水仙bes-ssr标记引物ga19及鉴定水仙品种的方法
【专利摘要】本发明涉及水仙BES-SSR标记引物GA19及鉴定水仙品种的方法，包括水仙BES-SSR标记引物GA19的设计及合成、水仙基因组总DNA提取、PCR总反应体系建立、PCR扩增程序、聚丙烯酰胺凝胶电泳条件和PCR扩增产物的检测鉴定。本发明采用水仙基因组BAC-末端序列开发的水仙BES-SSR标记，具有准确性高、容易判断，重复性好，不受环境因素的影响，而且谱带清晰等特点，是一种有效可靠的分子标记，用于水仙种质鉴定，具有取样量小、操作方便、结果可靠等优点。水仙BES-SSR标记引物GA19还可用于水仙品种指纹图谱绘制、遗传多样性分析、群居遗传结构研究和遗传连锁图谱分析等【技术领域】。
【专利说明】水仙BES-SSR标记引物GA19及鉴定水仙品种的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种BES-SSR标记引物及其用于作物品种鉴定的方法，具体涉及水仙BES-SSR标记引物GA19及鉴定水仙品种的方法，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002]水仙为石蒜科水仙属i^arcissus L.、多年生球根花丼,大多数原产于地中海沿岸及欧洲中部地区，约有40个原生种和许多变种，据英国皇家园艺学会统计，现约有I万多个园艺品种，其花色、花姿十分丰富，且部分水仙具宜人的香味，已成为世界各国广泛栽培的著名观赏兼药用花卉。然而，水仙具有夏季休眠特性，每年开花一次，从花型花色方面鉴定周期较长，耗时耗力，其鳞茎和叶型也十分相似，很难从生物学性状上将其有效地区分开来，对水仙的品种选育及鉴定方面都有着严重的影响。
[0003]陈林姣等(2002年)，朱震霞(2003 年)，Tucci 等(2004 年)，Lu Gang 等(2007)，郑琴芳等(2012年)利用第一代分子标记技术RAPD、ISSR、AFLP对中国水仙及水仙的遗传多样性及亲缘关系进行了不同程度的分析；Hodgins等(2007年)以欧洲野生黄花水仙为材料，利用富集文库筛选法得到8个微卫星标记，其操作较为复杂且费用较为昂贵；袁菊红(2011年)利用得到的10对SSR标记引物对中国石蒜属遗传多样性和亲缘关系进行了分析，其实验材料中涉及中国水仙且扩增出了带型。现有的基于水仙属的分子标记数量了了可见，远远不能满足水仙属分子生物学的研究，这将严重制约了水仙种质资源遗传多样性分析的准确性和遗传图谱构建的精确性。可见，开发新的分子标记鉴定技术，对水仙种质资源遗传多样性进行分析研究，为水仙新品种选育上提供有效的技术支持，在水仙育种及种质鉴定方面有着十分重要的意义。
[0004]`但是，现有的第一代分子标记如:扩增的限制性内切酶片段长度多态性标记(amplified fragment length polymorphism, AFLP),第一步需要制备高分子量基因组DNA，然后酶切找到特异片段，实验程序繁琐，操作复杂；限制性内切酶片段长度多态性标记(restriction fragment length polymorphism, RFLP),技术难度大，操作复杂,所需 DNA质量高，要经过Southern杂交且需选用单拷贝探针，标记数量少且多态性较低；随机扩增多态性DNA标记(randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)和简单序列重复标记(inter-simple sequence repeat, ISSR) 二者均为显性,不能区分是纯合还是杂合个体，且RAPD重复性较低，对DNA模板的质量要求很高，而水仙属植物叶片和鳞茎中含有大量的多糖多酚类物质，这将对DNA提取增加了难度，所以此法不适用于水仙标记分析。
[0005]简单重复序列(simple sequence repeat, SSR) 或称为微卫星DNA(microsatellite DNA),又称为短串联重复(short tandem repeats, STR)是指一类由几个(多为1-6个)碱基组成的基序(motif)串联而成的DNA序列，为第二代普遍认可的新型分子标记技术，其随机广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，大约每隔10_50kb的DNA序列中就会出现一个SSR位点。SSR标记具有高度的多态性且分布于整个基因组中，用于检测简单易操作，实验重复性高，所需模版DNA量少，仅需微量组织或者干组织样品，便于数据比较分析，SSR遵循孟德尔共显性遗传模式，能够区别纯合显性个体和杂合显性个体等诸多有点。目前SSR标记技术已成为构成遗传连锁图谱、研究群体遗传学、进行分子标记辅助育种、系谱分析、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测、目标性状分子标记筛选和法医鉴定的理想工具，已经广泛应用于拟南芥、大豆、棉花、花生、葡萄、小麦、水稻、番茄、甜菜和油菜等多种植物上。
[0006]目前，开发的SSR标记主要有G-SSR (基因组SSR)和EST-SSR (表达序列标签SSR)两种，而现有的水仙EST数据库中登录的水仙EST序列还很少，开发SSR标记远远不够，且利用EST序列开发获得的SSR标记多态性较基因组SSR标记低，因此利用水仙基因组中获取SSR位点信息，开发基于水仙基因组的SSR标记引物对水仙种质鉴定和遗传多样性分析等领域提供有效的标记技术，迫在眉睫。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供了一种水仙BES-SSR标记引物GA19及鉴定水仙品种的方法。所述水仙BES-SSR标记引物GA19，是利用水仙BAC-末端序列获得水仙SSR位点信息GA19，在其位点两翼保守区设计特有的SSR标记引物。
[0008]实现本发明目的的技术方案如下:
本发明的水仙BES-SSR标记引物GA19，由上游引物GA19 F和下游引物GA19 R组成，其核苷酸序列如下:
GA19 F: 5’-GAGAAGAATGGGAAATGAATG-3，
GA19 R: 5’-TCCTTTGGAGTTGTTGGTG-3’ 。
[0009]利用本发明的水仙BES-SSR标记引物GA19鉴定水仙品种的方法，包括水仙基因组总DNA提取、PCR总反应体系建立、PCR扩增程序、聚丙烯酰胺凝胶电泳条件和PCR扩增产物的检测鉴定，其特征在于:
1、水仙基因组总DNA提取:利用改良的CTAB法提取水仙基因组总DNA；
2、PCR总反应体系建立:水仙BES-SSR标记引物GA19BES-SSR-PCR总反应体系20ul:供鉴定的水仙基因组总 DNA 50ng, 10XPCR Buffer 2ul, 10mmol/L dNTPs 0.5ul, lOmmol/L水仙GA19上下游引物各1.0ul，5U/L Taq DNA聚合酶0.2ul，无菌ddH20 12.8ul ;所述供鉴定的水仙，本发明共提供24份水仙品种样品；
3、PCR扩增程序:水仙BES-SSR标记引物GA19BES-SSR-PCR扩增程序:94°C预变性4min，94°C变性 30s, 52°C退火 30s, 72°C 延伸 45s，共 35 个循环，72°C延伸 IOmin, 4°C保存；
4、聚丙烯酰胺凝胶电泳条件=IXTBE电泳缓冲液，8%(v/v)的聚丙烯酰胺凝胶，在电压400V,电流IOOmA下电泳3.0h后用银染法染色，经ImageScanner III凝胶扫描仪扫描保存；所述8%(v/v)聚丙烯酰胺凝胶，即30%(29:1，w/v)丙烯酰胺/双丙烯酰胺14ml，5 X TBE 10ml，ddH20 26ml, 10% (w/v)过硫酸铵 250ul，TEMED IOOul ;银染法染色，即 10%(v/v)醋酸固定20min, ddH20冲洗IOmin, 0.2%(w/v)硝酸银溶液染色30min, ddH20冲洗5s,用含100g/L无水碳酸钠、2ml/L甲醒和8mg/L硫代硫酸钠的显影液显影；
5、PCR扩增产物的检测鉴定:利用水仙BES-SSR标记引物GA19，对24份水仙的样品进行品种鉴定，于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的PCR扩增图谱中，在分子量为259bp的位置出现DNA条带，则该品种为中国多花水仙金盏银台；在分子量为199bp的位置出现DNA条带，则该品种为中国多花水仙重瓣玉玲珑；在分子量为215bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋重瓣水仙Replete ;在分子量为343bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋小冠水仙Alltruist ;在分子量为260bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋多花水仙Jetfire ;在分子量为285bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋重瓣水仙Tahiti ;在分子量为256bp的位置出现DNA条带，贝U该品种为西洋裂冠水仙Orangerie ;在分子量为384bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋重瓣水仙Yellow Cheerfulness ;在分子量为240bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋红口水仙Recurvus ;在分子量为372bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋多花水仙Erlicheer ;在分子量为313bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋三蕊水仙Thalia ;在分子量为412bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋喇叭水仙Mount Hood ;在分子量为315bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋多花水仙WhiteFavourite ;在分子量为447bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋长寿花水仙SilverSmiles ;在分子量为343bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋大冠水仙Pink Charm ;在分子量为158bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋大冠水仙Johann Strauss ;在分子量为276bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋小冠水仙Barret Browning ;在分子量为215bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋喇叭水仙Dutch Master ;在分子量为272bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋大冠水仙Fortissimo ;在分子量为438bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋大冠水仙Daydream ;在分子量为250bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋重瓣水仙Gay Tabor ;在分子量为240bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋仙客来水仙Tete-a-Tete ;在分子量为349bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋大冠水仙Bella Vista ;在分子量为153bp 的位置出现DNA条带，则该品种为西洋大冠水仙Carlton。
[0010]本发明采用水仙基因组BAC-末端序列，设计获得的水仙BES-SSR标记引物GA19，具有重复性好，谱带清晰，多态性高等特点；用于水仙品种鉴定，结果有效可靠；可以用于水仙种质鉴定、品种指纹图谱绘制、遗传多样性分析、群居遗传结构研究和遗传连锁图谱分析。
[0011]综上所述，本发明的水仙BES-SSR标记引物GA19，具有如下有益效果:
O使用本发明的水仙BES-SSR标记引物GA19，在水仙品种之间有很好的多态性，且谱带清晰，稳定可靠；也可以将本发明的水仙BES-SSR标记引物GA19用于更多的水仙属植物的种质资源鉴定和遗传多样性分析。
[0012]2)本发明的水仙BES-SSR标记引物GA19，是基于水仙基因组BAC-末端序列开发的，因此多态性更高，在对水仙的种质资源鉴定及遗传多样性分析方面可以提供更有效的技术支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是水仙BES-SSR标记引物GA19对提供鉴定的24份水仙品种的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图。各泳道中，M代表分子量标准；1_24表示24份提供鉴定的水仙品种。
【具体实施方式】
[0014]为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合具体实施例加以说明。[0015]实施例1利用水仙BES-SSR标记引物GA 19鉴定水仙品种的方法
利用水仙BES-SSR标记引物GA19鉴定水仙品种的方法，包括水仙BES-SSR标记引物GA19设计及合成、水仙基因组总DNA提取、PCR总反应体系建立、PCR扩增程序、聚丙烯酰胺凝胶电泳条件和水仙品种鉴定。
[0016]1.水仙BES-SSR标记引物GA19设计及合成:根据水仙BES-SSR位点搜索的结果，设计合成水仙GA19 BES-SSR的标记引物为:
GA19 F: 5’-GAGAAGAATGGGAAATGAATG-3，
GA19 R: 5’-TCCTTTGGAGTTGTTGGTG-3’ ；
具体方法如下:依据水仙基因组BAC-末端序列，利用SSR Hunter分析软件(微卫星检索工具)搜索SSR位点信息，设定参数值:二、三、四、五和六核苷酸基序的最小重复次数分别为7、5、5、5和5次。根据得到的SSR位点信息及其侧翼序列(上下游各150bp)筛选并剔除冗余序列。根据水仙BES-SSR位点搜索，筛选得到的水仙SSR位点及其侧翼序列，利用Primer Premier 5.0设计每个SSR位点PCR扩增引物，引物设计参数要求:引物长度控制于18bp-24bp，最适长度21bp ;退火温度48°C -56°C，最适52°C;上下游引物退火温度之差不高于3°C ；GC含量35%-60%，最适50% ;水仙BES-SSR-PCR扩增产物预期片段100_400bp。引物设计完成后，送上海钼尚生物公司合成并得到水仙BES-SSR标记引物GA19。
[0017]2.水仙基因组总DNA提取
(I)经采样收集各地水仙共24个品种，每个品种随机抽取5片靠鳞茎中部幼嫩叶片，用双蒸水洗净后剪碎混匀，经液氮处理后保存备用。
[0018](2)采用改良的CTAB法(Stewart等人，1993)提取经上述步骤处理的24份供试水仙品种总DNA，所述24个品种如表2所示。
[0019]表2 24份供鉴定水仙品种及编号: 编号品种名称形态特性编号品种名称形态特性_
【权利要求】
1.一种水仙BES-SSR标记引物GA19，由上游引物GA19F和下游引物GA19R组成，其特征在于核苷酸序列如下:
GA19 F: 5’-GAGAAGAATGGGAAATGAATG-3，
GA19 R: 5’-TCCTTTGGAGTTGTTGGTG-3’ 。
2.利用如权利要求1所述的水仙BES-SSR标记引物GA19鉴定水仙品种的方法，包括水仙基因组总DNA提取、PCR总反应体系建立、PCR扩增程序、聚丙烯酰胺凝胶电泳条件和PCR扩增产物的检测鉴定，其特征在于: (1)水仙基因组总DNA提取:利用改良的CTAB法提取水仙基因组总DNA； (2)PCR总反应体系建立:总反应体系20ul:供鉴定的水仙基因组总DNA 50ng，IOXPCRBuffer 2ul, 10mmol/L dNTPs 0.5ul，lOmmol/L 水仙 GA19 上下游引物各 1.0ul，5U/L TaqDNA聚合酶0.2ul，无菌ddH20 12.8ul ;所述供鉴定的水仙，本发明共提供24份水仙品种样品; (3)PCR扩增程序:94°C预变性4min，94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸45s，共35个循环，72°C延伸10min，4°C保存； (4)聚丙烯酰胺凝胶电泳条件:1XTBE电泳缓冲液，体积比为8%的聚丙烯酰胺凝胶，在电压400V,电流IOOmA下电 泳3.0h后用银染法染色,经ImageScanner III凝胶扫描仪扫描保存； (5)PCR扩增产物的检测鉴定:利用水仙BES-SSR标记引物GA19，对24份水仙的样品进行品种鉴定，于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的PCR扩增图谱中，在分子量为259bp的位置出现DNA条带，则该品种为中国多花水仙金盏银台；在分子量为199bp的位置出现DNA条带，则该品种为中国多花水仙重瓣玉玲珑；在分子量为215bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋重瓣水仙Replete ;在分子量为343bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋小冠水仙Alltruist ;在分子量为260bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋多花水仙Jetfire ;在分子量为285bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋重瓣水仙Tahiti ;在分子量为256bp的位置出现DNA条带，贝U该品种为西洋裂冠水仙Orangerie ;在分子量为384bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋重瓣水仙Yellow Cheerfulness ;在分子量为240bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋红口水仙Recurvus ;在分子量为372bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋多花水仙Erlicheer ;在分子量为313bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋三蕊水仙Thalia ;在分子量为412bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋喇叭水仙Mount Hood ;在分子量为315bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋多花水仙WhiteFavourite ;在分子量为447bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋长寿花水仙SilverSmiles ;在分子量为343bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋大冠水仙Pink Charm ;在分子量为158bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋大冠水仙Johann Strauss ;在分子量为276bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋小冠水仙Barret Browning ;在分子量为215bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋喇叭水仙Dutch Master ;在分子量为272bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋大冠水仙Fortissimo ;在分子量为438bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋大冠水仙Daydream ;在分子量为250bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋重瓣水仙Gay Tabor ;在分子量为240bp的位置出现DNA条带,则该品种为西洋仙客来水仙Tete-a-Tete ;在分子量为349bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋大冠水仙Bella Vista ;在分子量为153bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋大冠水仙Carlton0`
【文档编号】C12N15/11GK103555855SQ201310562208
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】潘东明, 祁世明, 潘腾飞, 郭志雄, 林琳 申请人:福建农林大学