抗洪湖碘泡虫极丝蛋白的单克隆抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗洪湖碘泡虫极丝蛋白的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC?NO:C2013188的杂交瘤细胞株所分泌的，本发明还公开了所述单克隆抗体的制备方法和应用。本发明的单克隆抗体能特异性地与洪湖碘泡虫极丝蛋白反应，而不与其它粘孢子虫发生反应，也不与洪湖碘泡虫除极丝外的其它结构发生反应，可用于制备特异性检测洪湖碘泡虫的试剂盒，用于洪湖碘泡虫的种类鉴定，检测特异性高，反应灵敏，易于观察，适于大规模推广。
【专利说明】抗洪湖碘泡虫极丝蛋白的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种抗洪湖碘泡虫极丝蛋白的单克隆抗体及其应用。
【背景技术】
[0002]粘孢子虫(myxosporea)是一类主要感染鱼类的后生动物寄生虫，能导致养殖鱼类发生重大病害。异育银鲫(Carassius auratus gibelio (Bloch))是我国重要的淡水养殖鱼类，也是粘孢子虫的主要宿主之一，至今已在其不同组织和器官中发现30多种粘孢子虫,大部分种类对异育银鲫并不直接造成危害,但少数种类,如洪湖碘泡虫(Myxobolushonghuensis Liu et Gu, 2012)、吴李碘泡虫(Myxobolus wulii )、丑陋圆形碘泡虫(Myxobolus turpisrotundus Zhang, 2009)、武汉单极虫(Thelohanellus wuhanensis Xiaoet Chen, 1993)、龟壳单极虫(Thelohanellus testudineus Liu et Gu, 2012)等均能直接危害养殖鱼类。
[0003]然而，不同种类的粘孢子虫对鱼体造成的危害是不一致的，如洪湖碘泡虫引起的“喉孢子虫病”导致鱼种的死亡率超过90% ;丑陋圆形碘泡虫成熟胞囊位于口腔、咽腔等部位，主要造成机械损伤和阻塞，导致鱼体消瘦并影响经济价值；部分种类还会形成混合感染。由于不同种类粘孢子虫的感染机制和对鱼体造成的危害程度不一致，因而对其病害所采取的防控措施也是不一样的，故对病害必须做到准确诊断。
[0004]快速和准确鉴定病原种类是有效开展不同粘孢子虫病害防治的关键。但是，目前最广泛应用的物种 鉴定方法是依据形态学和分子生物学进行，由于粘孢子虫形态特征相对简单，同属之间的种类难以区分，其准确性主要取决于镜检设备和镜检人员的技术和经验；分子生物学敏感性高，但需获得较多物种的分子序列进行比较，且操作复杂、必须在专门实验室才能完成。遗憾的是，这些条件在养殖现场或基层服务站通常得不到满足，导致检测结果可信度下降。
[0005]极丝是粘孢子虫的重要结构，其圈数也是粘孢子虫形态分类的重要参数之一。研究发现，极丝是粘孢子虫的遗传物质，种的特异性很强。在粘孢子虫成熟后，极丝从成熟孢子的极孔中释放出来，粘附于中间宿主，进入其体内发育成放射孢子虫(actinosporean)。放射孢子虫具有同样的极丝结构，在其感染鱼类宿主时，极丝释放出来粘附于鱼体表皮组织器官(鳃、鳍条、皮肤等)，而后进入鱼体内，经过移行与发育形成成熟孢子。章晋勇等(2008)研究发现丑陋圆形碘泡虫的极丝具有较好免疫原性，但种特异性很强。对于严重危害我国异育银鲫的洪湖碘泡虫，生产实践中尚缺乏快速和准确的物种鉴定技术，这严重阻碍了喉孢子虫病防控策略的制定。因此，急需发展快速、准确、灵敏的洪湖碘泡虫的物种快速诊断技术，为“喉孢子虫病”的早期诊断和防治提供重要依据，保障异育银鲫养殖业的健康发展。
【发明内容】
[0006]本发明的第一个目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种抗洪湖碘泡虫极丝蛋白的单克隆抗体。
[0007]本发明的第二个目的是提供能分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0008]本发明的第三个目的是提供所述单克隆抗体的制备方法。
[0009]本发明的第四个目的是提供所述单克隆抗体的应用。
[0010]为了解决上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种抗洪湖碘泡虫极丝蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体对洪湖碘泡虫极丝蛋白有特异性。
[0011]本发明中所述的“特异性”是指单克隆抗体对相应抗原或近似抗原物质的识别能力，特异性高，抗原的识别能力就强。因此，上述的单克隆抗体能够特异性识别和结合洪湖碘泡虫极丝蛋白。
[0012]所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC N0:C2013188的杂交瘤细胞株1C7分泌。所述杂交瘤细胞株1C7已保藏在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期:2013年11月15日，分类命名为杂交瘤细胞株1C7。
[0013]所述杂交瘤细胞株1C7是采用洪湖碘泡虫可溶性蛋白作为抗原免疫小鼠得到的，该可溶性蛋白的SDS-PAGE分析如附图1所示。
[0014]所述可溶性蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对洪湖碘泡虫极丝蛋白 有特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C7，从所述杂交瘤细胞株1C7的培养上清液中或从注射所述杂交瘤细胞后的动物腹水中获取所述单克隆抗体。
[0015]在本发明的一具体实施例中，以洪湖碘泡虫可溶性蛋白作为抗原免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与同系动物的骨髓瘤细胞进行融合。筛选能够产生目的抗体的杂交瘤细胞，进行克隆化培养，并建立杂交细胞株。上述方法仅是示例性的，例如可以用同样的方法免疫其他哺乳动物，将其脾细胞作为免疫细胞。还可以选择适宜的骨髓瘤细胞用于融合，例如用来自大鼠、小鼠或仓鼠的骨髓瘤细胞。免疫细胞与骨髓瘤细胞的融合可以按照常规方法进行。
[0016]筛选产生目的抗体的杂交瘤细胞进行单克隆化，得到的产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞株，可以在普通培养基中传代培养或者在液氮中长时间保存。从杂交瘤细胞收集本发明的单克隆抗体时，可以从杂交瘤细胞体外培养上清液中获得抗体，或者将杂交瘤细胞注入适宜的哺乳动物并从动物腹水中获取抗体。前一种方法适于获得高纯度的抗体，后一种方法适于大量获取抗体。通过上述方法获得的抗体，可以用常规方法纯化，例如盐析、凝胶过滤、亲和层析等方法。
[0017]在本发明的第四方面，提供了一种洪湖碘泡虫免疫学种类的鉴定方法，所述免疫学种类的鉴定方法采用上述的抗洪湖碘泡虫极丝蛋白的单克隆抗体。
[0018]较佳地，所述免疫学种类鉴定方法是间接免疫荧光法(IFAT)。
[0019]本发明建立的IFAT检测试剂盒，含有本发明的单克隆抗体和用于与单克隆抗体结合的标记物(标记物可以是放射性同位素、荧光化合物、生物素和酶等物质)，以及用于检测的其他试剂和缓冲液。对于本领域的技术人员而言，根据本发明的内容，利用上述单克隆抗体，制备相应的检测产品，是显而易见的。
[0020]本发明的有益效果在于:
[0021]I)该单克隆抗体(mAblC7)可特异地与洪湖碘泡虫反应，而不与研究的其它粘孢子虫发生反应，从而可以进行洪湖碘泡虫的种类鉴定，弥补目前尚无快速、准确、便捷洪湖碘泡虫种类鉴定方法之不足，特异性高，反应灵敏。
[0022]2)该单克隆抗体(mAblC7)仅特异地与洪湖碘泡虫极丝蛋白反应，而不与其它结构发生反应。
[0023]3)本发明的免疫试剂盒可用于洪湖碘泡虫的种类鉴定，弥补目前尚无良好的洪湖碘泡虫鉴定方法之不足，特异性高，反应灵敏，成本低，适于大规模推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1:抗原(洪湖碘泡虫可溶性蛋白)的SDS-PAGE分析。M:蛋白Marker，M.honghuensis:洪湖碘泡虫可溶性蛋白。
[0025]图2:抗洪湖碘泡虫极丝蛋白的单克隆抗体1C7的免疫印迹分析(Western-blot)。M:蛋白Marker，mAblC7:单克隆抗体1C7识别的蛋白条带(Mr 180000和130000处)。
[0026]图3:抗洪湖碘泡虫极丝蛋白的单克隆抗体1C7的间接免疫荧光检测(IFAT)(标尺为10um)。a:洪湖碘泡虫光学显微镜拍照图；b:洪湖碘泡虫荧光显微镜拍照图。
【具体实施方式】
[0027]为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0028]实施例1洪湖碘泡虫抗原的制备
[0029]1.1孢子的分离纯化
[0030]用剪刀将宿主鱼体鳃盖剪开，弯头手术镊从咽部剥离完整孢囊；用磷酸缓冲液(PBS，pH7.0)洗涤3次，300rpm，离心5min ;孢囊重悬于少量PBS中，玻璃匀浆器手工匀浆直至浆液较均匀，1000rpm,离心20min，收集沉淀和上清；沉淀用适量PBS重悬，用蔗糖密度梯度(1:1, 1: 2,1: 3,1: 4,1: 5)离心，1000rpm, 15min分离出成熟孢子(位于1:1~1:2之间);成熟孢子用PBS洗漆两次,3000rpm,离心10min,去上清,沉淀物即为成熟孢子。
[0031]L 2可溶性蛋白的制备
[0032]分离纯化后的孢子经PBS (pH7.0)洗涤后，用液氮进行研磨，然后离心取上清即为孢子可溶性抗原。具体步骤如下:纯化后的成熟孢子用PBS洗涤两次，3000rpm,离心10min，去上清；沉淀用少量PBS混匀后倒入研钵，倒入液氮研磨促使壳瓣打开释放内含物；加少量PBS溶解，12000rpm离心，取上清；用BCA法测定抗原浓度。
[0033]1.3SDS-PAGE对洪湖碘泡虫可溶性蛋白分析
[0034]孢子可溶蛋白加入凝胶上样缓冲液，沸水中水浴lOmin，冰上冷却；临用前12000rpm, 4°C，离心5min取上清，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(分离胶12%、浓缩胶4% )鉴定洪湖碘泡虫可溶性蛋白(图1)。
[0035]实施例2单克隆抗体的制备
[0036]2.1动物免疫
[0037]2.1.1动物:雌性，6~8周龄BALB/c小鼠5只(购自中国科学院武汉病毒研究所)。
[0038]2.1.2抗原:实施例1中制备的洪湖碘泡虫可溶性抗原，50 μ g/只/次。[0039]2.1.3免疫途径及程序:初次免疫:洪湖碘泡虫可溶性抗原与等体积完全弗氏佐剂充分混匀，形成油包水，于鼠背部皮内多点注射。3周后第二次免疫，洪湖碘泡虫可溶性抗原与不完全弗氏佐剂等体积混匀，背部皮内多点注射。之后隔3周免疫一次(腹腔内不含佐剂)，并于免疫后第5~7天取尾血20 yL，用ELISA法测抗体效价。待抗体效价达到要求时，尾静脉加强免疫(不含佐剂)，于3天后取脾，进行细胞融合。
[0040]2.2细胞融合
[0041]2.2.1饲养细胞的制备:BALB/c小鼠拉颈处死，75 %酒精中浸泡消毒5min。剖开腹外皮肤，用5mL无血清1640培养液注入小鼠腹腔，轻轻晃动后抽出腹腔液，离心计数。用20%小牛血清1640调整细胞浓度至0.5~2X105/mL，立即种植于96孔培养板内，0.1mL/孔。
[0042]2.2.2脾细胞的制备:最后一次加强免疫后第3天，无菌取小鼠的脾脏，置于无血清的1640培养液中，用注射器内栓将脾脏撵碎，通过尼龙网过滤，制备细胞悬液。1000rpm离心5min,弃上清后重悬于5mL无血清1640培养液中，计数细胞浓度。
[0043]2.2.3骨髓瘤细胞的准备:选用小鼠骨髓瘤株SP2/0，收集对数生长期的骨髓瘤细胞，洗涤记数，调整浓度为4~5X105/mL，悬浮于无血清1640培养液中备用。
[0044]2.2.4细胞融合:将脾细胞与SP2/0细胞以10: I (细胞数比)混合，1000rpm离心5min，倾去上清，轻弹沉降下来的细胞团块，使之完全松散。以ImL移液管吸取0.7mL的50% PEG-4000在Imin内边搅拌边加入，加完后静置90s。之后以无血清1640培养液终止融合，开始时须缓慢加入(lmL/min),而后逐渐加快，边加边搅，共加入30mL终止液。整个融合过程须在37°C水浴下 进行。SOOrpm离心5min，去除上清，继续下一步操作。
[0045]2.2.5细胞培养:将离心后的细胞团块轻轻弹散。待细胞完全松散后用HAT培养基重悬，加入到已用饲养细胞铺好的96孔板中，每孔200 μ L0置于37°C, 5%(体积百分比)CO2的培养箱中培养。一周后，在倒置显微镜下观察克隆生长情况并记录每孔克隆数。待细胞生长至占培养孔底1/3面积时即可吸取培养液上清进行ELISA检测。
[0046]2.3阳性克隆的筛选和亚克隆
[0047]2.3.1ELISA检测:用包被液将洪湖碘泡虫可溶性抗原(0.5mg/mL)每孔100 μ L包被酶标板，置于4°C过夜；用洗涤液将包被好的酶标板洗涤3次，每次3min，然后用I %BSA-PBS封闭，每孔200 μ L，室温放置2h ;倾去封闭液，同上洗涤，每孔加入100 μ L待检杂交瘤细胞培养上清，于37°C孵育Ih ;倾去培养上清，洗涤后每孔加入1: 3000 (工作浓度)稀释的羊抗鼠IgG-HRP (辣根过氧化物酶)结合物100μ L，于37°C孵育lh。将多余的酶结合物弃去，同上洗涤。每孔加入100 μ L的TMB底物反应液，室温显色10~30min后，每孔加入50 μ L的终止液(2mol/L H2SO4)终止反应。用酶标仪450nm测吸光值，吸光值大于阴性孔2倍以上者为阳性，选择阳性细胞孔进行亚克隆。
[0048]2.3.2杂交瘤细胞的亚克隆(单个细胞培养):有限稀释法进行克隆化。饲养细胞的准备同2.2.1，将ELISA检测阳性孔中的细胞从培养板内轻轻洗脱计数。用培养液连续稀释细胞悬液成30个细胞/mL接种于铺有饲养细胞的96孔板内，0.1mL/孔。培养10天左右，杂交瘤细胞集落长至孔底1/3面积时，开始测定上清中抗体活性。对有抗体活性的阳性细胞孔再克隆，共进行3次。
[0049]经上述重复进行ELISA筛选及亚克隆，最后筛选出I株能稳定分泌抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为mAb 1C7，保藏号为CCTCC N0.C2013188。
[0050]2.4单克隆抗体大量制备和初步纯化
[0051]2.4.1小鼠腹水的制备及收集:将杂交瘤细胞扩大培养，选取20~22g BALB/c雌性小鼠，腹腔注射杂交瘤细胞2 X IO7/只，10~14天后待小鼠腹部明显膨胀后，收集腹水。将收集的腹水3000rpm离心5min，取上清，-20°C储存。
[0052]2.4.2腹水的初步纯化:采用盐析法,取腹水2mL加入洁净的离心管中，加2mL生理盐水混匀；逐滴加入4mL饱和硫酸铵，4°C静置2h或过夜；5000rpm离心30min,沉淀再用50%饱和硫酸铵洗涤2次；用2mL PBS使沉淀溶解，将此蛋白质溶液加入透析袋中，对PBS缓冲液4°C透析过夜，期间换液2~3次。
[0053]实施例3单克隆抗体的鉴定
[0054]3.1抗体亚类[0055]使用鼠单克隆抗体亚类检测试剂盒(Sigma)测定。将羊抗鼠IgGl, IgG2a, IgG2b,IgG3，IgA和IgM分别用包被液I: 1000稀释，10(^17孔包被，41:过夜或371:孵育211;用洗涤液PBST洗涤3次，3min/次，每孔加入100 μ L待检测的单抗细胞培养上清，37°C孵育Ih;同上洗涤3次，加入I: 5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠多价免疫球蛋白(G、A、M)抗体，每孔100yL，37°C孵育Ih ;同上洗涤3次，每孔加入新鲜配置的TMB底物溶液100 μ L，37°C避光孵育20min ;每孔加入50 μ L2M H2SO4终止反应。在酶标仪上读取OD450吸光值，以阳性反应孔包被的亚类类别为待测上清的抗体类别。鉴定结果表明，本发明制备的抗体亚类为IgM。
[0056]3.2ffestern-Blot 检测
[0057]孢子可溶蛋白加入凝胶上样缓冲液，沸水中水浴lOmin，冰上冷却；临用前12000rpm, 4°C,离心5min取上清，用于Western-blot分析；蛋白样品经12%SDS_PAGE胶(Bio-Rad Min1-Protein电泳系统)电泳分离；电泳结束后按照Mini Trans-Blot电泳转移系统操作指南装配转膜Sandwich，安装电转移系统，以80V电压冰浴转膜40min，将蛋白转移至孔径为0.45μπι的PVDF膜上；转膜缓冲液配方:25mM Tris pH8.3，192mM甘氨酸，20%甲醇；丽春红染色3min，标出Marker，其余的膜用TBST溶液(25mM Tris pH7.5，150mMNaCl，0.05%Tween-20)洗膜3次，每次IOmin ；5%脱脂奶粉(溶于TBST中)室温封闭Ih ；以1:500~1000稀释比例(根据抗体效价调整)将抗血清稀释于TBST (含1%脱脂奶粉和
0.l%Tween-20)中，室温孵育Ih ；TBST洗膜3次，每次15min ;以1: 1000稀释比例加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育Ih ；TBST (TBS溶液中加入0.l%TWeen-20)洗膜3次，每次15min，采用ECL (化学发光法)系统曝光存图。
[0058]结果如图2所示，本发明制备的单抗腹水与洪湖碘泡虫可溶性抗原在约Mr180000和130000处有特异性反应条带。
[0059]3.3间接免疫荧光(IFAT )检测
[0060]用0.1%多聚赖氨酸处理玻片lh，PBS洗涤2-3次；将本实验室采集的常见寄生于异育银鲫的粘孢子虫:洪湖碘泡虫、丑陋圆形碘泡虫、吴李碘泡虫、武汉单极虫、龟壳单极虫均匀涂在薄片上；用10%甲醇固定，30min，0.lmol/L PBS (ρΗ8.0)洗涤3次，加入本发明制备的单抗腹水(1C7)，将多克隆抗体(PAb)、阴性小鼠血清、PBS作对照；37°C，50min孵育，PBS洗涤2次；1:50稀释兔抗鼠IgG-FITC，37°C，40min ；PBS洗涤2~3次，甘油封片，荧光显微镜拍照。
[0061]图3结果显示，本发明制备的单抗腹水与洪湖碘泡虫极丝特异性结合，而不能与洪湖碘泡虫其它结构发生反应。
[0062]表1间接免疫荧光法洪湖碘泡虫鉴定结果
[0063]
【权利要求】
1.一种抗洪湖碘泡虫极丝蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体是由保藏号为CCTCCN0.C2013188的杂交瘤细胞株1C7所分泌的。
2.权利要求1中所述的杂交瘤细胞株1C7，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0.C2013188。
3.权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于:从保藏号为CCTCCN0.C2013188的杂交瘤细胞株1C7的培养上清液中或从注射所述杂交瘤细胞后的动物腹水中获取单克隆抗体。
4.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测洪湖碘泡虫的试剂盒中的应用。
5.一种检测洪湖碘泡虫的试剂盒，其特征在于:该试剂盒包含权利要求1所述的单克隆抗体。`
【文档编号】C12N5/20GK103880954SQ201410015221
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年1月14日 优先权日:2014年1月14日
【发明者】顾泽茂, 贾洛, 柳阳, 翟艳花, 袁军法, 秦建华, 李丹, 郭庆祥 申请人:华中农业大学