一株吡啶降解噬染料菌及其在含吡啶废水处理中的应用
【专利摘要】本发明公开了一株吡啶降解噬染料菌及其在含吡啶废水处理中的应用。本发明从用于去除吡啶的SBR反应器中取出的成熟好氧颗粒污泥直接筛选，并以吡啶为唯一碳源、氮源的筛选培养基进行分离，得到了吡啶降解特效菌株，经分子生物学鉴定为噬染料菌Pigmentiphaga sp.，命名为Pigmentiphaga sp.NJUST35，保藏编号为CCTCC NO：M2016013。本发明的吡啶降解噬染料菌，可以以吡啶为唯一碳源和氮源进行生长。在吡啶工业废水中加入Pigmentiphaga sp.NJUST35进行处理，吡啶降解率、COD去除率和氨氮转化率分别为100％、76.3％和35.61％。该菌株具有高效的吡啶降解能力、高矿化能力以及对吡啶的毒性具有很好的适应能力及耐受性能，在高浓度吡啶废水的处理中具有良好的应用前景。CCTCC NO：M 201601320160106
【专利说明】
-株p比暗降解隘染料菌及其在含p比暗废水处理中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，具体设及一株化晚降解隧染料菌 及其在含化晚工业废水处理中的应用。
【背景技术】
[0002] 化晚，作为一种重要的化工原料，可生产合成多种化合物，包括杀虫剂、除草剂、药 品、消毒剂、染料等，广泛应用于医药、农药、化工等行业。化晚水溶性强，易在±壤和地下水 之间转移;结构稳定，具有生物毒性、致崎和致癌特性。因此，修复受化晚类杂环化合物污染 的±壤和水环境，已成为目前环境治理领域的重要课题之一。
[0003] 目前，化晚废水的处理技术主要为吸附、焚烧和氧化等物理化学处理技术。然而， 物化处理技术成本普遍偏高，只适用于高浓度化晚废水的处理，而且处理后的废水中化晚 仍可能大量残余，难W实现达标排放。相比于物理化学方法，生物降解法具有经济、高效且 无二次污染等优点，可实现全无害化治理，是应用最广的废水处理技术。但是，由于化晚的 生物毒性，化晚的生化处理具有很大的技术难度，需要在特定条件下、利用特定微生物方可 实现。目前已报导的化晚降解特效菌属包括Arthrobacter，Rhodococcus opacus， Pseudomonas，Shine1la，Bac i1lus，Paracoccus，Streptomyces，Shewane1la，Nocardiodes 等，但大部分化晚降解菌对化晚的耐受浓度低(小于lOOOmg/L)，降解性能受到限制，难W满 足实际工程应用的要求。
[0004] 因此，筛选降解效率高、耐受浓度高、适应真实环境的化晚降解菌，对于解决化晚 废水污染问题，具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一株化晚降解隧染料菌Pigmenti地aga SP.NJUST35,能够 克服现有的化晚降解菌株数量有限，而且对化晚耐受浓度低，处理效率低，菌株种类较为单 一的不足。
[0006] 发明人从实验室中已经运行两年的用于去除化晚的SBR反应器中取出的成熟好氧 颗粒污泥直接筛选，并W化晚为唯一碳源、氮源的筛选培养基进行分离，得到了化晚降解特 效菌株NJUST35,经分子生物学鉴定为隧染料菌Pigmenti地aga sp.，命名为Pigmenti地aga sp .NJUST35，GenBank登录号为KU051387。该菌株已于2016年1月6日在中国典型培养物保藏 中屯、(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2016013。
[0007] 本发明还提供上述隧染料菌Pigmenti地aga SP.NJUST35在含化晚废水处理中的 应用，该菌株为首株可用于化晚废水处理的隧染料菌Pigmenti地aga sp.。
[000引上述化晚降解隧染料菌Pigmenti地aga sp.NJUST35在含化晚废水处理中的应用， 具体方法为:将化晚降解隧染料菌Pigmenti曲aga sp.NJUST35种子液接种到含化晚废水中 培养，培养的溫度为25°C~35°C，含化晚废水的抑为中性。
[0009] 上述的化晚降解隧染料菌Pigmenti地aga sp.NJUST35在含化晚废水处理中的应 用中，培养的溫度优选为30°C。
[0010] 本发明的Pigmenti地aga SP.NJUST35,可WWli比晚为唯一碳源和氮源进行生长。 在化晚工业废水中加入Pigmenti地aga SP.NJUST35进行处理，化晚降解率、COD去除率和氨 氮转化率分别为100 %、76.3%和35.61 %。该菌株具有高效的化晚降解能力、高矿化能力W 及对化晚的毒性具有很好的适应能力及耐受性能，在高浓度化晚废水的处理中具有良好的 应用前景。
【附图说明】
[0011] 图1是本发明菌株Pigmenti地aga SP.NJUST35的透射电镜图。
[0012] 图2是本发明菌株Pigmenti地aga SP.NJUST35在化晚初始浓度为lOOOmg/L的MSM 中对化晚的降解和降解过程中氨氮的释放情况结果图。
【具体实施方式】
[0013] 下面的实施例可W使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不W任何方式限制 本发明。
[0014] 实施例1
[0015] Pi卵enti地aga SP.NJUST35的筛选分离及鉴定。
[0016] (1)菌株的筛选及分离
[0017] 从现有的用于处理化晚废水的SBR反应器中取出成熟好氧颗粒污泥，用研鉢充分 研碎之后用无菌水采用梯度稀释法分别稀释至l〇4-l〇w倍。制备LB固体培养基，灭菌后趁热 倒入同样灭过菌90X90cm的培养皿中，待冷却凝固后分别涂布20化先前稀释的样品，置于 生化培养箱中在30°C的条件下培养3d。挑选培养皿上菌落特征具有明显差异的菌株，采用 平板划线分离的方法进行纯化，连续纯化=次后，得到单一菌株，并进行斜面保存。挑取分 离所得到的单菌落，分别接入含化晚为唯一碳源和氮源的无机盐培养基MSM中，放入全溫振 荡培养箱中在30°C，180r/min条件下培养，监测化晚的浓度值。选取使得培养基内化晚发 生明显降解的菌株，命名为NJUST35,将其进行斜面保存和-80°C的低溫保存W待进一步研 究。
[001引无机盐培养基MSM的组成如下：Na2册04 ? 12出0(1.529g/L)，K出P04(0.372g/L)， MgS04 ? 7出0(0.1 g/L)，CaCl2(0.05g/L)，微量元素溶液化-4( lOmL/L)。微量元素化-4组成： 抓TA(0.5g/L)，FeS04 ? 7出0(0.2g/L)，微量元素化-6(100mL/L)。微量元素化-6组成： ZnS04 ? 7H20(0.01g/L)，MnCl2 ? 4H20(0.03g/L)，曲B04(0.3g/L)，CoCl2 ?細20(0.2g/L)， CuCl2 ? 2出0(0.01g/L)，NiCl2 ? 6出0(0.02g/L)，化2Mo04. 2出0(0.03g/L)。
[0019] (2)菌株的鉴定
[0020] 对细菌进行形态学、生理生化测试。测定菌株的16S rDNA序列，将菌株的16S rDNA 基因序列与国际GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较，最终从分子水平上确定该 菌的种属。
[0021 ]①形态特征:NJUST35菌落表面光滑透明，边缘整齐，在液体培养基中呈扩散性混 浊。该菌株细胞呈杆状，表面光滑。尺寸为l.ll-1.20wIlX561-616nm。图l为细菌的透射电镜 照片。
[0022] ②生理生化特征:革兰氏阴性，脈酶阴性，氨基酸脱簇酶阴性，精氨酸双水解酶阴 性，接触酶阳性，氧化酶阳性，能利用巧樣酸，能利用苹果酸，能利用己二酸，能水解屯叶巧， 不能明胶液化，不能还原硝酸盐，不能水解酪素，不能水解淀粉，不能水解酪氨酸，好氧。
[0023] ③分子生物学鉴定：WNJUST35菌的核DNA为模板，W16S rRNA基因的PCR扩增的通 用引物为引物，进行PCR扩增，测定其全序列，该菌株的16S rDNA基因序列见序列表。将菌株 的16S rDNA基因序列提交至GenBank数据库（GenBank登陆号为KU051387)，与GenBank数据 库中的序列进行网上同源性比较，结果表明，NJUST35与Pigmentiphaga sp.Zn-d-2和 Pigmenti地aga sp.NDS-1的序列相似度高达99% W上。
[0024] 根据NJUST35的形态学、生理生化测试W及分子生物学分析，NJUST35鉴定为 Pigmentiphaga sp.，命名为Pigmentiphaga sp.NJUST35。
[0025] 实施例2
[00%] Pigmenti地aga SP.NJUST35菌株对化晚的降解性能研究。
[0027] 将化晚降解菌株NJUST35接种至添加 lOOOmg/L化晚的LB培养基，30°C条件下W 18化/min的转速摇床培养，进行NJUST35的富集培养，待菌体进入对数生长期后期（约3d)， 将所得菌体用SOOOrpm的转速离屯、15分钟，撇去上清液，采用满旋震荡的方法将菌体重新悬 浮于无菌液体MSM，离屯、。重复洗涂过程S次后，将菌体重新悬浮于无菌液体MSM(调节加入 的MSM量，控制菌悬浮液OD600约为1.0)，得到种子液。本发明采用的LB培养基为本技术领域 常规使用的培养基。
[00%]配制含有lOOOmg/L化晚的液体MSM作为模拟废水，将上述种子液加入模拟化晚废 水中，接种量为5%，30°C条件下W18化/min的转速摇床培养，观测降解过程中废水中化晚 浓度、氨氮浓度W及降解终点时的TO切农度。设立未接种NJUST3 5的空白对照。实验结果如图 2所示。由图2可知，lOOOmg/L化晚可于14化内完全降解;邮晚降解过程中，化晚结构中的氮 W氨氮的形式释放出来，化晚降解结束后氨氮的转化率约为36.68% ;T0C显著降低，去除率 可高达85.70% ;而在未接种NJUST35的对照样中，化晚未得到明显降解。
[0029] 本实施例说明分离得到的Pigmenti地aga SP.NJUST35可W利用化晚为唯一碳源 和氮源进行生长繁殖，并可实现化晚的矿化。
[0030] 实施例3
[0031] Pigmenti地aga SP.NJUST35对含化晚工业废水的处理。
[0032] 将Pigmenti地aga sp.NJUST35种子液W5%的接种量接入含化晚的实际工业废水 (含化晚989mg/L，C0D1328mg/L，总憐55mg/L)，在30°C条件下W 180r/min的转速摇床培养。 监测废水处理前后COD值、化晚W及氨氮浓度。
[0033] 由表1可知，含化晚工业废水经菌株Pi卵enti地aga SP.NJUST35处理108h后，实现 了化晚的完全降解，COD值降为314.67mg/L，氨氮释放量为63.1 Img/L。化晚降解率、COD去除 率和氨氮转化率分别为100 %、76.3 %和35.61 %。
[0034] 本实施例说明分离得到的Pigmenti地aga SP.NJUST35可成功应用于含化晚工业 废水的生化处理，实现含化晚工业废水中化晚和COD的高效去除。
[0035] 表1含化晚工业废水处理前后各项指标的变化情况
[0036]
[0037]
【主权项】
1 · 一株吡啶降解噬染料菌，为噬染料菌Pigmentiphaga sp ·NJUST35，保藏编号为CCTCC NO：M 2016013〇2. 如权利要求1所述的吡啶降解噬染料菌在含吡啶废水处理中的应用。3. 如权利要求2所述的吡啶降解噬染料菌在含吡啶废水处理中的应用，其特征在于，具 体方法为:将吡啶降解噬染料菌Pigmentiphaga Sp.NJUST35种子液接种到含吡啶废水中培 养，培养的温度为25°C~35°C，含吡啶废水的pH为中性。4. 如权利要求3所述的吡啶降解噬染料菌在含吡啶废水处理中的应用，其特征在于，所 述的培养温度为30 °C。
【文档编号】C12R1/01GK106047746SQ201610319899
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】沈锦优, 李旺, 王连军, 刘晓东, 张德锦, 侯成, 孙秀云, 李健生, 韩卫清
【申请人】南京理工大学