专利名称：一种蛋白酶抑制剂基因及其编码的蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明公开了一种蛋白酶抑制剂基因DNA序列及其编码蛋白质序列，属于基因工程领域和蛋白工程领域。具体地讲，涉及植物抗虫性、抗逆性的关键基因和酶，也涉及医学、生物化学中的蛋白酶抑制剂生产应用。
背景技术：
蛋白酶抑制剂基因在植物抗虫性、医药领域等方面的重要作用已经为人们普遍接受。它可以用于提高植物的抗虫性，使农作物减少产量损失15％以上；也可以用于治疗胰腺炎、抗肿瘤、防治脑血管疾病、心脏外科等医药方面。
分类上，蛋白酶抑制剂基因家族可划分为4类，丝氨酸蛋白酶抑制剂基因、金属蛋白酶抑制剂基因、半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因、天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因(Ryan，1992)，主要分布在4个科(Graminaceae，Leguminosae，Solanaceae，Crucifera)中。十字花科的蛋白酶抑制剂基因属于丝氨酸类型，具有与非十字花科物种的同功能基因所表达的蛋白酶结构不同。播娘蒿的蛋白酶抑制剂基因属于十字花科丝氨酸蛋白酶抑制剂基因。十字花科蛋白酶抑制剂既能够抑制胰蛋白酶，又能够抑制糜蛋白酶。检索权威性数据库NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)可知目前十字花科物种中，已经发现了9个蛋白酶抑制剂基因，它们分别是ATTI1-7、RTI、MTI-2，这些相似序列的基因已经申报的专利(参见文献Clauss M.J.，and Mitchell-Olds T.，2004.Functinal divergence in tandemly duplicated Arabodopsis thaliana trypsin inhibitorgenes.Genetics 1661419-1436)。
我们在这个双子叶杂草植物播娘蒿中，首先发现了蛋白酶抑制剂基因。
发明内容
技术问题 本发明的目的在于公开一种蛋白酶抑制剂基因及其编码蛋白，该基因来自播娘蒿，可作为目的基因导入植物，提高抗虫性，进行植物品种改良；也可以应用于蛋白工程，生产蛋白酶抑制剂制品。
技术方案本发明蛋白酶抑制剂基因(DsTI-1)，其核苷酸序列SEQ ID NO.1为GAGAGAAGATGGTCATGGCAATGAAGTCTGTTTCTACCTTCGCCATCTTTTGCATTCTCTTTTTGGTTATCTTTGAAACGTCTGAGATAGAAGCGCAGCTGCAGGAAAGACAATGCCTCAAAGAATATGGCGGTGATGTTGGTTTCAGCTTTTGTGCACCTCGAATATTCCCATCGTTCTGTGATCGGAACTGCCGTAACAACAAGGGGGCGAAAGGTGGAATATGCCGTTGGGAACAGAACAACGCTATTGGTGTTAGATGCTTATGTGACTTTTGCGGAGAAGAGCCTTCTAATCTGATTCTAAGTCGTATTTGAATCTTGCATGTGTCATGGTTTATGTGATAAGAAAGGTAAAATGGTCCACGTAATGTTATAATAATGAAGTTAAATTAAGAATAACGAAACGCAAGACTTTGCTTGTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA上述蛋白酶抑制剂基因(DsTI-1)来自播娘蒿，其编码的蛋白质，来自播娘蒿，具有活性位点环序列CAPRIFP，也具有N端分泌信号肽，属于蛋白酶抑制剂的前体蛋白。
它具有如下所示的氨基酸序列SEQ ID NO.2MVMAMKSVSTFAIFCILFLVIFETSEIEAQLQERQCLKEYGGDVGFSFCAPRIFPSFCDRNCRNNKGAKGGICRWEQNNAIGVRCLCDFCGEEPSNLILSRI有益效果1、本发明公开了一种蛋白酶抑制剂基因(DSTI-1基因)及其所编码的蛋白质。蛋白酶抑制剂基因为双子叶植物播娘蒿中的首次报道，有望应用于生物途径生产蛋白酶抑制剂。该基因来自播娘蒿(Descurainia sophia web.)，可作为目的基因导入植物，提高植物抗虫性，以进行植物品种改良。所编码的蛋白质具有抗虫功能。
2、本发明人提供的DSTI-1基因功能是具有抑制蛋白酶活性的作用。mRNA表达分析表明DSTI-1基因无论在播娘蒿幼苗，还是生长、成熟期，都受虫害、伤害、逆境诱导而表达增强。
3、本发明的DSTI-1基因来自播娘蒿，具有适合于播娘蒿、油菜、拟南芥等双子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了单子叶植物，如水稻、玉米、小麦等之外，更加适合于大豆、棉花、烟草等双子叶植物。
4、利用本发明DSTI-1基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。
5、DSTI-1基因编码产物不仅能够抑制胰蛋白酶的活性，而且能够抑制糜蛋白酶的活性，因此也可能应用蛋白质工程，以便生产蛋白酶抑制剂，应用于医学、生化研究等方面。
具体实施例方式
实施例1选用野生杂草植物播娘蒿“tx-1”(田间杂草，收集于江苏泰兴市农村，命名为tx-1)。选用成熟期角果，采用SMART技术构建cDNA全长文库。构建过程为提取播娘蒿角果总RNA，经Oligotex试剂盒纯化得到mRNA。利用含Sfi B酶切位点的CDS/3′PCR引物合成cDNA第一条链，而含Sfi A酶切位点的SMART寡核苷酸作为cDNA第一条链在mRNA 5’端延伸出去的模板。通过LD-PCR合成双链cDNA，经蛋白酶K消化、Sfi(A&B)酶切、过CHROMA PIN 400柱分级分离除去400bp以下的小分子，将其连接到λTriplEx2载体上，进行包装，即获得播娘蒿角果cDNA原始文库。大肠杆菌XL1-Blue平皿测定和PCR快速鉴定表明该文库的原始滴度为1.49×106pfu/ml，重组率为91.24％，扩增后文库滴度为1.15×109pfu/ml。
随机挑取10个噬菌斑，PCR扩增插入片段，其长度在800bp～2kb之间，说明构建的文库质量较高，能够满足ESTs文库构建及从文库中分离筛选重要基因等研究工作的需要。至此成功地构建了第一个播娘蒿角果cDNA文库，为播娘蒿优异基因克隆和系统研究播娘蒿抗逆分子机理奠定了基础。
随机挑取大量阳性噬菌斑，经转换为质粒后，采用T7 promotor引物进行测序。从大量cDNA全长序列测序结果中，获得了蛋白酶抑制剂基因。该基因的序列完整，包括编码区和非编码区。BLAST的结果及分子建模结果证明从播娘蒿中新得到的基因为一个蛋白酶抑制剂基因。该基因编码产物具有抑制蛋白酶活性位点环，具有抗虫功能。
实施例2上述获得播娘蒿蛋白酶抑制剂基因DsTI-1的cDNA序列SEQ ID NO.1，其编码的蛋白质，来自播娘蒿(Descurainia sophia)，它氨基酸序列为SEQ ID NO.2，经在数据库中比较它的编码蛋白与数据库中的蛋白酶抑制剂基因拟南芥ATTI2、白芥MTI-2、油菜RTI的氨基酸相似性分别为63％、59％、61％，与ATTI1、AATI3-7的相似性小于60％。(见SEQ ID NO.2)。DsTI-1的N端的信号肽序列表明DsTI-1定位于内质网上，与白芥、油菜、拟南芥结论是一致的。
实施例3由播娘蒿的不同组织提取RNA(RNApure kit)，经过反转录cDNA作为模板，PCR扩增。用实例1中DsTI-1 cDNA序列，设计引物P1、P2P15-TGTTTCTACCTTCGCCATCT-3；P25-CAAAGTCTTGCGTTTCGTTA-3PCR反应条件10×PCR buffer，5μl；2mM dNTP，1.5μl；引物各1μl；模板，2μl；Taq DNA聚合酶，1μl；最后加灭菌的ddH2O至总体积达50μl；PCR反应程序94℃预变性5min；变性温度为94℃，时间50s，复性温度为53℃，时间为50s，延伸温度为72℃，时间50s，33个循环；再72℃延伸10min。
半定量RT-PCR分析播娘蒿地上部的表达，结果表明，播娘蒿地上部在虫害、伤害诱导条件下，6h显著增强表达，经灰度扫描分析，其mRNA表达量为对照的3倍以上。说明DsTI-1的表达与虫害、伤害有关。该基因正常情况下，在角果和种子中表达。
实验例4根据实施例1得到的DsTI-1的全长序列，使用组成型启动子35S，构建转化DsTI-1基因的载体，这里的基因是去掉了N端信号肽和C端8个氨基酸的目的片段。
设计以下分别带有Sac1，BamH1酶切位点的一对引物，用来去掉DsTI-1基因的N端信号肽和C端8个氨基酸。下游引物将原序列TCT突变为TAA产生一个终止子。
上游引物5---GAgagctcATGGTCATGGCAATGAAGT---3下游引物5---ATggatccTTAAGGCTCTTCTCCGCAA---3利用上述引物进行PCR扩增，将PCR产物电泳回收，用Sac1，BamH1两种限制性内切酶分别酶切回收的基因片段和载体pCAM-BIA1301，回收目的基因片段和线性载体，将线性载体与目的基因片段用T4DNA连接酶在16℃下连接；转化大肠杆菌JM109感受态细胞，在LB固体培养基上(含kam抗生素)涂平板，得到的抗性菌落，挑取几个菌落经液体LB培养基培养，分别做PCR初步鉴定，提取质粒，用Sac1，BamH1双酶切、进行酶切鉴定，得到阳性克隆。再转化农杆菌LBA4404，并进行酶切鉴定，获得的阳性克隆既为携带外源质粒的农杆菌用于转化。农杆菌介导法转化油菜(双低品种，华双3号)，结果表明在幼叶中，蛋白酶抑制剂含量提高了2倍以上，老叶片中的含量提高更多。
实验例5按照实验4的基因序列，转化酵母DS115，进行表达研究。经过载体构建、转化体筛选、SDS-PAGE、蛋白的提纯、活性测定等实验，证明该基因不仅能够抑制牛胰蛋白酶的活性，而且能够抑制糜蛋白酶的活性，解离平衡常数为2×10-10和4.3×10-7，与油菜的RTI和白芥MTI-2类似。因此，根据蛋白酶抑制剂基因的作用机理，可以认为DsTI-1基因具有很好的抗虫性，其编码的蛋白也可作为蛋白酶抑制剂在医学等方面应用。
本发明人从双子叶植物播娘蒿(Descurainia sophia)中克隆了一个cDNA，编码蛋白酶抑制剂基因，命名为DsTI-1。经在数据库中比较它的编码蛋白与拟南芥、白芥、油菜的氨基酸序列有相似性，分别为63％、59％、61％。DsTI-1 cDNA全长456bp，含有306bp的ORF，编码含102个氨基酸的蛋白质，5’-UTR为7bp，3’-UTR为142bp。DsTI-1编码蛋白的N端信号肽序列表明其定位于内质网上。
mRNA表达分析表明，播娘蒿在受到虫害、伤害、逆境条件下DsTI-1基因表达增强，地上部表达量为对照的3倍以上。转基因研究表明，将DsTI-1基因转入油菜，转基因植株在正常条件下的长势类似对照，而且蛋白酶抑制剂活性高2倍以上，表明显著提高了抗虫性。该基因可作为目的基因导入植物，提高植物抗虫性，以进行植物品种改良。
综上所述，本发明人提供的DsTI-1基因是首次在双子叶植物播娘蒿中分离的新基因，其功能是生产蛋白酶抑制剂，提高植物抗虫性。可利用本发明DsTI-1基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。
本发明的DsTI-1基因来自播娘蒿，具有适合于十字花科植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等之外，也适合于水稻、玉米、小麦等单子叶植物。本发明所述的一种植物蛋白酶抑制剂基因的编码蛋白，也适合用于生产蛋白酶抑制剂。
本发明涉及的序列及记号分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度456bp(B)类型核苷酸(C)链性单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.12)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度102a.a(B)类型氨基酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)序列描述SEQ ID NO.2序列表<110>南京农业大学<120>一种蛋白酶抑制剂基因及其所编码的蛋白质(管荣展)<141>2005-03-10<160>2<170>Patentln version 3.1<210>SEQ ID NO.1<211>456<212>DNA<213>播娘蒿[Descurainia sophia]<221>CDS<222>(9)..(314)<221>5′UTR<222>(1)..(7)<221>mRNA<222>(1)..(456)<221>polyA_site<222>(427)..(456)<221>polyA_sitel<222>(315)..(426)<400>1gagagaag atg gtc atg gca atg aag tct gtt tct acc ttc gcc atc ttt50Met Val Met Ala Met Lys Ser Val Ser Thr Phe Ala Ile Phe1 5 10tgc att ctc ttt ttg gtt atc ttt gaa acg tct gag ata gaa gcg cag 98Cys Ile Leu Phe Leu Val Ile Phe Glu Thr Ser Glu Ile Glu Ala Gln15 20 25 30ctg cag gaa aga caa tgc ctc aaa gaa tat ggc ggt gat gtt ggt ttc 146Leu Gln Glu Arg Gln Cys Leu Lys Glu Tyr Gly Gly Asp Val Gly Phe35 40 45
agc ttt tgt gca cct cga ata ttc cca tcg ttc tgt gat cgg aac tgc194Ser Phe Cys Ala Pro Arg Ile Phe Pro Ser Phe Cys Asp Arg Asn Cys50 55 60cgt aac aac aag ggg gcg aaa ggt gga ata tgc cgt tgg gaa cag aac242Arg Asn Asn Lys Gly Ala Lys Gly Gly Ile Cys Arg Trp Glu Gln Asn65 70 75aac gct att ggt gtt aga tgc tta tgt gac ttt tgc gga gaa gag cct290Asn Ala Ile Gly Val Arg Cys Leu Cys Asp Phe Cys Gly Glu Glu Pro80 85 90tct aat ctg att cta agt cgt att tgaatcttgc atgtgtcatg gtttatgtga 344Ser Asn Leu Ile Leu Ser Arg Ile95 100taagaaaggt aaaatggtcc acgtaatgtt ataataatga agttaaatta agaataacga 404aacgcaagac tttgcttgtg tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 456<210>SEQ ID NO.2<211>102<212>PRT<213>播娘蒿[Descurainia sophia<400>2Met Val Met Ala Met Lys Ser Val Ser Thr Phe Ala Ile Phe Cys Ile1 5 10 15Leu Phe Leu Val Ile Phe Glu Thr Ser Glu Ile Glu Ala Gln Leu Gln20 25 30Glu Arg Gln Cys Leu Lys Glu Tyr Gly Gly Asp Val Gly Phe Ser Phe35 40 45Cys Ala Pro Arg Ile Phe Pro Ser Phe Cys Asp Arg Asn Cys Arg Asn50 55 60Asn Lys Gly Ala Lys Gly Gly Ile Cys Arg Trp Glu Gln Asn Asn Ala65 70 75 80Ile Gly Val Arg Cys Leu Cys Asp Phe Cys Gly Glu Glu Pro Ser Asn85 90 95Leu Ile Leu Ser Arg Ile100
权利要求
1.一种蛋白酶抑制剂基因(DsTI-1)，来自播娘蒿(Descurainia sophia)，命名为DsTI-1基因，其核苷酸序列SEQ ID NO.1为GAGAGAAGATGGTCATGGCAATGAAGTCTGTTTCTACCTTCGCCATCTTTTGCATTCTCTTTTTGGTTATCTTTGAAACGTCTGAGATAGAAGCGCAGCTGCAGGAAAGACAATGCCTCAAAGAATATGGCGGTGATGTTGGTTTCAGCTTTTGTGCACCTCGAATATTCCCATCGTTCTGTGATCGGAACTGCCGTAACAACAAGGGGGCGAAAGGTGGAATATGCCGTTGGGAACAGAACAACGCTATTGGTGTTAGATGCTTATGTGACTTTTGCGGAGAAGAGCCTTCTAATCTGATTCTAAGTCGTATTTGAATCTTGCATGTGTCATGGTTTATGTGATAAGAAAGGTAAAATGGTCCACGTAATGTTATAATAATGAAGTTAAATTAAGAATAACGAAACGCAAGACTTTGCTTGTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
2.权利要求1所述的一种蛋白酶抑制剂基因(DsTI-1)，来自播娘蒿(Descurainiasophia)，命名为DsTI-1基因，其编码蛋白质序列SEQ ID NO.2为MVMAMKSVSTFAIFCILFLVIFETSEIEAQLQERQCLKEYGGDVGFSFCAPRIFPSFCDRNCRNNKGAKGGICRWEQNNAIGVRCLCDFCGEEPSNLILSRI
全文摘要
本发明公开了蛋白酶抑制剂基因cDNA序列及其编码蛋白质序列，属于基因工程领域和蛋白工程领域。播娘蒿蛋白酶抑制剂基因DsTI－1的cDNA序列SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列SEQ ID NO.2。本发明基因为双子叶植物播娘蒿中的首次报道，参与播娘蒿抗虫反应，mRNA表达分析表明该基因受虫害、伤害诱导表达。转基因实验证明该基因的超量表达能够显著提高了油菜的抗虫性。DsTI－1可作为目的基因导入植物，提高植物抗虫性。酵母表达产物具有抑制蛋白酶活性的作用，该基因和其编码蛋白也可以应用于医药和生化领域。
文档编号C07K14/415GK1721537SQ20051004045
公开日2006年1月18日 申请日期2005年6月9日 优先权日2005年6月9日
发明者管荣展, 董海滨, 张红生, 王建飞 申请人:南京农业大学