一株高效降解染料的菌株的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株高效降解染料的菌株。所述菌株为赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillussp.）FS1，于2013年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2013561。本发明所述菌株生长迅速，环境适应性强，具有广谱的染料降解能力，对多种染料都具有很好的脱色效果，培养10h即能达到最大脱色率，脱色率可达90%以上，最大脱色浓度达5000mg/L。将本发明菌株应用于印染废水以及相关的染料废水脱色处理，能有效避免难于自然降解的染料分子直接进入水体导致的环境污染，且无二次污染，具有良好的生态效率和应用前景。本发明赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillussp.）可很好地应用于染料降解，填补了国内技术空白，为解决染料污水处理尤其是脱色问题提供有力的技术基础。
【专利说明】一株高效降解染料的菌株
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，更具体地，涉及一株高效降解染料的菌株。
【背景技术】
[0002]人工合成染料广泛应用于印染、皮革、食品、化妆品、纸制品等行业，由此产生大量的染料废水。由于染料废水具有色度高、组分复杂、化学稳定性强、生物可降解性差等特点，大量的染料随着工业废水的排放进入环境中，多数偶氮染料具有潜在的三致效应(致畸、致癌、致突变)，对环境和人类健康具有严重的危害。目前我国珠三角地区染料年使用量超过2 X IO4吨，其中有10~20%染料直接排放到环境中，偶氮类染料占总排放量的50%左右。
[0003]目前对染料废水的处理方法有很多，化学法如絮凝法、氧化法、电化学法、物理法如气浮法、超声波法、膜分离法、吸附及萃取等，这些方法虽然有效、处理效果好，但处理成本较高，容易造成二次污染。传统的活性污泥法、膜生物法等生物处理法虽然成本低，无二次污染，但由于染料的可降解性差，无法被普通的微生物彻底降解，其应用受到一定的限制。
[0004]从环境中分离和筛选出能够高效降解染料的微生物菌种，将其应用于染料废水的处理，是行之有效的生物处理法，具有良好的应用前景和生态效益。目前对现有的赖氨酸芽孢杆菌sp.)的研究主 要集中在其还原重金属的能力或对持久性的有机污染物的降解能力，例如专利CN 102363756A公布一株赖氨酸芽孢杆菌
sp.GY32对多氯联苯醚BDE209的降解，专利CN103395893A公布了一株能还原Cr6+的赖氨酸芽孢杆菌。而目前国内还未见赖氨酸芽孢杆菌用于染料脱色的研究文献和专利报道。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是填补本【技术领域】空白，提供一株能够高效降解染料的赖氨酸芽孢杆菌株。
[0006]本发明要解决的另一技术问题是提供所述菌株的分离方法以及培养方法。
[0007]本发明的目的通过以下技术方案予以实现:
提供一株高效降解染料的赖氨酸芽孢杆菌菌株sp.)FS1,于2013年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址是中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学)，保藏编号为:CCTCC NO:M 2013561。保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M 2013561。
[0008]所述菌株为杆菌，革兰氏阳性，菌落圆形、表面光滑扁平、边缘整齐、淡黄色、不透明、有珍珠光泽、菌落直径2mm~6mm,该菌株16S rDNA的序列如SEQ ID N0.1所示。与Lysinibacillus fusiformis NBRC 15717 (NCBI 登录号 AB271743)具有 99% 的同源性。
[0009]本发明所述高效降解染料的菌株FSl在染料降解方面获得很好的应用效果，尤其是在染料废水脱色方面。
[0010]本发明同时提供了所述高效降解染料的菌株FSl的分离方法，是将采集的活性污泥样品经菌种富集培养基富集培养至有明显脱色现象后，梯度稀释，将梯度稀释后的菌液涂于筛选培养基平板上，培养24~48h，挑取明显脱色圈，37°C连续划线、挑单菌落于筛选培养基培养直至无杂菌后，挑取单菌落于脱色培养基中，于37°C静置培养即得。
[0011]本发明提供所述分离方法分离得到的高效降解染料的菌株FSl在染料降解方面的应用，尤其是在染料废水脱色方面具有很好的应用效果。
[0012]所述富集培养基的组成为:牛肉膏lg，蛋白胨2g，葡萄糖3g，K2HP04 2g，NaH2PO40.5g, MgSO4.7H20 0.2g, MnSO4.7H20 0.02g, FeCl3.7H20 0.01g, CaCl2 0.02g，无菌水 1L,pH 7.2 ；
所述筛选培养基的组成为:酵母粉5g，氯化钠5g，蛋白胨10g，琼脂20g，无菌水1L，ρΗ7.2 ；
所述脱色培养基的组成为:碳源2g，氮源lg，NaH2PO4 0.5g，K2HPO4 2g，FeSO4.7H200.01g, MgSO4.7H20 0.2g, CaCl2 0.02g，无菌水 1L, pH 7.2。
[0013]以上培养基均可在121°C灭菌15~30min。
[0014]本发明所述菌株最初是从广东省广州市某工业园废水处理曝气池活性污泥中分离得到。
[0015]本发明所述高效降解染料的菌株FSl的培养方法，是将所述菌种接种于液体培养基中，于30~37° C下摇床培养10~24h即得所述菌株的培养液；
所述液体培养基的组成为:葡萄糖2g，氯化铵lg，NaH2PO4 0.5g, K2HPO4 2g, FeSO4.7H20
0.01g, MgSO4.7H20 0.2g, CaCl2 0.02g，水 1L, pH7.2。
[0016]本发明所述培养方法培养得到的菌株培养液在染料降解方面具有很好的应用。尤其是在染料废水脱色方面具有很好的应用效果。
[0017]本发明所述菌株及其培养液在染料脱色方面的应用涉及多种染料，特别对偶氮染料废水降解效果更佳。
[0018]更为优选地，对甲基橙、酸性红B、中性红和/或亚甲基蓝等多种染料具有优良的降解效果。
[0019]优选地，所述应用最适用的染料的浓度范围为80~5000mg/L，能获得优良的脱色效果。
[0020]优选地,菌株sp.FSl对亚甲基蓝的脱色浓度不高于4000mg/L。
[0021]优选地,菌株sp.FSl对中性红的脱色浓度不高于2000mg/L。
[0022]优选地,菌株577.FSl对甲基橙的脱色浓度不高于500mg/L。
[0023]优选地,菌株sp.FSl对酸性红B的脱色浓度不高于5000mg/L。
[0024]优选地，所述应用中，是将所述高效降解染料的菌株FSl培养至对数生长期，取培养液，按体积比为I~5%的接种量接入脱色基础培养基中，加入所述染料进行常温培养，实现脱色。优选地，所述常温培养的温度为10~40°C，pH6~9，培养时间10~24h。
[0025]优选地，所述应用中，是将高效降解染料的菌株/?/的菌株培养液按体积比为I~5%的接种量接入脱色基础培养基中，加入所述染料进行常温培养，实现脱色。
[0026]优选地，所述常温培养的温度为10~40°C，pH6~9，培养时间10~24h。
[0027]本发明有益效果:
本发明提供了一株新的菌株，该菌株分离自工业园废水处理曝气池活性污泥中，分离步骤简单，制备成本较低。所述菌株生长迅速，环境适应性强，具有广谱的染料降解能力，对多种染料都具有很好的脱色效果，培养IOh即能达到最大脱色率，脱色率可达90%以上，最大脱色浓度达5000mg/L。
[0028] 本发明将所述菌株应用于印染废水以及相关的染料废水脱色处理，可解决已有技术中缺乏高效降解效果、环境适应能力差等特点，能有效避免难于自然降解的染料分子直接进入水体导致的环境污染，且无二次污染，具有良好的生态效率和应用前景。
[0029]本发明首次将赖氨酸芽孢杆菌iLysinibacillus sp.)应用于染料降解,填补了国内技术空白，为解决染料污水处理尤其是脱色问题提供有力的技术基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1 -,Lysinibacillus sp.FSl 的扫描电镜图，标尺=1 Mm。
[0031]图2 'Lysinibacillus sp.FSl 的系统发育树。
[0032]雇..Lysinibacillus sp.FSl对不同浓度亚甲基蓝的脱色效果。
[0033]图4 'Lysinibacillus sp.FSl对不同浓度中性红的脱色效果。
[0034]風b..Lysinibacillus sp.FSl对不同浓度甲基橙的脱色效果。
[0035]图6 'Lysinibacillus sp.FSl对不同浓度酸性红B的脱色效果。
[0036]^r1--Lysinibacillus sp.FSl 对酸性红 B 的吸附与降解。
[0037]臀[私-.Lysinibacillus sp.FSl降解酸性红B的光谱扫描图。
【具体实施方式】
[0038]下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。除非特别说明，本发明采用的原理和方法、设备为本领域常规使用的原理、方法和设备。
[0039]实施例1 Lysinibacillus sp./?1/菌株的分离获得
1.菌株活化与富集
取50mL活性污泥样品(取自广东省广州市工业园废水处理曝气池)，放入盛有50mL无菌水的锥形瓶中(内有数颗玻璃珠)，于摇床振荡30min充分打散泥样。取打散后的悬浮泥样5mL，接种至盛有IOOmL的富集培养基中，加入30mg/L的酸性红B染料，37°C、200rpm振荡培养16~24h。
[0040]所述富集培养基的组成为:牛肉膏lg，蛋白胨2g，葡萄糖3g，K2HP04 2g，NaH2PO40.5g，MgSO4.7H20 0.2g, MnSO4.7H20 0.02g, FeCl3.7H20 0.01g, CaCl2 0.02g，无菌水1L, pH 7.2 ;将培养基在121°C灭菌15~30min即得。
[0041]2.菌株筛选和纯化
将有明显脱色效果的富集后的培养液，用无菌生理盐水试管逐级稀释到10'10_2、10' 10_4、10_5、10_6、10_7共7个梯度。每个梯度取0.1mL的稀释液涂布于含有30mg/L的酸性红B的筛选培养基平板上，37°C培养24~48h。观察单个菌株周围是否有脱色圈出现。挑取具有脱色能力的菌株，37°C连续划线接种到筛选培养基平板上，进一步纯化和确认获得一株高效降解染料的赖氨酸芽孢杆菌菌株sp.)/^57,所述菌株为杆菌,革兰氏阳性，菌落圆形、表面光滑扁平、边缘整齐、淡黄色、不透明、有珍珠光泽、菌落直径2mm~6mm,附图1为菌株的电镜扫描图。该菌株16S rDNA浓择魏与Lysinibacillus fusiformisNBRC 15717 (NCBI登录号AB271743)具有99%的同源性。该菌株的系统发育树见附图2。
[0042]将所述菌株于2013年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址是中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学)，保藏编号为=CCTCC NO:M 2013561。保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013561。
[0043]实施例2 Lysinibacillus sp.FSl对不同浓度亚甲基蓝的脱色效果试验 将本发明所述高效降解染料的菌株FSl接种于液体培养基中，于30~37°C、150rpm下
摇床培养10~24h即得所述菌株的培养液；所述液体培养基的组成为:葡萄糖2g，氯化铵lg, NaH2PO4 0.5g, K2HPO4 2g, FeSO4.7H20 0.01g, MgSO4.7H20 0.2g, CaCl2 0.02g，水 1L,pH7.2。
[0044]取对数生长期(OD6qq=I)的sp.FSl 培养液，按 1% (V/V)接入IOOmL的脱色基础培养基中，分别加入不同浓度梯度(80mg/L、500mg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L、5000mg/L)的亚甲基蓝染料。三个平行，常温培养，每隔5~24 h测定培养液的吸光值。
[0045]用脱色率来考察菌株FSl的脱色能力。在200~800 (nm)波长范围内扫描染料溶液的吸光值，选出最大吸收峰M的波长作为染料吸光值的测定波长。将待测培养液于5000rpm条件下离心10min。取上层清液测定吸光值。按照公式计算脱色率:
脱色率(η) =A0-A1/A0X 100%
A0:培养液初始的吸光值-,A1:培养一段时间后的吸光值
结果如附图3所示，亚甲基蓝浓度为80~500mg/L时脱色率在IOh内就可以达到80%以上。虽然当亚甲基蓝浓度高于500mg/L时，菌株FSl对其的脱色率随着染料浓度升高而降低，但在4000mg/L浓度下仍有一定脱色能力，脱色率为40%。HLysinibacillus sp.FSl对亚甲基蓝的最高脱色浓度高达4000mg/L。
[0046]实施例3 Lysinibacillus sp.FSl对不同浓度中性红的脱色效果试验
参照实施例2，培养所述菌株，取对数生长期(0D_=1)的菌株FSl培养液，按1% (V/V)接入IOOmL的脱色基础培养基中，分别加入不同浓度梯度(80mg/L、300mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L)的中性红染料。其他同实施例2。
[0047]试验结果如附图4所示，当中性红浓度为300~1000mg/L时脱色率在IOh基本达到最大脱色率90%左右，当浓度升高时菌株脱色时间增长约为48h。随着中性红浓度的提高，菌株对其的脱色能力逐渐下降，由99%下降为30%。舊麻LysinibaciIIus sp.FSl对中性红的最高脱色浓度高达2000mg/L。
[0048]实施例4 Lysinibacillus sp.FSl对不同浓度甲基橙的脱色效果试验
参照实施例2，培养所述菌株，取对数生长期(0D_=1)的菌株FSl培养液，按1%(V/V)接入IOOmL的脱色基础培养基中，分别加入不同浓度梯度(80mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L)的甲基橙染料。其他同实施例2。
[0049]结果如附图5所示，甲基橙浓度为80~300mg/L时，IOh脱色率为90%左右。但当浓度进一步升高时(400~500mg/L)时，脱色率虽然下降，但也能去除60%左右。菌株Lysinibacillus sp.FSl对甲基橙的最佳脱色浓度为500mg/L。
[0050]实施例5 Lysinibacillus sp./?1/对不同浓度酸性红B的脱色效果验证取对数生长期(0D_=1)的菌株FSl培养液，按1% (V/V)接入IOOmL的脱色基础培养基中，分别加入不同浓度梯度(80mg/L、300mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L、3000mg/L、4000mg/L、5000mg/L)的酸性红B染料。其他同实施例2。
[0051]结果如附图6所示，当酸性红B浓度为80~1000mg/L时脱色率在10~24h基本达到最大90%左右。虽然随着酸性红B浓度由80mg/L提高到5000mg/L，菌株对其的脱色能力由93%逐渐下降，但最低也有28%。具有明显的降解脱色处理效果。菌株FSl对酸性红B的最闻脱色浓度闻达5000mg/L。
[0052]实施例6 Lysinibacillus sp.FSl对酸性红B吸附与降解效果的验证实验 取对数生长期(OD6tltol=I)的菌株FSl培养液，其中一组进行高压灭菌作为灭活组，另一
组不灭活作为未灭活组。两组菌液分别用海藻酸钠进行固定，制成直径5mm左右的固定化小球，按1%接种量接种到含有80mg/L酸性红B的脱色培养基中。其他同实施例2。
[0053]结果如附图7所示，未灭活组在20h时脱色率就可以达到93%左右，而灭活组脱色率一直维持在O~7%以内。灭活组的脱色率下降是因为菌体和小球吸附导致的，而未灭活组的脱色率下降是吸附和细菌降解共同作用导致。
[0054]此外,在培养过程中每隔3h在200~800nm波长范围内扫描未灭活组培养液光谱的吸光值。结果如附图8所示，光谱曲线从上到下依次为0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h的光谱扫描曲线。可见，在Oh时最大吸收峰515nm的吸光值为2.2，培养到3h、6h、9h、12h、15h、18h时最大吸收峰的吸光值分别降至2.0、1.9、1.7、1.5,0.3，脱色率分别为10%、14%、23%、32%,86% ;从图中可以发现随着培养时间的增长，最大吸收峰的吸光值逐渐下降，在18h时已经没有最大吸收峰， 曲线基本平滑，表明酸性红B确实被sp.FSl所降解。因此，本发明所述的sp.FSl对染料的脱色作用主要是通过菌株的生物降解作用实现的。
【权利要求】
1.一株高效降解染料的菌株如Ci77m 577.) FSl，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013561。
2.根据权利要求所述高效降解染料的菌株FS1，其特征在于，所述菌株16SrDNA的序列如SEQ ID N0.1所示。
3.根据权利要求所述高效降解染料的菌株FS1，其特征在于，所述菌株为杆菌，革兰氏阳性，菌落圆形、表面光滑扁平、边缘整齐、淡黄色、不透明、有珍珠光泽、菌落直径2mm~6mm ο
4.权利要求1、2或3所述高效降解染料的菌株FSl的分离方法，其特征在于，是将采集的活性污泥样品经菌种富集培养基富集培养至有明显脱色现象后，梯度稀释，将梯度稀释后的菌液涂于筛选培养基平板上，培养24~48h，挑取明显脱色圈，37°C连续划线、挑单菌落于筛选培养基培养直至无杂菌后，挑取单菌落于脱色培养基中，于37°C静置培养即得。
5.根据权利要求4所述的分离方法，其特征在于，所述富集培养基的组成为:牛肉膏lg，蛋白胨 2g，葡萄糖 3g, K2HPO4 2g,NaH2PO4 0.5g,MgSO4.7Η20 0.2g,MnSO4.7Η20 0.02g,FeCl3.7Η20 0.01g, CaCl20.02g，无菌水 1L, pH 7.2 ； 所述筛选培养基的组成为:酵母粉5g，氯化钠5g，蛋白胨10g，琼脂20g，无菌水1L，ρΗ7.2 ； 所述脱色培养基的组成为:碳源2g，氮源lg，NaH2PO4 0.5g，K2HPO4 2g，FeSO4.7H20.0.01g, MgSO4.7H20 0.2g, CaCl2 0.02g，无菌水 1L, pH 7.2。
6.权利要求1、2或3所述高效降解染料的菌株FSl的培养方法，其特征在于，将所述菌种接种于液体培养基中，于30~37°C下摇床培养10~24h即得所述菌株的培养液。
7.根据权利要求6所述高效降解染料的菌株FSl的培养方法，其特征在于，所述液体培养基的组成为:葡萄糖 2g，氯化铵 lg, NaH2PO4 0.5g，K2HPO4 2g，FeSO4.7H20 0.01g,MgSO4.7H20 0.2g, CaCl2 0.02g，水 1L, pH7.2。
【文档编号】C12R1/01GK103937697SQ201410015741
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年1月14日 优先权日:2014年1月14日
【发明者】陶然, 杨扬, 苏萌, 赵建成, 钟胜强 申请人:暨南大学