专利名称：高效降解两种真菌毒素的工程菌及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于发酵及生物技术领域，具体涉及两种真菌毒素高效降解工程菌的构建及其应用。
背景技术：
真菌毒素是产毒真菌在危害过程中产生的一类次生代谢物质，主要包括黄曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和伏马毒素(FUM)和赭曲霉毒素等，近几年，由于我国极端气候的频繁出现，导致了以危害小麦、玉米为主的赤霉病的大流行，该菌危害产生的DON和ZEN污染加重，污染超标的小麦和玉米不断增加，为保障我国的人民消费安全和畜牧养殖安全，国家粮食局及有关部门对2010年我国黄淮海地区小麦收获季节 感染严重的赤霉病，导致脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)大面积超标毒素超标小麦及时进行了封存，共计174. 5万吨。由于缺乏行之有效的安全处理技术，目前仍处于封存状态。2012年的赤霉病导致的小麦产量减产和毒素超标减产也极为严峻。对于真菌毒素(DON和ZEN)的清除，目前国内外较为普遍的方法主要有物理去除及吸附、化学处理等。对已经污染真菌毒素谷物的物理、化学处理方法主要有冲洗和漂洗、热处理、离子福射、无机吸附、化学试剂的处理及臭氧氧化等，Bullerman等认为通过清洗，可以将被污染的小麦和大麦中DON降低5. 5% 19%,但实际上毒素是通过浸洗过程溶解于浸液或转移到其他副产品中，并不会真正被破坏。当前的吸附剂对于这两种真菌毒素基本没有效果，而且无机吸附剂还大量吸附了饲料和食品中的微量营养物质，被黏土吸附后的DON,无法被分解，会弓I起二次污染。生物降解不仅可以高效将毒素转化为无毒产物、环保安全，而且生物酶催化方法专一性强、转化效率高。已经成为当前真菌毒素削减技术中最有发展前景的处理技术途径，其不仅安全、环保、高效，而且利用现代生物技术开展研究非常符合当前我国节能减排的发展趋势。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种高效降解DON和ZEN两种真菌毒素的工程菌。具体地，利用外源基因重组表达技术获得可同时降解两种毒素的工程菌，该工程菌可直接有效地应用于真菌毒素的削减.。本发明要解决的第二个技术问题是提供高效降解DON和ZEN两种真菌毒素的工程菌的应用。为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案本发明提供一种高效降解两种真菌毒素的工程菌，是将脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的编码基因和玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因导入宿主菌中，得到可降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的工程菌。所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的编码基因和玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因可以采用现有技术中已经公开的降解酶编码基因。进一步地，本发明提供了一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的编码基因和玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因，其中，所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的编码基因如序列表中SEQ ID NO: I所示，其对应的氨基酸序列如序列表中SEQID NO 2所示；所述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因如序列表中SEQ ID NO 3所示，其对应的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。进一步地，所述宿主菌为酵母菌、芽孢杆菌或乳杆菌。更优选地，所述酵母菌为毕赤酵母或酿酒酵母；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌或纳豆芽孢杆菌；所述乳杆菌为嗜热乳杆菌。本发明所述工程菌可以采用现有技术中已知的构建方法，包括但不限于I、通过PCR方法分别扩增获得玉米赤霉烯酮降解酶基因和脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因，分别插入到表达载体PPIC9K上，将含有两种降解酶基因的混合载体通过电击转化毕赤酵母，得到同时表达玉米赤霉烯酮降解酶和脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的毕赤酵母基因工程菌，该工程菌具有同时降解ZEN和DON两种真菌毒素的能力。 2、通过PCR的方法，以在毕赤酵母中外分泌重组表达载体DNA为模板，扩增获得具有外分泌功能的α交配因子核酸序列，通过双酶切将该核酸片段插入到酿酒酵母表达载体pYES2上，随后通过PCR方法分别扩增获得玉米赤霉烯酮降解酶基因和脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因，分别插入到上述新构建的含α交配因子核酸序列的酿酒酵母表达载体PYES2上；然后通过电击转化含有两种降解酶基因的混合载体，得到同时表达玉米赤霉烯酮降解酶和脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的酿酒酵母工程菌，该工程菌具有表达并外分泌玉米赤霉烯酮降解酶和脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶的能力。3、通过PCR扩增玉米赤霉烯酮降解酶基因和脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因，分别连接入ΡΗΤ315载体上，获得相应的重组表达载体，经电击转化芽孢杆菌或乳杆菌，获得含有玉米赤霉烯酮降解酶基因和脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因的工程菌。本发明还保护工程菌在降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮中的应用。本发明的有益效果现有真菌毒素削减技术仅限于在被真菌毒素污染的原料中添加粘土、高岭土等物理吸附剂，也仅对黄曲霉毒素有一定的吸附效果，而对脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等几乎没有吸附效果，而且由于缺乏专一性而吸附了大量营养成分。目前为止，国内外还没有可高效、绿色和规模化降解这两种真菌毒素的处理技术。本发明的工程菌为开发绿色环保、高效，可保障产品的真菌毒素大幅削减的工艺和技术提供了优良的微生物菌株。
图I为DON降解酶基因PCR产物电泳图谱，M =Marker ;1_6 D0N降解酶基因PCR产物；图2为ZEN降解酶基因PCR产物电泳图谱，M =Marker ;1_5 =ZEN降解酶基因PCR产物；图3为外分泌重组质粒SCWES2的物理图谱；图4为外分泌重组载体SCWES2双酶切验证图谱，M =Marker;BiBlank; I =SCff基因PCR片段；2 :载体pYES2双酶切片段；3 :外分泌重组表达载体SCWES2双酶切片段
图5为DON降解酶基因重组表达载体的物理图谱；图6为DONase基因外分泌重组表达载体SCWTES2双酶切鉴定图，M =Marker; I DONase基因PCR片段；2 :重组载体SCWTES2双酶切片段；3 :重组外分泌表达载体SCWES2双酶切片段；图7为ZEN降解酶基因重组表达载体的物理图谱；图8为ZDase基因外分泌重组表达载体SCWTES2双酶切鉴定图，M =Marker; I :重组外分泌载体SCWES2双酶切片段；2 :重组表达载体SCWZES2双酶切片段；3 =ZDase基因PCR片段；图9为酿酒酵母转化子的D0N\ZEN降解酶基因的PCR鉴定电泳图谱，M =Marker ；B:Blank; 1-4 :酿酒酵母转化子D0N\ZEN降解酶基因PCR产物；
图10为酿酒酵母工程菌表达DON降解酶和ZEN降解酶SDS-PAGE电泳图谱，M Marker ；B Blank ；1, 2 :酿酒酵母转化子 SCWZT ；图11为受体菌株INVScl在发酵时期对ZEN、DON两种毒素的降解能力曲线；图12为酿酒酵母重组菌株在发酵时期对ZEN、DON两种毒素的降解能力曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例I :真菌毒素DON降解酶基因DONase的克隆脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因质粒文库的建立(I)将标准菌株尖抱键刀菌(Fusarium oxysporum) ACCC No. 36245 (购自中国农业微生物菌种保藏管理中心)活化后接入PDA液体培养基(马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，PH自然)，然后将菌株的悬浮液接入IOOml同样的培养基，摇床条件为220转/分钟，30°C，72小时。培养完成后用离心机12000转/分钟离心收集菌体。提取RNA (Trizol法)；(2)以RNA为模板逆转录合成cDNA序列；2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因的获得以步骤I中获得的cDNA序列为模板，在引物I和引物2的引导下进行PCR反应，
扩增脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因的序列。上游引物PI : 5’ GGAATTCCATATGACTGCACTAAACGTTACAAAC3’ (划线部分碱基为 NdeI识别位点)上游引物P2 :5’ CCCAAGCTTCTAGCCAATGAATTGCCCATAC3'(划线部分碱基为 Hind III识别位点)在PCR反应中，PCR反应条件为94°C，保持5分钟，接着按以下的温度变化程序循环30次升温至94°C，保持I分钟，降温至54°C，保持I分钟，升温至68°C，保持2分钟；然后于68°C，保持10分钟，最后于4°C保温10分钟，结束扩增反应。通过琼脂糖电泳分析获得约I. 4kb的单一带(见图I )，扩增之后的PCR产物检测之后将目的带大小的扩增产物用DNA凝胶回收试剂盒进行回收，并检测其浓度。回收PCR产物连接pMD19-TVeCtor转化大肠杆菌JM109，获得重组质粒pMD19-Dasag测序鉴定。则该脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解酶基因DNA序列为序列表SEQ ID NO :I,其对应的氣基酸序列为序列表SEQ ID NO :2。实施例2 :真菌毒素ZEN降解酶基因ZDase的克隆以标准菌株粉红粘帚霉ACCCNo. 31535基因组DNA为模板进行PCR扩增。设计如下引物，分别引入EcoRI和NotI识别位点(用下划线标出)上游引物P3 5' -CCG GAA TTC ATG CGC ACT CGC AGC ACAAT-3，下游引物P4 5' -ATAAGAAT GCG GCC G CAAGA TAC TTC TGC GTAAAT T-3’PCR反应在50 μ LPCR反应混合液中含有25 μ L KOD酶Mix，12. 5 μ moL/L引物各2μ L，模板10 μ L，加无菌水11 μ L调整至50 μ L.条件为94°C，变性5min，循环参数94°C变性40s ;54°C退火Imin ;68°C延伸Imin ；30个循环；68°C延伸IOmin使产物延伸完全。将得到PCR产物进行I. 0%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2，得到一条约O. Skb条带，其大
小与预期相当，具体方法参见中国专利
发明者吴子丹, 孙长坡, 任保中, 伍松陵 申请人:国家粮食局科学研究院