一种黑曲霉菌株及其发酵百药煎生成新成分的制备方法与应用与流程

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种黑曲霉及其发酵百药煎生成新成分的制备方法与应用。

背景技术：

百药煎始载于《丹溪心法》，为五倍子同茶叶等经发酵制成的块状物。性味酸甘，平。具有润肺化痰，生津止渴的功效。临床多用于治疗久咳痰多，咽痛，便血，久痢脱肛，口疮，牙疳，痈肿疮疡。目前发酵百药煎多采用复合菌固态发酵，由于复合菌在发酵过程中菌种的变化不清楚，且固体发酵具有发酵过程参数难以测定、过程控制困难，菌体生长、发酵以及代谢产物在发酵体系中分布不均等不足，导致产品稳定性较差、重复性较低，给百药煎的发酵过程带来不便，使百药煎质量不稳定。五倍子发酵成为百药煎后鞣质含量减少，没食子酸含量升高，选育一株优势菌株并研究其在百药煎发酵中的应用，并将发酵后升高的化学成分提取分离，结构鉴定，并对该成分抗肿瘤活性进行研究，能更好的控制百药煎的质量，为百药煎临床用药提供依据，保证其临床用药安全有效。

技术实现要素：

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种黑曲霉菌株及其发酵百药煎生成新成分的制备方法与应用，可有效解决固体发酵具有发酵过程参数难以测定、过程控制困难，菌体生长、发酵以及代谢产物在发酵体系中分布不均等不足，导致产品稳定性较差、重复性较低，给百药煎的发酵过程带来不便，百药煎质量不稳定的问题。

本发明解决的技术方案是，本发明所述黑曲霉菌株，其分类命名为曲霉(Aspergillus sp.)BYJ.H-1，已于2016年7月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2016376，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心。

其制备方法为：收集新鲜百药煎，采用稀释涂布平板法，分别用孟加拉红、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和酵母膏3种培养基，28℃恒温培养，共分离出2个属的6株菌种，通过发酵百药煎外观状态、液相分析，分离和筛选出使百药煎中没食子酸含量最高的黑曲霉BYJ.H-1；所述的百药煎是：将五倍子药材洗净，80℃干燥4h，粉碎，过80目筛，取茶叶粗粉1g于10-20mL沸水中煎煮15min，放至23-27℃，滤去茶渣，得茶汁，取茶渣、3mL茶汁与10g上述五倍子粉混匀，用润湿八层纱布封口于115℃灭菌30min，放凉，即得；

所述的孟加拉红培养基是由：蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g、琼脂20g、1/3000孟加拉红溶液100mL、蒸馏水1000mL和氯霉素0.1g制成；

所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基是由：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g和自来水1000ml制成；

所述的酵母膏培养基是由：酵母膏5g、蔗糖10g、琼脂粉14g于1000ml蒸馏水中，煎煮至沸，补足体积即可。

黑曲霉菌株发酵百药煎生成新成分的制备方法，包括以下步骤：

1)新成分2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖的制备：将五倍子药材洗净，80℃干燥4-10h，粉碎，过80目筛，取茶叶粗粉1g于20mL沸水中煎煮15min，放至23-27℃，滤去茶渣，得茶汁5-10mL，取茶渣、3mL茶汁与10g上述五倍子粉混匀，用润湿八层纱布封口于115℃灭菌30min，放凉，得百药煎软材，备用；将黑曲霉菌株于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化3d，取50mL蒸馏水于200mL锥形瓶中121℃灭菌30min，放凉，用灭菌的竹签刮2-4环孢子于灭菌的蒸馏水中制成10⁸个/mL以上的孢子菌悬液，180r/min振摇2h，取五倍子粉重量5-8％的孢子菌悬液加入处理好的百药煎软材中，搅拌均匀后于35-40℃、85％的湿度发酵60-66h，干燥，即得新成分2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖，所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基是由：马铃薯去皮200g切块，煮至一捣即烂，过滤，滤液再加葡萄糖20g，琼脂粉15g，煮至沸腾，补足蒸馏水至1000mL制成；

2)新成分2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖的分离纯化：取上述得到的2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖细粉，70℃水浴，甲醇提取3次，过滤，滤液浓缩至干，加水溶解，过滤，滤液上大孔树脂柱，然后甲醇-水系统洗脱，具体是：先分别用水、10％甲醇(V/V)、20％甲醇(V/V)、30％甲醇(V/V)、50％甲醇(V/V)梯度洗脱，将得到的10％甲醇洗脱液，使用直径20cm的C18高压制备液相柱，进样5L，使用流动相乙腈：0.2％甲酸＝13:87，检测波长280nm、流速600ml/min进行洗脱分离，得到不同组分，分别分析检测；将含有2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖的组分使用直径10cm的C18高压制备液相柱，进样量1.25L，按流动相乙腈：0.2％甲酸＝13:87、检测波长280nm、流速250ml/min进一步洗脱分离，将得到的组分进行检测合并，浓缩结晶，50℃减压干燥，得纯化2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖。

本发明中2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖，为首次发现的新化合物，通过采用大孔树脂柱，制备液相对黑曲霉BYJ.H-1发酵百药煎含量升高成分进行分离纯化，利用核磁共振仪和高分辨质谱仪对化合物结构进行鉴定，得到2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖，该化合物存在α和β两种构型，利用肺腺癌A549细胞及人大细胞肺癌NCI-H460细胞2种癌细胞证明2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖有抗肿瘤活性。

本发明利用黑曲霉CCTCC M 2016376发酵百药煎鞣质的转化率大大提高，并提供了具体的工艺技术参数，为百药煎的质量控制及规范化生产提供依据，利用细胞模型证明2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖有抗肿瘤活性，为开发新的抗肿瘤药提供了技术保障。

附图说明

图1为本发明黑曲霉CCTCC M 2016376的系统发育树。

图2为本发明黑曲霉CCTCC M 2016376的形态学照片。

图3为本发明黑曲霉CCTCC M 2016376的显微照片。

图4为本发明2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖7 ¹H-NMR(acetone-d₆)谱。

图5为本发明2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖¹³C-NMR(acetone-d₆)谱。

图6为本发明2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖DEPT135谱。

图7为本发明2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖¹H-¹H COSY(acetone-d₆)谱。

图8为本发明2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖HSQC(acetone-d₆)谱。

图9为本发明2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖HMBC(acetone-d₆)谱。

图10为本发明2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖高分辨质谱图。

图11为本发明A549和NCI-H460细胞形态图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1

黑曲霉菌株分离筛选方法：

收集新鲜百药煎，采用稀释涂布平板法，分别用孟加拉红、马铃薯葡萄糖琼脂培养基和酵母膏3种培养基，28℃恒温培养，共分离出2个属的6株菌种，将分离的菌种(曲霉属菌株HM1、HM2、HM3、HM5、HM7、酵母菌YJ1)分别于PDA上活化3d，取50ml蒸馏水于200ml锥形瓶中121℃灭菌30min，放凉，用灭菌的竹签刮2-4环孢子于灭菌的蒸馏水中制成10⁸个/ml以上的孢子菌悬液，180r/min振摇2h，吸取孢子菌悬液5ml加入百药煎中，用灭菌的玻璃棒搅拌均匀于30℃、85％的湿度发酵60h，取出，烘干，测没食子酸含量；

所述的百药煎是：将五倍子药材洗净，80℃干燥4h，粉碎，过80目筛，取茶叶粗粉1g置于10mL沸水中煎煮15min，放至25℃，滤去茶渣，茶汁体积为8mL，取茶渣、3ml茶汁与10g上述五倍子粉混匀，用润湿八层纱布封口于115℃灭菌30min，放凉，备用；结果见下表：

表1各菌株发酵百药煎的外观性状描述及没食子酸含量

注：空白对照：百药煎软材115℃灭菌30min,30℃发酵60h

实施例2

本发明在具体实施时，黑曲霉菌株发酵百药煎生成新成分的制备方法，包括以下步骤：

1)新成分2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖的制备：将五倍子药材洗净，80℃干燥4h，粉碎，过80目筛，取茶叶粗粉1g于20mL沸水中煎煮15min，放至23-27℃，滤去茶渣，得茶汁8mL，取茶渣、3mL茶汁与10g上述五倍子粉混匀，用润湿八层纱布封口于115℃灭菌30min，放凉，得百药煎软材，备用；将黑曲霉菌株于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化3d，取50mL蒸馏水于200mL锥形瓶中121℃灭菌30min，放凉，用灭菌的竹签刮2-4环孢子于灭菌的蒸馏水中制成10⁸个/mL以上的孢子菌悬液，180r/min振摇2h，取五倍子粉重量5％的孢子菌悬液加入处理好的百药煎软材中，搅拌均匀后于40℃、85％的湿度发酵60h，干燥，即得新成分2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖，经检测，没食子酸的含量达到30.22％；

2)新成分2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖的分离纯化：取上述得到的2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖细粉，70℃水浴，甲醇提取3次，过滤，滤液浓缩至干，加水溶解，过滤，滤液上AB-8大孔树脂柱，甲醇-水系统洗脱，具体是：先分别用水、10％甲醇(V/V)、20％甲醇、30％甲醇、50％甲醇梯度洗脱，将得到的10％甲醇洗脱液，使用直径20cm的C18高压制备液相柱，进样5L，使用流动相乙腈：0.2％甲酸＝13:87，检测波长280nm、、流速600ml/min进行洗脱分离，得到不同组分，分别分析检测；将含有使用2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖的组分使用直径10cm的C18高压制备液相柱，进样量1.25L，按流动相乙腈：0.2％甲酸＝13:87检测波长280nm、流速250ml/min进一步洗脱分离，将得到的组分进行检测合并，浓缩结晶，50℃减压干燥，得纯化2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖。

实施例3

本发明在具体实施时，黑曲霉菌株发酵百药煎生成新成分的制备方法，包括以下步骤：

1)新成分2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖的制备：将五倍子药材洗净，80℃干燥8h，粉碎，过80目筛，取茶叶粗粉1g于20mL沸水中煎煮15min，放至25℃，滤去茶渣，得茶汁，取茶渣、3mL茶汁与10g上述五倍子粉混匀，用润湿八层纱布封口于115℃灭菌30min，放凉，得百药煎软材，备用；将黑曲霉菌株于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化3d，取50mL蒸馏水于200mL锥形瓶中121℃灭菌30min，放凉，用灭菌的竹签刮2-4环孢子于灭菌的蒸馏水中制成10⁸个/mL以上的孢子菌悬液，180r/min振摇2h，取五倍子粉重量6％的孢子菌悬液加入处理好的百药煎软材中，搅拌均匀后于38℃、85％的湿度发酵62h，干燥，即得新成分2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖；

2)新成分2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖的分离纯化：取上述得到的2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖细粉，70℃水浴，甲醇提取3次，过滤，滤液浓缩至干，加水溶解，过滤，滤液上大孔树脂柱，然后甲醇-水系统洗脱，具体是：先分别用水、10％甲醇(V/V)、20％甲醇、30％甲醇、50％甲醇梯度洗脱，将得到的10％甲醇洗脱液，使用直径20cm的C18高压制备液相柱，进样5L，使用流动相乙腈：0.2％甲酸＝13:87，检测波长280nm、、流速600ml/min进行洗脱分离，得到不同组分，分别分析检测；将含有2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖的组分使用直径10cm的C18高压制备液相柱，进样量1.25L，按流动相乙腈：0.2％甲酸＝13:87检测波长280nm、流速250ml/min进一步洗脱分离，将得到的组分进行检测合并，浓缩结晶，50℃减压干燥，得纯化2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖。

本发明对黑曲霉菌株进行了分类鉴定，并对新化合物进行了抗肿瘤活性研究，相关实验资料如下：

一、黑曲霉CCTCC M 2016376的鉴定

为进一步确定CCTCC M 2016376的分类学地位，本发明采用传统分类方法和分子生物学分类方法对该菌株进行了分类鉴定。

1形态观察用培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA固体培养基)：马铃薯去皮200g切块，煮至一捣即烂，过滤，滤液再加葡萄糖20g，琼脂粉15g，煮至沸腾，补足蒸馏水至1000mL，分装于锥形瓶中，待灭菌。

孟加拉红培养基：孟加拉红培养基35g，加蒸馏水1000mL煎煮至沸，补足水分至1000mL。分装于锥形瓶中，待灭菌。

沙保弱培养基(SDA培养基)：蛋白胨10g，葡萄糖40g，营养琼脂14-15g，蒸馏水1000mL。

以上培养基于高压蒸汽灭菌器中121℃灭菌20min，备用。

2引物

采用真菌通用引物由上海生工生物工程有限公司合成。其序列分别为：ITS 1(5′-TCCGTAGGTGAACCTG CGG-3′)和ITS 4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对5.8S-ITS区段进行扩增

3试验方法

3.1形态学观察

3.1.1菌落形态观察

用接种针取少量孢子，采用三点接种法分别接种于PDA培养基、SDA培养基以及孟加拉红培养基上，然后置于28℃恒温培养箱中培养，观察并描述菌种在培养基中菌落形态与生长情况，并做照相记录(如图2所示)。

3.1.2显微结构观察

采用插片培养法将需鉴定真菌接种于盖玻片与培养基交界处，使菌丝生长过程中能够附着到盖玻片上，置于28℃恒温培养箱中培养，从次日起每天用无菌镊子拔取盖玻片，经乳酸-棉兰染液染色后，置于显微镜下观察真菌结构(如图3所示)。

3.2黑曲霉CCTCC M 2016376的分子生物学鉴定

3.2.1黑曲霉CCTCC M 2016376基因组DNA的提取

将冷冻保存的实验菌种于固体PDA上28℃活化3d,将活化菌株接种于液体PDA培养基中，28℃摇瓶培养48h，检查无污染后，按照生工试剂盒说明书提取DNA,2％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，将提取的DNA-20℃保存备用。

3.2.2黑曲霉CCTCC M 2016376基因的扩增

将上述制备的基因组DNA作为PCR扩增的模板，用引物ITS 1(5′-TCCGTAGGTGAACCTG CGG-3′)和ITS 4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对真菌基因组DNA中的18S rDNA基因片段进行扩增。

50μL的PCR反应体系为：Mix25μL、DNA模板3μL、引物ITS 1(10μmol·L-1)μL、ITS(10μmol·L-1)4μL、ddRnase水20μL

PCR反应条件为：预变性94℃4min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，30次循环；总延伸72℃8min。反应完成后用2％琼脂糖凝胶电泳检测。符合条件的PCR产物进行序列测定。

3.2.3测序结果的比对分析

测序结果序列通过BLAST与GenBank数据库中的已有效发表的菌株序列进行比对，下载相似度较高的已有效发表菌株的18S rDNA基因序列，用MEGA5.03软件对序列进建系统发育树的行构(如图1所示)，确定菌株的分类学地位。

4试验结果

4.1CCTCC M 2016376的形态学观察结果

黑曲霉菌株CCTCC M 2016376在PDA上生长较快孢子褐色或者浅褐色，平铺整个菌落表面，较厚重，边缘白色粉状，背面有色素为浅黄色；

在SDA上菌落呈椭圆形或者类圆形，菌落中心白色，四周褐色或浅褐色孢子密集，边缘稀疏，菌毛黄白色，有皱褶样纹理，背面菌落中心有黄色色素产生，透明，直径约61mm；

在孟加拉红上圆形或类圆形，菌落呈黄色，浅褐色孢子分布不均匀，四周有放射状纹理，菌落边缘菌落表面浅黄色，具放射状纹理，背面红黄色，直径约28mm。

镜下观察黑曲霉菌株CCTCC M 2016376菌丝有隔，多分枝，分生孢子梗着生在足细胞上，具疣状突起，足细胞肥大透明，顶囊球形，双层小梗，部分可育，分生孢子球形。

4.2CCTCC M 2016376的分子生物学鉴定结果

4.2.1CCTCC M 2016376的18SrDNA序列测定结果

测序结果该片段由559个碱基组成，得到黑曲霉CCTCC M 2016376的18S rDNA序列为：GATCGACGCGGGTCTTTGGGCCACCTCCCATCCGTGTCTATTGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGGGGCGCCTCTGCCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCATTCTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAA4.2.2同源进化树构建

通过BLAST比对，在GenBank数据库中下载与待测黑曲霉18S rDNA基因序列相似度较近的序列，用MEGA5.0软件对黑曲霉18S rDNA基因序列进行多重序列比对，构建系统发育树。二2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖含量的测定

按本发明制备方法制备的2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖，经检测，没食子酸的含量达到30.22％。

三2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖进行核磁共振及质谱检测

取白色粉末10mg，氘代丙酮溶解，核磁共振检测，得到¹H-NMR(acetone-d₆)，¹³C-NMR(acetone-d₆)，DEPT135，¹H-¹H COSY(acetone-d₆)，HSQC(acetone-d₆)，HMBC(acetone-d₆)谱(如附图4-9所示)。称取白色粉末适量，甲醇溶解，高分辨质谱检测分子量(如图10所示)。

四2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖的抗肿瘤活性研究

精密称取2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖15.91mg，加入DMSO(二甲基亚砜)使溶解，配制成1mmol/L的母液，用完全培养液稀释成100umol/L、300umol/L、500umol/L、700umol/L、900umol/L的药液(含1％DMSO)过滤除菌。

精密称取MTT(噻唑蓝)粉末约100mg溶于20mLPBS(磷酸缓冲盐溶液)中，过滤除菌。

将生长状态良好的NCI-H460和A549细胞消化后，A549和NCI-H460细胞形态图如图11所示，用含10％胎牛血清、100U/mL青链霉素混合液的RPMI-1640培养基配成单个细胞悬液，以1×10⁵个ml^-1细胞接种于96孔培养板中，每孔200ul，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h,、吸弃旧培养液，每孔加入配制好的药液200uL，每个浓度平行5孔，培养24h、48h、72h、96h后，每孔加入20ulMTT液(5mg/ml)，继续培养4h后弃上清，每孔加入150ulDMSO，振荡5min，使甲瓒结晶溶解完全，用酶标仪492nm波长测各孔OD值，以每组各孔平均吸光度OD值的平均值作为各组OD，按以下公式计算2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖药液对NCI-H460和A549细胞的抑制率：抑制率(IR％)＝(1－给药组OD均值/空白对照组OD均值)×100％。

实验结果表明，2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖浓度为700umol/L48h对A549和NCI-H460细胞生长抑制作用最强。

综上，本发明通过分离和筛选出使百药煎中没食子酸含量最高的黑曲霉BYJ.H-1，使得黑曲霉CCTCC M 2016376发酵百药煎鞣质的转化率大大提高，并提供了具体的工艺技术参数，为百药煎的质量控制及规范化生产提供依据，首次发现的新化合物2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖，利用细胞模型证明了2,4,6-三-O-没食子酰-D-葡萄糖具有抗肿瘤活性，为开发新的抗肿瘤药提供了依据，具有实际的临床意义，适合大范围的推广和应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南中医药大学

<120> 一种黑曲霉菌株及其发酵百药煎生成新成分的制备方法与应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 559

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 1

gatcgacgcg ggtctttggg ccacctccca tccgtgtcta ttgtaccctg ttgcttcggc 60

gggcccgccg cttgtcggcc gccggggggg cgcctctgcc ccccgggccc gtgcccgccg 120

gagaccccaa cacgaacact gtctgaaagc gtgcagtctg agttgattga atgcaatcag 180

ttaaaacttt caacaatgga tctcttggtt ccggcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc 240

gataactaat gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgag tctttgaacg cacattgcgc 300

cccctggtat tccggggggc atgcctgtcc gagcgtcatt gctgccctca agcccggctt 360

gtgtgttggg tcgccgtccc cctctccggg gggacgggcc cgaaaggcag cggcggcacc 420

gcgtccgatc ctcgagcgta tggggctttg tcacatgctc tgtaggattg gccggcgcct 480

gccgacgttt tccaaccatt ctttccaggt tgacctcgga tcaggtaggg atacccgctg 540

aacttaagca tatcaaaaa 559