一种高效降解烟嘧磺隆的黑曲霉菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种高效降解烟嘧磺隆的黑曲霉菌及其在土壤修复中的应用。本发明所述黑曲霉菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.8438。本发明涉及的黑曲霉菌能够在5天内将400mg·L-1的烟嘧磺隆完全降解，不污染环境，生态安全，是一株在受磺酰脲类除草剂污染土壤修复中有较高应用价值菌株，具备实际应用意义和价值。
【专利说明】一种高效降解烟嘧磺隆的黑曲霉菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物和环境保护领域，特别是涉及黑曲霉在受磺酰脲类除草剂污染土壤修复中的应用。
[0002]
技术背景
[0003]磺酰脲类除草剂是目前世界上使用量最大的一类除草剂，它是由美国杜邦公司于20世纪70年代研究成功，并于1982年首次开发出麦田除草剂氯磺隆，之后又开发出许多的高效、广谱、低毒、高选择性磺酰脲类除草剂。此类除草剂作用于植物的乙酰乳酸合成酶(ALS)，导致无法合成支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)，从而使细胞受到抑制，对许多一年生或多年生杂草有特效，广泛应用于防除稻田、大豆田、玉米田、麦类作物田、油菜田、草坪和其他非耕地杂草。由于该类除草剂对哺乳动物具有低的毒性，使用量很低，除草活性高等优点，在世界范围内普遍应用。不仅如此，磺酰脲之所以快速发展并被很好接受的原因还在于其与环境相容性好，该类除草剂应用面积在不断扩大，新的品种也不断产生，至今已有几十个品种被商品化。我国目前广泛应用的磺酰脲类除草剂品种主要有吡嘧磺隆、烟嘧磺隆、胺苯磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、苄嘧磺隆等，能防除大多数禾本科和阔叶杂草。
[0004]磺酰脲类除草剂自问世以来，为世界的农业生产作出了巨大的贡献，由于其具有极高的残留活性和选择性，在其使用过程中已遇到一些难题，最突出的就是对后茬作物的长残留药害问题，由于该类除草剂的迁移淋溶性较弱，当其残留达到一定剂量后就会对后茬作物造成药害。烟嘧磺隆、绿磺隆、甲磺隆已成为我国长残效除草剂品种。该类除草剂具有选择性强、生物活性高的优点，但其对不同作物的敏感性差异很大，例如在土壤中残留的氯磺隆和甲黄隆就很容易对后茬敏感作物产生药害。
[0005]农药在防治病虫害中发挥着重要的作用，随着农药的大量使用，农药特别是化学农药在其生产、运输、贮存、使用过程中对环境造成的污染也越来越严重。微生物的资源丰富、处理相对简单、容易进行筛选诱变和通过转基因技术构建高效能新菌株或者通过降解酶系统及降解酶的固定化可更有效的处理农药污染。农药的微生物降解研究开始于20世纪40年代末，60年代中后期由于大规模化学农药的使用带来了日益严重的环境污染问题，农药的微生物降解研究越来越受到重视。本课题组研究人员对除草剂、杀虫剂、杀菌剂、杀线虫剂的微生物降解进行了深入细致的研究，通过近几年研究工作，已经确定了土壤和水环境的农药降解中微生物起了主要作用，分离到一批能降解或转化某种农药的微生物类群，在实践生产及环境保护中具有重要的应用价值。
[0006]
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种新的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株,所述菌株对磺酰脲类除草剂有明显的降解作用。[0008]本发明所述的黑曲霉(Aspergillus niger)于2013年11月6日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCC N0.8438。
[0009]本发明所提供的黑曲霉是从烟嘧磺隆农药厂的污水处理池中分离得到的，其实验室命名为菌株 NDl (nicosulfuron degradation)。
[0010]将菌株NDl在PDA培养基上培养，肉眼观察菌落生长特征、测量菌落生长速度，光学显微镜下观察菌丝形状及孢子大小、形状、类型等。通过观察发现，自中伸出，直径15~20pm，长约1~3mm，壁厚而光滑。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状，直径2.5~4.0 μ m。分生孢子头球状，直径700~800 μ m,褐黑色。蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。根据《真菌鉴定手册》等方法初步鉴定菌株NDl为黑曲霉属，利用分子生物学技术对其ITS序列鉴定后该菌为黑曲霉Aspergillus niger。
[0011 ] 进一步地，本发明提供上述黑曲霉在受磺酰脲类除草剂污染土壤修复中的应用。
[0012]优选地，磺酰脲类除草剂为烟嘧磺隆。烟嘧磺隆是一种重要的磺酰脲类除草剂，可以防除一年生和多年生禾本科杂草、部分阔叶杂草。研究表明，对药敏感性强的杂草有禆草、狗尾草、野燕麦、反枝苋；敏感性中等的杂草有本氏寥、律草、马齿苋、鸭舌草、苍耳和苘麻、莎草；敏感性较差的杂草主要有藜、龙葵、鸭趾草、地肤和鼬瓣花。
[0013]进一步的，本发明的黑曲霉菌可以制成微生物菌剂，即将本发明的上述菌株接种于马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基，在25°C _30°C、摇床转数125r/min-150r/min的条件下，培养3-4天，并调节孢子浓度为I X IO6个/mL，即制得本发明黑曲霉菌的2级培养液；随后进行如下的固体发酵:将麸皮、稻草、玉米粉、稻壳按照12:6:2:1.5的比例添加到IL的三角瓶中，加入适量的水使之湿度达到100%后灭菌备用，将IOmL上述黑曲霉菌的2级培养液加入到三角瓶中在25°C -30°C发酵培养3-4天后制得本发明所述微生物菌剂。
[0014]本发明的效果
1、在400 mg -L-1烟嘧磺隆的PDA平板中，本发明的黑曲霉菌株对烟嘧磺隆有较强的降解作用，在37°C条件下培养Id后，产生透明圈。
[0015]2、将本发明所述菌株制成微生物菌剂后，对烟嘧磺隆有较强的降解作用，在培养
24h时开始降解烟嘧磺隆，培养到5 d即可将烟嘧磺隆完全降解。
【具体实施方式】
[0016]本发明公开了一种对烟嘧磺隆有较高降解作用的黑曲霉菌株，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数来实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，这些都被视为包括在被发明内。本发明所述的黑曲霉已经通过较规范的实施例进行了描述，相关人员明显能在不摆脱本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动和适当的变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0017]下面结合实施例，进一步阐述本发明。
[0018]实施例1本发明黑曲霉菌株的分离
1、水样中微生物的驯化处理与富集培养
向供试水样中添加烟嘧磺隆，使其含量为400 !!^?171，将其置于301:、150 r.HIirT1条件下驯化培养14 d，取5 mL经驯化的水样加入到50 mL含200 mg.L-1烟嘧磺隆的富集培养基中，置于30°C、150 r ^mirT1条件下振荡培养7 d，然后再取5 mL培养液，转移到50 mL含200 mg.L-1烟嘧磺隆的富集培养基中振荡培养，如此重复，共计5次。
[0019]2、可降解烟嘧磺隆微生物的菌株筛选
将上述经驯化后的含有水样微生物的培养基，将其均匀涂布到含有400 mg -L-1烟嘧磺隆的PDA平板上，在30°C条件下培养48~96 h后，挑取能产生透明圈的单菌落继续在PDA平板上纯化培养并保存菌种。
[0020]实施例2本发明所述黑曲霉菌株的鉴定 I形态学鉴定
根据《真菌鉴定手册》等方法，采用PDA培养基培养真菌，肉眼观察菌落生长特征、测量菌落生长速度，光学显微镜下观察菌丝形状及孢子大小、形状、类型等。通过观察发现，自中伸出，直径15~20pm，长约I~3_，壁厚而光滑。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状，直径2.5~4.0 μ m。分生孢子头球状，直径700~800 μ m,褐黑色。蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。根据《真菌鉴定手册》、等方法初步鉴定菌株NDl为黑曲霉属(Aspergillusniger )。
[0021]2分子生物学鉴定
ITS鉴定:将筛选菌株的孢子液接入ro液体培养基中，28°C摇床培养48 h，过滤获得菌丝，提取真菌基因组DNA。以提取的真菌DNA作为模板，以ITS5和ITS8引物对进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μ 1，反应体系为:基因组DNA IyL, 10XPCR buffer 2.5 μ L, NSl引物 I μ L，NS8 引物 I μ L，dNTPs 2 μ L, Taq 酶 0.25 μ L, ddH20 17.25 μ L。反应条件为:94°C 5 min，94°C 30 s，57°C 50 s，72°C 50 s ;循环 30 次；72°C 10 min。PCR 扩增产物送上海生工生物技术有限公司测序后，将获得的DNA序列，输入NCBI，用Blast程序与数据库中的所有序列进行比较分析。经过序列分析显示，与其同源的序列黑曲霉菌株序列，且同源性菌在94%以上，试验结果进一步说明本发明所分离的菌株属于黑曲霉(Aspergillusniger)。
[0022]实施例3本发明黑曲霉对烟嘧磺隆的降解效率
将烟嘧磺隆放于PDA培养基中，使其终浓度为400 mg.L-1，并制备PDA平板，待培养基完全凝固后，打取黑曲霉菌盘，将其放置于烟嘧磺隆PDA平板中央，置于37°C温箱中培养Id后，检测降解圈的有无及大小。
[0023]重复测试，基本方法同上，每平板点接3个菌株，各3次重复。
[0024]经检测发现本发明所述黑曲霉对烟嘧磺隆有较强的降解作用，24h后产生透明降解圈，降解圈的直径为3.8mm,如表1所不。
[0025]表1黑曲霉对烟嘧磺隆的降解圈:
【权利要求】
1.一种黑曲霉(Aspergillus niger)，其特征在于，保藏编号为CGMCC N0.8438，其于2013年11月6日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的黑曲霉在受磺酰脲类除草剂污染土壤修复中的应用。
3.根据权利要求2的用途，其特征在于，所述磺酰脲类除草剂为烟嘧磺隆。
4.一种微生物菌剂，其特征在于，将权利要求1所述的黑曲霉菌接种于马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基，在25°C -30°C、摇床转数125r/min-150r/min的条件下，培养3_4天，并调节孢子浓度为IXlO6个/mL，即制得所述黑曲霉菌的2级培养液；随后进行如下的固体发酵:将麸皮、稻草、玉米粉、稻壳按照12:6:2:1.5的比例添加到IL的三角瓶中，加入适量的水使之湿度达到100%后灭菌备用，将IOmL上述黑曲霉菌的2级培养液加入到三角瓶中在25°C -30°C发酵培养3-4天后制得微生物菌剂。
5.一种生物降解肥料，其特征在于，将权利要求1所述的黑曲霉的孢子液与无机肥料、有机肥料相混合制得，三者的重量比为1:6:13 ;所述无机肥料选自氮肥、磷肥和钾肥，所述氮肥为尿素或硫酸铵，所述磷肥为磷酸铵或磷酸钙，所述钾肥为硫酸钾或氯化钾；所述有机肥料为堆肥或沼气肥。
6.一种生物降解肥料，其特征在于，将权利要求1所述的黑曲霉的孢子液与微肥、有机肥料相混合制得，三者的重量比为1:3:6 ;所述微肥选自碳酸锰锌、硼镁肥、钥酸钠、螯合态铜或磷酸铵铁中的一种或多种；所述有机肥料为堆肥或沼气肥。
【文档编号】C12R1/685GK103805519SQ201310562398
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】赵斌, 张金林, 董金皋, 邢继红, 霍静倩 申请人:河北农业大学