抗虫棉花植物及其鉴定方法
【专利摘要】本发明提供特定的转基因棉花植物、植物材料和种子，其特征在于这些产品在棉花基因组的特定位置包含特定转化事件。本发明也提供允许快速和明确鉴定生物样品中的所述事件的工具。
【专利说明】抗虫棉花植物及其鉴定方法
[0001]本申请是申请日为2008年3月31日、发明名称为“抗虫棉花植物及其鉴定方法”的中国专利申请200880010892.6 (国际申请号PCT/EP2008/002667)的分案申请。
发明领域
[0002]本发明涉及转基因棉花植物，植物材料及种子，其特征在于包含一个特定的转化事件，特别是在棉花基因组的特定部位存在编码可赋予昆虫抗性的蛋白的基因。本发明的棉花植物组合了昆虫抗性表型、农学性状、遗传稳定性、以及对不同遗传背景的适应性(等同于非转化棉花系在无昆虫状况下)。本发明进一步提供了在生物样品中鉴定特别包含了转化事件EF-GH5的植物材料的存在的方法和试剂盒。
[0003]发明背景
[0004]植物中转基因的表型表达取决于:基因本身的结构，以及其在植物基因组中的位置。同时，在基因组的不同位置转基因(外源DNA中)的存在将以不同的方式影响植物的整体表型。通过遗传操作，在农学上或工业上成功地将商业上感兴趣的性状引入到植物中是一个长期的过程，这取决于不同的因素。转基因植物的实际转化和再生仅仅是一系列选择步骤的第一步，选择步骤包括广泛的遗传表征，育种，田间试验评价，最终实现优良品系的选择。
[0005]棉纤维是全世界最重要的纺织原料。每年全球收获大约80，000，000英亩棉花。就面积产量而言，棉花是美国第五大作物，2000年其种植超过了 15，000, 000英亩。
[0006]靠棉花为生的最具破坏性的昆虫物种有:Helicoverpa zea (玉米果穗螟蛉或棉铃虫)、Helicoverpa armigera (美洲棉铃虫)、Heliothis virescens (烟青虫)及Helicoverpa punctigera。
[0007]鉴于对新型食品和新型饲料的关注，GMO和非GMO产品的分开，以及对专利材料的鉴别，优良事件的明确鉴定正变得愈加重要。理想的是，该鉴定方法既快又简单，还不需要大量的实验室设备。此外，该方法应提供不需专家解释就能使优良事件明确确定的结果，但是如果必要的话，在专家仔细审查下，结果被证明有效。本文描述了在生物样品中鉴定优良事件EF-GH5而用到的特定工具。
[0008]在开发抗虫棉(Gossypium hirsutum)过程中，从转基因棉花植物群体中将EE-GH5鉴定作为优良事件，它包含编码来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫晶体蛋白的基因。转基因棉花植物包含编码Bt杀虫晶体蛋白(如W003/093484所述)的嵌合基因，其处于植物可表达启动子的控制之下。
[0009]包含抗虫基因的棉花植物已经在本领域中公开。但是，并没有任何现有技术公开内容教导或提示了本发明。 [0010]发明概述
[0011]本发明涉及转基因棉花植物、或其种子、细胞或组织，其包含稳定整合在其基因组中的表达盒，该表达盒包含一个包含cryIAb基因编码序列的抗虫基因(如本文实施例1.1所述)，其为抗虫的，在无昆虫压力下，该转基因植物及其材料具有与非转基因的等基因系基本上等同的农学性能。在有昆虫压力下，该转基因植物将具有比非转基因植物优越的农学表型。
[0012]根据本发明，棉花植物、或其种子、细胞或组织包含优良事件EE-GH5。
[0013]更确切地说，本发明涉及转基因棉花植物、其种子、细胞或组织，其基因组DNA的特征在于，当用本文所述的PCR鉴定方法分析，使用两个分别针对EE-GH5的5 ‘或3 ‘侧翼区和外源DNA的引物时，得到特异于EE-GH5的片段。所述引物可以分别针对SEQ ID No:1的5 ‘侧翼区和外源DNA内，例如可以分别包含SEQ ID No:7和SEQ ID No:8的核苷酸序列或由其组成，得到100-700bp的DNA片段，优选大约129bp。该引物也可以分别针对SEQID No:2内的3 ‘侧翼区和外源DNA，例如可以分别包含SEQ ID No:3和SEQ ID No:6的核苷酸序列或由其组成，得到300-700bp的DNA片段，优选是大约369bp。
[0014]包含本发明的优良事件的参考种子已经保藏在ATCC，保藏号为PTA-8171。本发明的一个实施方案是，以ATCC保藏号PTA-8171保藏的包含优良事件EE-GH5的种子，它可以长成对昆虫(特别是对Helicoverpa sp.或Heliothis sp.)有抗性的棉花植物。ATCC保藏号为PTA-8171的种子是一个种子库，其中包含的至少大约95%的转基因籽粒对于所述转基因是纯合的，包含本发明的优良事件，这些种子可以长成抗虫植物，因而这些植物也可以是草铵膦耐受植物。可播种种子，且生长的植物可以用本文所述的草铵膦处理，从而得到含有本发明的优良事件的百分之百耐受草铵膦的植物。本发明进一步涉及由以保藏号PTA-8171保藏在ATCC的种子长成的包含本发明的优良事件的植物而来的细胞，组织及子代和后代。本发明进一步涉及通过以保藏号PTA-8171保藏在ATCC的种子长成的包含本发明的优良事件的棉花植物的繁殖和/或育种可以得到的植物。本发明也涉及包含优良事件EE-GH5的棉花植物。
[0015]本发明进一步 涉及鉴定包含优良事件EE-GH5的转基因植物、或其细胞或组织的方法，该方法是基于对转基因植物、细胞或组织中的特征DNA序列或由该DNA序列编码的氨基酸的存在进行鉴定。根据本发明优选的实施方案，这样的特征DNA序列是15bp的序列，优选是20bp，最优选是30bp或更多，这些序列包含该事件的插入位点，即部分外源DNA和部分与之相邻的棉花基因组(5 ‘或3 ‘侧翼区)，这使得优良事件可以被特别鉴定。
[0016]本发明进一步涉及在生物样品中鉴定优良事件EE-GH5的方法，该方法基于可以特异识别EE-GH5的5 ‘和/或3 ‘侧翼序列的引物或探针。
[0017]更确切地说，本发明涉及包括扩增生物样品中存在的核酸序列的方法。该方法使用至少两个引物进行聚合酶链式反应，一个识别EE-GH5的5 ‘或3 ‘侧翼区，另一个识别外源DNA内的序列，优选得到一个100-500bp的DNA片段。该引物可以分别识别EE-GH5的5 ‘侧翼区内的序列(SEQ ID N0.1的1-98位的序列，或SEQ ID N0.16的1-563位的序列)或EE-GH5的3 ‘侧翼区内的序列(SEQ ID N0.2的41-452位的互补序列)，以及外源DNA内的序列(SEQ ID N0.1的99-334位的互补序列，或SEQ ID N0.2的1_40位的序列)。识别5 ‘侧翼区的引物可以包含SEQ ID N0.7或SEQ ID N0.17的核苷酸序列，识别外源DNA内的序列的引物可以包含本文所述的SEQ ID N0.8, SEQ ID N0.18或SEQ ID N0.19的核苷酸序列。识别3 ‘侧翼区的引物可以包含本文所述的SEQ ID N0.6的核苷酸序列，识别外源DNA内的序列的引物可以包含本文所述的SEQ ID N0.3的核苷酸序列。
[0018]本发明更特别地涉及鉴定生物样品中的优良事件EE-GH5的方法，该方法包括利用分别具有SEQ ID N0.3和6的核苷酸序列的两个引物通过聚合酶链式反应扩增生物样品中的核酸序列，得到大约369bp的DNA片段。
[0019]目前的优良事件包含一个外源DNA序列，与最初用于转化程序的DNA相比，该序列发生了轻微的重排。这一重排对于优良事件EE-GH5是独特的。因此，本发明还涉及鉴定生物样品中的优良事件EE-GH5的方法，该方法包括通过聚合酶链式反应得到一个大约262bp的DNA片段，所用的引物位于EE-GH5中外源DNA的独特重排区的两侧，例如包含或具有SEQID N0.10或SEQ ID N0.11的核苷酸序列的引物。
[0020]本发明进一步涉及本文所述的EE-GH5的特异侧翼序列，其可以用来开发特定的鉴定方法来鉴定生物样品中的EE-GH5。此类特定的侧翼序列在鉴定试验中也可以用作参考对照材料。更特别的是，本发明涉及可以用来开发如本文进一步所述的特异引物和探针的EE-GH5的5 ‘和/或3 ‘侧翼区。本发明也涉及跨越EE-GH5的外源DNA内的特定重排的核酸分子，例如，包含SEQ ID N0.12的52-88位核苷酸序列的核酸分子，或包含SEQ ID N0.12的序列的核酸分子。也适合作为参考材料的是优选为大约369bp的核酸分子，其包含可以被具有SEQ ID N0.3和6的核苷酸序列的引物扩增的序列。
[0021]本发明进一步涉及，基于这些特异引物和探针的使用，从而对生物样品中EE-GH5的存在进行鉴定的方法。引物可以由17至大约200个连续核苷酸的核苷酸序列组成，其选自SEQ ID N0.1的1-98位核苷酸的核苷酸序列、SEQ ID N0.16的1_563位核苷酸的核苷酸序列、或者SEQ ID N0.2的41-452位核苷酸的核苷酸序列的互补序列，与由17至大约200个连续核苷酸的核苷酸序列组成的引物相组合，所述引物选自SEQ ID N0.1的99-334位核苷酸的核苷酸序列的互补序列，及SEQ ID N0.2的1-40位核苷酸的核苷酸序列。引物也可以包含定位在3 ‘末端的核苷酸序列，进一步包含无关序列，或来源于所述核苷酸序列但包含错配的序列。
[0022]本发明进一步涉及鉴定生物`样品中的优良事件EE-GH5的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个可以特异识别EE-GH5的5 ‘或3 ‘侧翼区或者可以特异识别EE-GH5中外源DNA序列内的特异重排的引物或探针。
[0023]除了可以特异识别EE-GH5的5 ‘或3 ‘侧翼区的引物外，本发明的试剂盒可以包含第二个特异识别EE-GH5的外源DNA内的序列的引物，以便用在PCR鉴定方案中。本发明的试剂盒可以包含至少两个特异引物，一个识别EE-GH5的5‘侧翼区内的序列，另一个识别外源DNA内的序列。识别5‘侧翼区的引物可以包含SEQ ID N0.3的核苷酸序列，识别转基因的引物可以包含SEQ ID N0.6的核苷酸序列或本文所述的任何其它的引物。
[0024]本发明进一步涉及鉴定生物样品中的优良事件EE-GH5的试剂盒。所述的试剂盒包含具有SEQ ID N0.3和6的核苷酸序列的PCR引物，用于本文所述的EE-GH5PCR鉴定方案中。本发明进一步涉及鉴定生物样品中的优良事件EE-GH5的试剂盒。所述的试剂盒包含具有SEQ ID N0.10和11的核苷酸序列的PCR引物。
[0025]本发明也涉及鉴定生物样品中的优良事件EE-GH5的试剂盒。该试剂盒包含特异探针，其具有相应于(或互补于)与EE-GH5的特定区域具有80-100%序列同一性的序列。优选地，该探针的序列相应于包含部分EE-GH5的5 ‘或3 ‘侧翼区部分的特定区域，或者相应于对应于EE-GH5特异的外源DNA的重排的区域。最优选地，该特异探针具有(或互补于)与SEQ ID N0.1的78-119位核苷酸序列、SEQ ID N0.2的20-61位核苷酸序列或SEQ ID N0.12的52-88位核苷酸序列有80-100%的序列同一性的序列。[0026]根据本发明的另一方面，公开的DNA序列包含了事件的插入位点，以及足够长的棉花基因组DNA和外源DNA (转基因)的多核苷酸，以至于可以用作引物或探针来检测EE-GH5。此类序列，在插入位点的每一侧，可以分别包含棉花基因组DNA的至少9个核苷酸以及EE-GH5的外源DNA (转基因)的相似数量的核苷酸。最优选地，此类DNA序列包含棉花基因组DNA的至少9个核苷酸以及外源DNA的相似数量的核苷酸(与SEQ ID N0.1或2的插入位点相邻)。
[0027]本发明所包括的方法和试剂盒可以用在不同的目的，例如，但不仅限于下列:鉴定植物，植物材料或产品(例如但不仅限于:包含或源于植物材料的新鲜或加工的食品或饲料)中是否存在EE-GH5 ;另外地或备选地，本发明的方法和试剂盒可用来鉴定转基因植物材料，目的在于将转基因或非转基因材料分离；另外地或备选地，本发明的方法和试剂盒可以用来确定包含EE-GH5的植物材料的品质(即纯材料的百分比)。
[0028]本发明进一步涉及EE-GH5的5 ‘和/或3 ‘侧翼区，还涉及从EE-GH5的5 ‘和/或3 ‘侧翼序列开发的特异引物和探针。本发明也涉及EE-GH5特定的重排区域，还涉及根据此区域设计的特异引物或探针。
[0029]本发明也涉及从包含优良事件EE-GH5的植物中得到的基因组DNA。在进行本文所述的鉴定试验时，该基因组DNA可以用作参考对照材料。
[0030]附图简沭
[0031]下面的实施例，不是为了将本发明限制于所述的特定实施方案，而是可以结合着附图(并入本文作为参考)来理解。这些图中:
[0032]图1通过图示了引用的核苷酸序列与引物之间的关系。黑色条形:外源DNA ;带条纹的黑色条形:EE-GH5特异的外源DNA中的重排；浅色条形:植物来源的DNA ;带条纹的浅色条形:预插入靶位点缺失；箭头:寡核苷酸引物，条形下的数字代表核苷酸位置；(c)代表的是所指的核苷酸序列的互补序列。
[0033]图2显示为EE-GH5开发的接合性评分PCR方案得到的结果。凝胶的上样顺序:泳道1:分子量标记(IOObp序列梯)；泳道2-3:来自包含杂合形式的转基因事件EE-GH5的棉花植物的DNA样品；泳道4:失败；泳道5:来自野生型棉花植物的对照DNA样品；泳道6_7:来自包含纯合形式的转基因事件EE-GH5的棉花植物的DNA样品；泳道8:无模板DNA对照；泳道9:分子量标记。
[0034]发明详沭
[0035]在植物基因组中掺入重组DNA分子典型地是由细胞或组织的转化实现的。掺入的特定位点通常是由于“随机”整合决定的。
[0036]通过用重组DNA或“转化DNA”转化植物细胞或组织而引入到植物基因组中并源于该转化DNA的DNA在下文中称为“外源DNA”，它包含一个或多个“转基因”。本发明文中的“植物DNA”指的是源于被转化植物的DNA。植物DNA通常见于相应野生型植物的相同的基因座。外源DNA可通过在植物基因组中重组DNA分子的掺入位点处的位置和结构来表征。植物基因组中重组DNA插入的位点也称为“插入位点”或“靶位点”。重组DNA插入到被称为“预插入植物DNA”的植物基因组的区域与植物DNA的缺失相关，称之为“靶位点缺失”。本文使用的“侧翼区”或“侧翼序列”指的是不同于引入的DNA的至少20bp的DNA序列，优选是至少50bp，多可至5000bp ;优选地，源于植物基因组的DNA，它要么位于外源DNA的紧上游区并与之相邻，要么位于外源DNA的紧下游区并与之相邻。导致外源DNA随机整合的转化程序会产生具有不同侧翼区的转化体，这些侧翼区对每个转化体而言是特征性的且是独特的。当通过传统杂交将重组DNA引入到植物中时，其在植物基因组中的插入位点，或其侧翼区一般不再改变。本文使用的“插入区”所指的区域对应于至少40bp的区域，优选是至少lOObp，多可至lOOOObp，该区域包含在包含植物基因组中外源DNA的上游和/或下游侧翼区的序列内。考虑到由于种内突变而引起的微小差异，插入区当杂交到同种植物中时将会保持与转化植物中包含外源DNA的上游和下游侧翼区的序列有至少85%的序列同一性，优选是90%，更优选是95%，最优选是100%序列同一性。
[0037]事件的定义是:(人工)基因座，由于基因工程方法，其携带了包含至少一个拷贝的目的基因的转基因。事件的典型的等位状态是外源DNA的存在或不存在。事件在表型上的特征是转基因的表达。在基因水平上，事件是植物的基因组成的一部分。在分子水平上，事件的特征在于限制图谱(比如可以通过Southern印迹法确定)，转基因的上游和/或下游侧翼区，以及转基因的分子标记的位置和/或分子结构。通常，用包含至少一个目的基因的转化DNA转化植物可以得到一个转化体群体，其包含大量独立的事件，其中每个都是独特的。
[0038]本文使用的优良事件，是选自一组事件的事件。该事件的获得是基于转基因的表达和稳定性以及与包含优良事件的植物的最优农学性状的相容性，用相同的转化DNA进行转化或用转化得到的植物进行回交。因此，优良事件选择标准为一个或多个，优选地两个或多个，优选地所有下列标准:
[0039]a)外源DNA的存在不损害植物的其它期望的特征，例如那些与农学性能或商业价值相关的特征；
[0040]b)事件的特征在于稳定遗传的明确的分子结构，并可为其开发出合适的鉴定对照的工具；
[0041]c)在事件的杂合的(或半合子的)和纯合的条件下，并在环境条件范围内的商业可接受的水平上(其中携带该事件的植物可能用在正常的农业环境中)，目的基因显示出正确的，适当的和稳定的时空表型表达。
[0042]外源DNA优选与植物基因组中的一个位置相关，这可允许其轻易地渐渗入到期望的商业性遗传背景中。
[0043]作为优良事件的事件状态，通过将优良事件渐渗入到不同的相关遗传环境中并观察其与上述标准(例如a，b, c)中的一个，两个或所有的符合来进行确认。
[0044]因此，“优良事件”指的是一个包含外源DNA的基因座，其符合上述标准。植物，植物材料或其子代(例如种子)在其基因组中含有一个或多个优良事件。
[0045]开发出来用于鉴定优良事件，或包含优良事件的植物，植物材料，或由包含优良事件的植物材料生产的产品的工具，是基于优良事件的特定基因组特征，例如包含外源DNA的基因组区、分子标记或外源DNA的侧翼区序列特定的限制性图谱。
[0046]一旦外源DNA的一个或两个侧翼区已经测序，借助分子生物学技术，可以设计出特异识别样品的核酸(DNA或RNA)中的这个(些)序列的引物和探针。例如，可开发PCR方法鉴定生物样品(例如植物，植物材料，或包含植物材料的产品)中的优良事件。这种PCR方法是基于至少两个特异“引物”，一个识别优良事件的5 ‘或3 ‘侧翼区内的序列，另一个识别外源DNA内的序列。优选地,引物具有一个15-35个核苷酸的序列,其在优化的PCR条件下，分别可以“特异识别”优良事件的5 ‘或3 ‘侧翼区内的序列和该优良事件的外源DNA，从而可以从包含该优良事件的核酸样品中扩增出特异片段(“整合片段”或鉴别扩增子)。这意味着，在优化PCR条件下，只可以扩增出靶向整合片段，而不会扩增出植物基因组内的其它序列或外源DNA。
[0047]适于本发明的PCR引物可以是下面的:
[0048]-具有17nt至大约IOOnt长度的寡核苷酸，在其3‘末端包含至少17个连续核苷酸，优选20个连续核苷酸的核苷酸序列，其选自5 ‘侧翼序列(SEQ ID Nol的1-98位核苷酸的核苷酸序列，或SEQ ID Nol6的1-563位核苷酸的核苷酸序列)(识别5 ‘侧翼序列的引物)；或
[0049]-具有17nt至大约200nt长度的寡核苷酸，在其3‘末端包含至少17个连续核苷酸，优选20个连续核苷酸的核苷酸序列，选自3 ‘侧翼区(SEQ ID No2的41-452位核苷酸的核苷酸序列的互补序列)(识别3 ‘侧翼序列的引物)；
[0050]-具有17nt至大约200nt长度的寡核苷酸，在其3‘末端包含至少17个连续核苷酸，优选20个核苷酸的核苷酸序列，选自插入DNA序列(SEQ ID Nol的99-334位核苷酸的核苷酸序列的互补序列)(识别外源DNA的引物)；
[0051]-具有17nt至大约40nt长度的寡核苷酸，包含至少17个连续核苷酸，优选20个核苷酸的核苷酸序列，选自插入DNA序列(SEQ ID No2的1_40位核苷酸的核苷酸序列)。
[0052]引物当然可以比提到的17个连续核苷酸更长，例如，可以是20，21，30，35，50，75，100, 150，200nt的长度或更长。引物可以完全由选自提到的侧翼序列和外源DNA序列的核苷酸序列所组成。但是，引物的核苷酸序列在5 ‘末端(即位于3 ‘端的17个连续核苷酸之外)是不太关键的。所以，引物的5 ‘序列可以由选自侧翼序列或外源DNA的核苷酸序列所组成，但是还可以适当地包含一些(例如1，2，5，10个)错配。引物的5 ‘序列甚至可以完全由与侧翼序列或外源DNA无关的核苷酸序列所组成，例如，代表限制性酶识别位点的核苷酸序列。优选地，这种具有错配的不相关序列或侧翼DNA序列应该优选不长于100个核苷酸，更优选地，不长于50或甚至25个核苷酸。
[0053]此外，如果所述的3 ‘末端的17个连续核苷酸不只是源自外源DNA或SEQ ID Nol或2中的植物衍生序列，则合适的引物在其3 ‘末端可以包含跨越植物DNA衍生序列和外源DNA序列之间的连接区域(位于SEQ ID Nol的98-99位核苷酸和SEQ ID No2的40-41位核苷酸)的核苷酸序列或由该核苷酸序列组成。
[0054]对于熟练的技术人员来说，立刻就可以明白的是，适当选择的PCR引物对不应该包含互相互补的序列。
[0055]出于本发明的目的，“SEQ ID No:X代表的核苷酸序列的互补序列”是这样的核苷
酸序列，其是根据ChargafT ‘s规则将核苷酸用互补核苷酸替换(AOT; G<^C)而从所
代表的核苷酸序列得到的核苷酸序列，并沿着5 ‘_3 ‘的方向阅读，即所代表的核苷酸序列的反方向。
[0056]合适的引物的例子有:SEQ ID No7或SEQ ID Nol7的寡核苷酸序列(识别5 ‘侧翼序列的引物)，SEQ ID No8, SEQ ID Nol8或SEQ ID Nol9的寡核苷酸序列(识别外源DNA的引物，与识别5‘侧翼序列的引物一起使用)，SEQ ID No3的寡核苷酸序列(识别外源DNA的引物，与识别3 ‘侧翼序列的引物一起使用)，SEQ ID No4, SEQ ID No5，SEQ ID No6的寡核苷酸序列(识别3 ‘侧翼序列的引物)，以及SEQ ID NolO和11的寡核苷酸序列(识别EE-GH5中的特定外源DNA重排的引物)。
[0057]合适的寡核苷酸引物的其他例子在其3 ‘末端包括下列序列或由这些序列组成:
[0058]a.识别5 ‘侧翼序列的引物:
[0059]-SEQ ID Nol的58_77位核苷酸的核苷酸序列
[0060]-SEQ ID Nol6的85-104位核昔酸的核昔酸序列
[0061]-SEQ ID Nol6的150-166位核昔酸的核昔酸序列
[0062]-SEQ ID No 16的150-171位核苷酸的核苷酸序列
[0063]-SEQ ID No 16的154-171位核苷酸的核苷酸序列
[0064]-SEQ ID No 16的87-104位核苷酸的核苷酸序列
[0065]-SEQ ID No 16的189-206位核苷酸的核苷酸序列
[0066]b.识别外源DNA序列的引物，与识别5 ‘侧翼序列的引物一起使用:[0067]-SEQ ID Nol的149-170位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0068]-SEQ ID Nol的169-186位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0069]-SEQ ID Nol的193-212位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0070]-SEQ ID Nol的161-178位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0071]-SEQ ID Nol的194-211位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0072]-SEQ ID Nol的193-211位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0073]-SEQ ID Nol的163-185位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0074]-SEQ ID Nol的194-210位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0075]-SEQ ID Nol的193-210位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0076]-SEQ ID Nol的193-209位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0077]c.识别3 ‘侧翼序列的引物:
[0078]-SEQ ID No2的149-168位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0079]-SEQ ID No2的154-173位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0080]-SEQ ID No2的140-159位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0081]-SEQ ID No2的141-160位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0082]-SEQ ID No2的147-166位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0083]-SEQ ID No2的148-167位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0084]-SEQ ID No2的149-167位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0085]-SEQ ID No2的153-172位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0086]-SEQ ID No2的154-174位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0087]-SEQ ID No2的160-177位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0088]-SEQ ID No2的232-251位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0089]-SEQ ID No2的140-160位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0090]-SEQ ID No2的141-161位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0091]-SEQ ID No2的147-165位核苷酸的核苷酸序列的互补序列[0092]-SEQ ID No2的149-166位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0093]-SEQ ID No2的148-166位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0094]-SEQ ID No2的147-167位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0095]-SEQ ID No2的148-168位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0096]-SEQ ID No2的153-173位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0097]-SEQ ID No2的154-175位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0098]-SEQ ID No2的156-175位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0099]-SEQ ID No2的232-250位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0100]-SEQ ID No2的140-157位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0101]-SEQ ID No2的140-161位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0102]-SEQ ID No2的141-162位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0103]-SEQ ID No2的148-165位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
`[0104]-SEQ ID No2的149-165位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0105]-SEQ ID No2的147-168位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0106]-SEQ ID No2的148-169位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0107]-SEQ ID No2的156-174位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0108]-SEQ ID No2的153-174位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0109]-SEQ ID No2的232-249位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0110]-SEQ ID No2的234-251位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0111]-SEQ ID No2的141-163位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0112]-SEQ ID No2的148-164位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0113]-SEQ ID No2的147-169位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0114]-SEQ ID No2的153-175位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0115]-SEQ ID No2的156-177位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0116]-SEQ ID No2的181-198位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0117]-SEQ ID No2的181-202位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0118]-SEQ ID No2的234-250位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0119]-SEQ ID No2的140-162位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0120]-SEQ ID No2的181-203位核苷酸的核苷酸序列的互补序列
[0121]d.识别外源DNA序列的引物，与识别3 ‘侧翼序列的引物一起使用:
[0122]-SEQ ID No2的30_49位核苷酸的核苷酸序列
[0123]-SEQ ID No2的30_48位核苷酸的核苷酸序列
[0124]-SEQ ID No2的32_48位核苷酸的核苷酸序列
[0125]-SEQ ID No2的32_49位核苷酸的核苷酸序列
[0126]-SEQ ID No2的31_49位核苷酸的核苷酸序列
[0127]-SEQ ID No2的31-48位核苷酸的核苷酸序列
[0128]-SEQ ID No2的30_46位核苷酸的核苷酸序列
[0129]本文所用的“SEQ ID N0.Z的X-Y位核苷酸的核苷酸序列”表不的是包括两个核苷酸端点在内的核苷酸序列。[0130]优选地，扩增的片段具有50-500个核苷酸的长度，优选是100-350个核苷酸的长度。特异引物可以具有分别与优良事件的5‘或3‘侧翼区及其外源DNA内的序列有80-100%的同一性的序列，条件是在优化的PCR条件下利用这些引物，错配仍可以使优良事件得到特异鉴定。但是，允许错配的范围可以容易地通过实验确定并为本领域技术人员所知。
[0131]下表列举了运用选择的PCR引物对所得到的预期的DNA扩增子(或整合片段)的大小。
[0132]
【权利要求】
1.转基因棉花植物细胞，其包含优良事件，所述优良事件包含外源DNA，该外源DNA包含处于地下三叶草矮化病毒S7启动子控制下的SEQ ID N0.20的经修饰crylab基因的编码序列，其中包含所述事件的参考种子以保藏号PTA-8171保藏在ATCC，其中所述细胞的基因组DNA，当用所述优良事件鉴定方案与分别包含SEQ ID NolO和SEQ ID Noll的核苷酸序列的两种引物分析时，产生262bp的DNA片段，或者，当用所述优良事件鉴定方案与分别包含SEQ ID No3和SEQ ID No6的核苷酸序列的两种引物分析时，产生369bp的DNA片段。
2.棉花植物细胞，在其基因组中包含如权利要求1中表征的优良事件，所述棉花植物细胞可由以保藏号PTA-8171保藏在ATCC的种子长成的棉花植物繁殖和/或育种得到。
3.产生棉花植物的方法，所述棉花植物包含权利要求1中表征的优良事件，所述方法包括 a)将包含优良事件的转基因棉花植物与另一棉花植物杂交，其中所述优良事件包含外源DNA，该外源DNA包含处于地下三叶草矮化病毒S7启动子控制下的SEQ ID N0.20的经修饰crylab基因的 编码序列，其中包含所述事件的参考种子以保藏号PTA-8171保藏在ATCC，其中所述植物的基因组DNA，当用所述优良事件的优良事件鉴定方案与分别包含SEQID NolO和SEQ ID Noll的核苷酸序列的两种引物分析时，产生262bp的DNA片段，或者，当用所述优良事件的优良事件鉴定方案与分别包含SEQ ID No3和SEQ ID No6的核苷酸序列的两种引物分析时，产生369bp的DNA片段，和 b)种植从所述杂交获得的种子并获得包含所述优良事件的棉花植物。
4.产生棉花植物的方法，所述棉花植物包含权利要求1中表征的优良事件，所述方法包括将从以保藏号PTA-8171保藏在ATCC的种子长成的植物与另一棉花植物杂交，种植从所述杂交获得的种子并获得包含所述优良事件的棉花植物。
5.获得昆虫抗性棉花植物的方法，包括 a)种植包含优良事件的转基因棉花植物,所述优良事件包含外源DNA，该外源DNA包含处于地下三叶草矮化病毒S7启动子控制下的SEQ ID N0.20的经修饰crylab基因的编码序列，其中包含所述事件的参考种子以保藏号PTA-8171保藏在ATCC，其中所述细胞的基因组DNA，当用所述优良事件的优良事件鉴定方案与分别包含SEQ ID NolO和SEQ ID Noll的核苷酸序列的两种引物分析时，产生262bp的DNA片段，或者，当用所述优良事件的优良事件鉴定方案与分别包含SEQ ID No3和SEQ ID No6的核苷酸序列的两种引物分析时，产生369bp的DNA片段；和 b)获得包含所述优良事件的后代植物。
【文档编号】C12N5/10GK103710312SQ201410015366
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2008年3月31日 优先权日:2007年4月5日
【发明者】L·特落林德尔, S·莫昂, D·佩林克, V·哈贝克斯, H·范赫克 申请人:拜尔作物科学公司