产发酵获得高产丙酮酸和α-酮戊二酸，其最关键是要有一株高产丙酮酸和α-酮戊二酸的菌株。目前其两种酮酸的联产发酵鲜有文献报道。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明通过在高产丙酮酸的光滑球拟酵母菌株中过量表达丙酮酸激酶，加强丙酮酸和α-酮戊二酸合成的共同合成途径，从而对其两种酮酸进行高效率联产发酵。
本发明的第一个目的是提供一种联产丙酮酸和α-酮戊二酸的重组菌，所述重组菌是以光滑球拟酵母为宿主，以pY26-TEF-GPD为载体，过表达丙酮酸激酶CDC19基因。
在本发明的一种实施方式中，所述CDC19基因是NCBI上Gene ID为851193的CDC19基因。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以缺失了URA3基因的光滑球拟酵母T.glabrata CCTCC M202019为宿主，表达NCBI上Gene ID:851193的CDC19。
在本发明的一种实施方式中，所述CDC19基因是以酿酒酵母菌株S288c基因组为模板扩增得到的。
本发明的第二个目的是提供所述重组菌的构建方法，是以缺失了URA3基因的光滑球拟酵母T.glabrata CCTCC M202019为宿主，以pY26-TEF-GPD为载体，表达NCBI上Gene ID为851193的CDC19基因。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌按如下方法构建：
(3)将目的片段CDC19经过限制性内切酶Not I和Pac I双酶切消化后，并将CDC19定向克隆到表达质粒pY26-TEF-GPD中，得到重组酵母表达质粒pY26-CDC19；
(4)重组质粒pY26-CDC19电转化受体菌T.glabrata CCTCC M202019(TgU-)，在不含尿嘧啶的培养基中进行筛选，得到重组菌TgU-(pY26-CDC19)。
在本发明的一种实施方式中，所述酵母表达质粒pY26-TEF-GPD为大肠杆菌-酵母之间的穿梭载体，在大肠杆菌中选择标记为Ampr，而在酵母中选择标记为尿嘧啶缺陷型互补。
本发明的第三个目的是提供一种联产丙酮酸和α-酮戊二酸的方法，是将所述重组菌应用于丙酮酸和α-酮戊二酸的生产。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是应用所述重组菌接种至发酵培养基，在30℃，200～220rpm条件下进行发酵培养。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌经过活化。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基每L中含有：葡萄糖50-120g，尿素0-5g，MgSO4.7H2O 0-1g，KH2PO40-5g，CH3COONa 0-5g，微量元素液10ml，维生素液10ml，初始pH＝5.5；所述微量元素液每L含有MnCl2·4H2O 0-12g，FeSO4·7H2O 0-2g，CaCl2·2H2O 0-2g，CuSO4·5H2O 0-0.1g，ZnCl20-1g；所述维生素液每L含有：生物素0-0.01g，硫胺素0-2mg，吡哆醇0-0.2g，烟酸0-2g。
在本发明的一种实施方式中，所述微量元素液的配制方法为：将MnCl2·4H2O 0-12g，FeSO4·7H2O 0-2g，CaCl2·2H2O 0-2g，CuSO4·5H2O 0-0.1g，ZnCl20-1g用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。
在本发明的一种实施方式中，所述维生素液的配制方法为：将生物素0-0.01g，硫胺素0-2mg，吡哆醇0-0.2g，烟酸0-2g用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。
在本发明的一种实施方式中，所述接种的接种量按体积比为5-10％。
本发明还要求保护所述方法在日化、食品、医药、农业领域生产含丙酮酸和/或α-酮戊二酸的产品中的应用。
有益效果：
本发明的方法可对其丙酮酸和α-酮戊二酸进行高效的联产发酵；由于要想同时获得其2种酮酸，其共同的合成途径通量必须足够大，本发明通过过量表达其2种酮酸共同合途径上的关键酶-丙酮酸激酶，加强其二者的合成效率和通量，来达到对其2种酮酸进行高效联产发酵的目的。总酸产量(丙酮酸和α-酮戊二酸)、总酸转化率和总酸生产强度分别提高了112.2％、115.6％和155.6％，最重要的是重组菌TgU-(pY26-CDC19)的α-酮戊二酸产量从其改造之前的0g/L增加到了30.1g/L。此外，相对于解脂亚洛酵母WSH-Z06(甘油84h耗尽，α-酮戊二酸和丙酮酸浓度达到32.8，30.4g/L，底物转化率为63％，生产强度为0.75g/L·h)，本发明的联产方法使丙酮酸和α-酮戊二酸生产周期缩短了24h，总酸量提高了31.6％，生产强度提高了84.0％。
具体实施方式
菌株和质粒：光滑球拟酵母(T.glabrata CCTCC M202019，TgU-)其为烟酸、生物素、硫胺素、盐酸吡哆醇，尿嘧啶5种营养缺陷型菌株(即在T.glabrata CCTCC M202019的基础上敲除了Ura基因)，已进行保藏。酵母表达质粒pY26-TEF-GPD为大肠杆菌-酵母之间的穿梭载体，在大肠杆菌中选择标记为ampr，而在酵母中选择标记为尿嘧啶缺陷型互补。
细胞干重的测定：取一定量的菌悬液于10mL容量瓶中，加入2mL盐酸(2mol/L)溶解悬液中的碳酸钙，加去离子水定容到10mL，充分混匀，用UV 7500型可见光分光光度计，于660nm处测定OD值，利用细胞干重标准曲线计算出细胞干重。
丙酮酸、α-酮戊二酸和葡萄糖的测定：高效液相色谱(HPLC)。仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)，色谱条件：色谱柱：Aminex HPX-87H ion exchange column，流动相：5mM H2SO4，流速：0.6mL/min，柱温：40℃，进样量：10μL，紫外检测器波长：210nm(检测丙酮酸)，示差折光检测器：检测葡萄糖，样品制备：1mL发酵液于12,000rpm下离心5min，上清经过适当的稀释处理和经0.22μL滤膜过滤后，进行高效液相色谱分析。
培养基：种子培养基(g/L)：葡萄糖30g，植物蛋白胨10g，磷酸二氢钾1.0g，七水硫酸镁0.5g，固体培养基添加20g琼脂。115℃灭菌15min。发酵培养基(g/L)：葡萄糖120g，尿素3.86g，MgSO4.7H2O 0.8g，KH2PO42g，CH3COONa 3g，微量元素液(过滤除菌)10ml，维生素液(过滤除菌)10ml，于115℃下灭菌15min。40g/L的碳酸钙(单独灭菌)被添加用来调节pH。微量元素液：MnCl2·4H2O 12g，FeSO4·7H2O 2g，CaCl2·2H2O 2g，CuSO4·5H2O 0.05g，ZnCl20.5g，用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。维生素液：生物素0.004g，硫胺素0.75mg，吡哆醇0.04g，烟酸0.8g，用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。
实施例1：酿酒酵母CDC19的扩增与表达质粒的构建
以酿酒酵母S288c基因组为模板，PCR扩增得到目的基因CDC19片段，通过琼脂糖凝胶电泳得到约1500bp的特异片段，目的基因CDC19经过限制性内切酶Pac I和Not I双酶切消化后，浓缩纯化，将CDC19基因定向克隆到表达质粒pY26-TEF-GPD中，得到重组酵母表达质粒pY26-CDC19，将上述重组表达质粒转化到感受态细胞JM109并涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上。PCF引物如下：
CDC19(F)-1：TCCCCCGGGATGTCTAGATTAGAAAGATTGACCTCATTA
CDC19(R)-1：CCCAAGCTTTTAAACGGTAGAGACTTGCAAAGTG
实施例2：重组菌的构建与鉴定
由于上述重组质粒pY26-CDC19上带有Ura3基因，将重组酵母质粒pY26-CDC19)电击转化到受体菌TgU-(即缺失了Ura基因的T.glabrata CCTCC M202019)，得到在不加尿嘧啶的基础培养基上正常生长的重组菌TgU-(pY26-CDC19)。
实施例3：重组菌与对照菌对照发酵实验
挑取重组菌TgU-(pY26-CDC19)和含有空质粒pY26-TEF-GPD的TgU、和解脂亚洛酵母WSH-Z06-(作为对照菌)的单菌落分别于种子培养基上活化培养18-24h，以5-10％(体积比)的接种量，将上述活化培养好的种子液接种到发酵培养基中，在30℃，400-600rpm条件下进行发酵培养。发酵结果如表1所示，相对于对照菌TgU-(pY26-TEF-GPD)，总酸产量(丙酮酸和α-酮戊二酸)、总酸转化率和总酸生产强度分别提高了112.2％、115.6％和155.6％，最重要的是重组菌TgU-(pY26-CDC19)的α-酮戊二酸产量从其改造之前的0g/L增加到了30.1g/L。相对于解脂亚洛酵母WSH-Z06(甘油84h耗尽，α-酮戊二酸和丙酮酸浓度达到32.8，30.4g/L，底物转化率为63％，生产强度为0.75g/L·h)，联产周期缩短了24h，总酸量提高了31.6％，生产强度提高了84.0％。
表1重组菌TgU-(pY26-CDC19)与对照菌TgU-(pY26)的发酵对比
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种联产丙酮酸和α-酮戊二酸的重组光滑球拟酵母
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1503
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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acctccatca ttggtaccat cggtccaaag accaacaacc cagaaacctt ggttgctttg 120
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aagtctgtca ttgacaacgc cagaaagtcc gaagaattgt acccaggtag accattggcc 240
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tacccaatcc caccaaacca cgaaatgatc ttcaccaccg atgacaagta cgctaaggct 360
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