一种白色念珠菌感染鸡模型建立的方法与流程

本发明属于医药生物技术领域，具体地涉及一种白色念珠菌感染鸡模型建立的方法。

背景技术：

念珠菌病是由念珠菌属的假丝酵母菌，主要是白色念珠菌感染而引起的一种真菌病，为人兽共患病。可侵犯人黏膜、皮肤、组织、器官等引起不同程度的白色念珠菌病。随着广谱抗生素、皮质激素类药物、抗肿瘤化疗和放疗、介入性诊疗手段的广泛应用，以及因病毒感染、消耗性疾病等原因降低机体抵抗力，白色念珠菌引起的感染逐渐增加，耐药菌株的出现使得临床治疗难度加大。

在自然条件下，多种禽类均易患，主要危害幼禽。该病原与机体长期共生，是一种条件病原菌，世界各地均有发生，发病率51.5-5%和死亡率60-0%不等。以前认为禽类白色念珠菌病往往是散发，一旦爆发，即可造成巨大损失。近年来，随着肉鸡规模化养殖的迅猛发展，白色念珠菌病在肉鸡生产中已广泛存在，并呈现新的流行及感染特征，给肉鸡生产带来了严重的影响。

国内外多采用实验动物小鼠和兔建立白色念珠菌感染模型，然而小鼠和兔均不是白色念珠菌自然宿主，虽然这些实验动物模型对研究白色念珠菌感染有参考价值，但毕竟小鼠和兔与自然宿主鸡是有差异，因此，采用临床分离白色念珠菌（HE株）感染鸡做模型，探讨鸡白色念珠菌感染会更接近实际、更准确。更重要是也为人白色念珠菌病研究提供动物模型。以往的白色念珠菌的药敏试验结果表明，体外药敏实验的结果与体内给药后的疗效有时并不一致。所以，建立的白色念珠菌感染鸡模型对于探讨白色念珠菌感染的发病机理；感染后免疫病理过程及念珠菌病治疗药物疗效的评价均具有重要意义。

技术实现要素：

本发明为解决现有技术不足，提供一种白色念珠菌感染鸡模型建立的方法，为鸡白色念珠菌感染防控提供基础，为人念珠菌病研究提供动物模型。

本发明采用的技术方案为：一种白色念珠菌感染鸡模型建立的方法，包括以下步骤：a、白色念珠菌株分生孢子悬液的制备：将临床分离的白色念珠菌株接种在马铃薯琼脂培养基上，在温度24~31℃下，培养2.5~4天；再用PBS缓冲液冲洗白色念珠菌菌落，收集白色念珠菌分生孢子或菌丝的冲洗液，5000转/min离心5分钟；弃上清液、收集沉淀、研磨；用PBS缓冲液稀释至白色念珠菌株分生孢子的浓度为0.5×10⁶~2×10⁶/mL，制成分生孢子悬液备用；

b、形成模型：刚出壳龄雏鸡，观察7日，7日龄时，嗉囊内注射上述分生孢子悬液1mL，将接种用雏鸡笼饲养，自由饮水和采食4~9天，造模成功。

进一步地，所述PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L。

进一步地，所述白色念珠菌株分生孢子的浓度为1×10⁶ /mL。

进一步地，所述a步骤中白色念珠菌株接种在马铃薯琼脂培养基上的温度为28℃下，培养时间为3天。

本发明获得的有益效果为：本发明采用临床分离白色念珠菌（HE株）感染鸡做模型，探讨鸡白色念珠菌感染会更接近实际、更准确。本发明感染条件易控，感染率高，感染稳定。

附图说明

图1为本发明实验组鸡嗉囊照片；

图2为本发明实验组鸡嗉囊培养白色念珠菌落照片；

图3为本发明实验组鸡嗉囊感染白色念珠菌革兰氏染色照片；

图4为本发明实验组鸡嗉囊组织病理照片；

图5为本发明空白对照组鸡嗉囊照片。

具体实施方式

验证实验：1、实验菌株：白色念珠菌HE菌株为临床分离株，在马铃薯琼脂平板上，菌落为圆形，乳白色，背面没有色素沉着。在显微镜下，菌体大小不一，为圆形或椭圆形的酵母样菌。该菌株经生化试验鉴定确认和16sRNA基因测序确认。

2、实验动物：健康7日龄雏鸡16只，由河北工程大学实验动物繁殖场提供，平均体重30±4g，雌雄各半。

3、实验动物的分组和菌株处理：按体重、性别随机分为2组，每组8只，A组为空白对照，给予糖皮质激素处理但不接种白色念珠菌；B组为实验组给予糖皮质激素处理，同时接种白色念珠菌HE株；

4、接种用白色念珠菌株分生孢子悬液的制备：从临床病料中分离的菌株，经生化试验鉴定确认和16sRNA基因测序确认为白色念珠菌，接种在马铃薯琼脂培养基上，在温度28℃下，培养3天；再用浓度为0.01mol/LPBS缓冲液冲洗白色念珠菌菌落，收集白色念珠菌分生孢子或菌丝的冲洗液，5000转/min离心5分钟；弃上清液、收集沉淀、研磨；用PBS缓冲液稀释至白色念珠菌株分生孢子的浓度为1×10⁶/mL，制成分生孢子悬液备用；

5、动物造模：选用健康雏鸡，嗉囊内注射1mL白色念珠菌分生孢子悬液。空白对照组注射无菌生理盐水。地塞米松注射液7.5mg/kg腹腔注射，隔日重复注射1次，共注射2次。每日观察实验动物接种后采食，生长等临床症状。于第5天、7天、9天、11天处死动物，取材进行大体病变，培养及组织病理学检查确认模型构建成功与否。

6、分离培养：于接种后第5天、7天、9天、11天处死动物后，取嗉囊，用棉签涂黏膜接种于含氯霉素和放线菌酮的马铃薯琼脂培养基。

7、组织病理检查：动物处死后，剪取嗉囊等组织，中性甲醛固定，石蜡包埋切片，行HE染色。

8、B组实验组实验结果

1）临床症状：嗉囊内注射分生孢子悬液后，鸡采食减少，体重减轻，嗉囊肿大。

2）大体病变：注射后5天，嗉囊有大量液体，黏膜有干酪样物，形成伪膜（图1），且5天后造模成功，第7天、9天、11天处死的鸡的嗉囊症状与第5天处死的鸡的嗉囊病变相同。

3）分离培养：在马铃薯琼脂培养基上，分离株菌落为圆形，乳白色，背面没有色素沉着（图2）。在显微镜下，菌体大小不一，为圆形或椭圆形的酵母样菌，如图3所示白色念珠菌革兰氏染色照片。

4）组织病理：在显微镜下鸡嗉囊角质层明显增厚，角质层有明显的炎性细胞浸润，有大量红染菌丝（图4）。

9、A组空白组实验结果

空白组鸡嗉囊正常，并未发生病变，如图5所示。