一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株及其构建方法与流程

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株及其构建方法。

背景技术：

许多不饱和脂肪酸因其广泛的生理活性和其在人类健康、营养方面的重要作用越来越受人们关注；多肽药物又因其半衰期短、易被酶降解而限制了应用。

微生物油脂的合成过程与动植物几乎相似，最主要的部分就是脂肪酸的合成，主要有两种胞质酶系催化，乙酰coa羧化酶和脂肪酸合酶复合体，以乙酰coa为碳源经过多次碳链延长合成饱和脂肪酸，或再经过去饱和作用合成不饱和脂肪酸。在去饱和过程中主要由各种去饱和酶负责催化，是合成长链不饱和脂肪酸的关键，能在脂肪酸碳链上引入c＝c双键，提高脂肪酸的不饱和度，酵母中广泛存在脂肪酸去饱和酶。

而合成不饱和脂肪酸的酶分为两种，甲基定向和羧基定向的脂肪酸去饱和酶。甲基定向的脂肪酸去饱和酶从甲基端固定的碳原子处引入碳碳双键，被称为ω-去饱和酶；羧基定向的脂肪酸去饱和酶从羧基端固定的碳原子处引入碳碳双键，被称为δ(delta)-去饱和酶，也称为“front-end”去饱和酶。δ9-去饱和酶将第一个碳碳双键引入饱和脂肪酸中，第二个碳碳双键由δ12和δ6-去饱和酶负责引入，δ15去饱和酶则负责引入第三个双键。

在细胞合成18c饱和脂肪酸后，硬脂酸经硬脂酰-coa去饱和酶去饱和得到油酸；油酸经δ12-去饱和酶催化生成亚油酸，经δ15-去饱和酶合成α-亚麻酸(ala)；亚油酸经δ6-去饱和酶催化生成γ-亚麻酸gla。其中，δ6-去饱和酶是gla合成途径中的关键酶，第一次克隆出δ6-去饱和酶是1993年从蓝藻中分离克隆得到的，第一次通过生物技术获得gla是在1996年在土豆中表达蓝藻的δ6-去饱和酶基因生产gla。gla在人体中进一步脱氢延长形成花生四烯酸(aa)、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质，对人体有重要生理意义，因而近年人们对δ6-脂肪酸脱氢酶基因的研究热度较高，也取得了较大进展。

虽然已经有多篇报道表明，表达外源δ6-脂肪酸脱氢酶在酵母中会使gla含量增加，但是迄今为止，尚未出现利用基因工程构建可以高产γ-亚麻酸(gla)的酵母菌菌株的报道。

技术实现要素：

针对以上所述现有技术存在的不足，本发明的第一目的是提供一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株。

本发明的第二目的是提供所述高产不饱和脂肪酸重组工程菌株的建方法。

为解决上述的技术问题，本发明采用如下技术方案：一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株，将δ6-去饱和酶(d6d)整合到工程菌的基因组中。

优选的，所述工程菌可以是酵母菌，所述酵母菌是酿酒酵母。所述酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)cgmmcc2.1445。

优选的，所述酵母菌是粘红酵母。

所述δ6-去饱和酶(d6d)有刺孢小克银汉霉的d6d基因的分离与扩增得到的。

一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株构建方法,其包括的步骤如下：

(1)表达载体ppgk1z-rd-me的抽提；

(2)连接pgk1基因和d6d基因；

(3)pgk1-d6d片段与表达载体载体的双酶切反应、连接。

表达载体ppgk1z-rd-me的抽提的方法的步骤如下：

(1)将含有ppgk1z-rd质粒的大肠杆菌dh5α接种到装有5mllb-amp培养基中，于37℃下250rpm振荡培养过夜；

(2)吸取1.5ml过夜菌液于离心管中，4℃下12000rpm离心1分钟，弃上清；

(3)用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将菌体沉淀悬浮于200μlstet缓冲液中，用涡旋混合器充分混匀；

(4)加入4ml新配制的溶菌酶溶液，混匀后于室温下静置5分钟；

(5)用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时45秒，取出后立刻12000rpm离心5分钟；

(6)用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入8ml5％ctab，用混合器混匀后，13000rpm离心5分钟，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体；

(7)加入1.2mnacl300ml，充分溶解沉淀物，再加入750ml的预冷乙醇，充分混匀后，13000rpm离心15分钟，弃上清液；

(8)取1ml70％冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，13000rpm离心5min，弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥5-10min；

(9)沉淀物溶于50mlte缓冲液中，混合器混匀，于-20℃保存备用。

连接pgk1基因和d6d基因的引物为：

pgk1-bamhiprimer1：

5′-cgcggatcctatttagattcctgacttcaactc-3′(bamhi)

pgk1-xhoiprimer2：

5′-tatccgctcgagtgttttatatttgttgaaaaagtagatgtcgcctattatt-3′

(xhoi)

d6d-xhoiprimer1：

5′-tctgctttcttcgctccgctcgagatgtcagggcaaactcgag-3′(xhoi)

d6d-xhoiprimer2：

5′-catgccatggatcatctaaaacatcttttgagag-3′(ncoi)。

工程菌与d6d基因片段的摩尔比要控制在1:3-10。

所述高产不饱和脂肪酸重组工程菌株用于作为外源亲脂类分子、多肽或化合物的药物引入的运载体。

所述高产不饱和脂肪酸重组工程菌株用于作为外源亲脂类分子、多肽或化合物的功能性食品引入人体的运载体。

外源亲脂多肽药物可以是α-msh或者多肽h22lp。h22lp是实验室前期筛选得到的广谱趋化因子受体us28拮抗肽。us28作为人类巨细胞病毒(hcmv)编码的4个七跨膜趋化因子受体之一，是一个广谱的cc类炎症趋化因子受体，在hcmv感染的细胞中对β趋化因子的结合和钙流信号诱导起重要作用。我们通过对us28进行跨膜结构域和结合模拟位的预测，寻找出其n端与趋化因子激动的部位，合成相应部位的多肽，最终筛选出能阻断us28与其对应的cc类趋化因子相互作用、具有更少免疫原性和更强活性以用来作为拮抗剂的小分子先导物h22lp，经前期实验证明h22lp可以通过直接与病毒颗粒作用来达到抑制hcmv的效果。

本发明具有如下有益效果：成功构建了外源基因d6d表达载体ppgk1z-rd-d6d，实现外源d6d基因在粘红酵母gm4菌株内的高效表达，经双酶切鉴定，重组质粒上的目的片段插入方向正确；将重组质粒导入粘红酵母中，经转化菌株pcr鉴定，重组质粒成功导入粘红酵母中并插入到粘红酵母的基因组中，实现了d6d的稳定、长久表达；实时荧光定量pcr表明d6d的表达水平提高了2倍左右；经气相色谱法分析，转化菌株中的gla较野生菌株提高了3.3倍多。

附图说明

图1是粘红酵母整合表达载体ppgk1z-rd-d6d的构建的技术路线图；

图2是菌落形态图观察照片；

图3是pgk1(a)和d6d(b)基因的pcr扩增条带图；

图4是粘红酵母转化菌株gm4-d6d的插入片段d6d的pcr检测图(其中1、2、3道为重组菌株，4、5、6道为空载体菌株)；

图5是重组质粒ppgk1z-rd-d6d双酶切鉴定图(以ppgk1z-rd做对照，其中1道为ppgk1z-rd-d6d，2道为ppgk1z-rd)；

图6是粘红酵母d6d基因表达水平图。

具体实施例

为了更好地阐述本发明内容，下面用若干较佳的具体实施例进行说明。但这些具体实施例只是为了说明本发明的内容，而不是对本发明内容进行限制。

2.1实验材料与仪器说明

2.1.1菌种

粘红酵母(rhodotorulaglutinis)gm4为经常规手段筛选并保存；

酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)2.1445购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmmcc)；

刺孢小克银汉霉(cunninghamellaechinulata)mian6；

大肠杆菌(escherichiacoli)dh5α。

2.1.2质粒

表达载体ppicz-rd，构建并保存。

2.1.3培养基及主要试剂

(1)ypd培养基(1l)：

酵母浸出物(yeastextract)10g

蛋白胨(peptone)20g

葡萄糖(dextrose)20g

蒸馏水1000ml

溶解后1×10⁵pa灭菌20min，使用固体培养基时另添加琼脂20g(agar)。

(2)ypd-zeocin培养基(1l)：

ypd培养基另外加浓度为50μg/ml的zeocin。

(3)luria-bertani(lb)培养基(1l)：

胰蛋白陈(typtone)10g

酵母提取物(yeastextract)5g

nacl10g

将上述材料加蒸馏水950ml，用naoh溶液调节ph至7.0-7.2，加水至1l，1×10⁵pa灭菌20min，使用固体培养基时另添加琼脂(agar)20g。

(4)lb-ampicillin培养基(g/l)：

lb培养基另外加浓度为100μg/ml的氨苄西林。

(5)低盐lb-zeocin培养基：

胰蛋白陈(typtone)10g

酵母提取物(yeastextract)5g

nacl5g

将上述材料加蒸馏水950ml，用naoh溶液调节ph至7.0-7.2，加水至1l，1×10⁵pa灭菌20min，另外添加浓度为50μg/ml的zeocin，使用固体培养基时另添加琼脂(agar)20g。

(6)potatodextroseagar(pda)培养基(g/l)：

土豆浸提液200g，葡萄糖20g，琼脂(agar)20g，溶解后1×105pa灭菌20min，使用液体培养基时无需加琼脂。

(7)stet缓冲液：

tris-hcl：

12.11gtris溶于60ml无菌水，浓盐酸调ph值为8.0，

edta：

na2edta18.61g，溶于60ml无菌水，ph调节至8.0，

取tris-hcl溶液12.5ml，edta溶液25ml，trionx-10020g，8％的蔗糖溶液150ml充分混合并定容到250ml即得。

(8)te缓冲液：

10.0mmtris-hcl，1.0mmedta，ph调至7.5。

(9)10％sds(十二烷基硫酸钠)：

10gsds溶于90ml去离子水，ph调至7.2。

(10)质粒提取液

溶液i：50mmol/l葡萄糖(dextrose)、10mmol/ledta、25mmol/ltris-hcl(ph8.0)，高压灭菌，4℃保存；

溶液ii：0.2mol/lnaoh(来源于10mol/l的母液稀释)、1％sds，现用现配；

溶液iii：kac29.4g、醋酸(aceticacid)11.5ml、ddh2o28.5ml，4℃保存；

(11)10xdnabuffer链接缓冲液配制

配制好的的缓冲液保存于-20℃。

(12)tricinesds-page电泳试剂

a.正极缓冲液(10x)：

称取242.28gtris，溶解于750ml去无菌去离子水中，再用1.0mol/l的盐酸将ph调至8.9，加水至1l。

b.负极正极缓冲液(10x)：

称取121.14gtris，179.16gtricine，10gsds溶解于650ml去无菌去离子水中，加入去无菌去离子水中至终体积1l。

c.凝胶缓冲液(3x)：

称取363.0gtris，3.0gsds，溶解于600ml，无菌离子水中，再用1.0mol/l的盐酸将ph调至8.5，再加水稀释至1000ml。

d.固定液：

用量筒量取500ml甲醇，100ml冰醋酸，量取0.1mol醋酸铵，加无菌去离子水定容到1000ml。

e.染色液：

称量马斯亮蓝g-250200mg，溶解于100ml95％的乙醇中，加入200ml85％的磷酸，加水定容到1000ml，棉花过滤。

f.脱色液：

量取醋酸100ml，乙醇50ml，加无菌去离子水定容到1000ml，摇匀。

g.样品缓冲液：

量取0.5mol/ltris-hcl(ph6.8)2ml，巯基乙醇1ml，无水甘油2ml，称取sds0.4g，溴酚蓝0.02g，ph值调节至7，加无菌去离子水配成20ml。

h.ab-3储存液(49.5％t，3％c)：

称取19.2g丙烯酰胺，0.6g甲叉双丙烯酰胺，溶解定容止于40ml无菌去离子水，过滤。

i.ab-6储存液(49.5％t，3％c)：

称取18.6g丙烯酰胺，1.2g甲叉双丙烯酰胺，溶解定容止于40ml无菌去离子水，过滤。

j.16％分离胶

k.10％夹层胶

l.4％浓缩胶

其它试剂：

2.1.4主要仪器

2.2.1目的基因的分离与扩增

2.2.1.1酿酒酵母pgk1基因的分离与扩增

1、分离：

(1)酿酒酵母接种于50ml/250mlypd液体培养基中，30℃，180rpm培养至od660达到3时离心(12000r/min，5min，4℃)，弃上清，收集菌体；

(2)无菌水冲洗菌体两次，离心后用冷的无菌水重悬菌体，菌悬液转移至含有液氮和1g矾土的研钵中研磨破碎菌体细胞；

(3)将破碎的菌体细胞转移至5mldna提取缓冲液中(50mmtris,10mmmgcl2,50mmnacl，1％(wt/vol)sds，ph7.4)的离心管中；

(4)经过反复的苯酚/氯仿抽提以及乙醇沉淀步骤，酿酒酵母dna被分离出来。

2、pcr扩增：

根据pgk1基因序列，设计引物。

正向引物5′-cgcggatcctatttagattcctgacttcaactc-3′(bamhi)

反向引物5′-tatccgctcgagtgttttatatttgttgaaaaagtag-3′(xhoi)

pcr反应体系为：

pcr反应条件：

取5μlpcr扩增产物待经2％琼脂糖凝胶电泳分析。

2.2.1.2刺孢小克银汉霉d6d基因的分离与扩增

1、分离：

刺孢小克银汉霉总rna的提取操作流程参考wan和zhang等人的方法[47]。

(1)刺孢小克银汉霉在pda液体培养基中于28℃，240rpm/min生长3天，菌丝通过过滤收集，并用磷酸盐缓冲液冲洗；

(2)加入液氮研磨后迅速转入已加有适量trizol(invitrogen)的离心管中来提取总rna；

(3)用oligotexmrnaminikit(qiagen)从总rna中提取mrna。

2、pcr扩增：

根据已公布的刺孢小克银汉霉d6d基因序列(genbankaccessionnumber：dq177498)，设计引物。

d6d引物：

正向引物5′-ccgctcgagatgtcagggcaaactcgag-3′(xhoi)

反向引物5′-catgccatggatcatctaaaacatcttttgagag-3′(ncoi)

3、反转录(rt)反应：

(1)每次rt反应中，按下表加入各组分：

(2)70℃放置5分钟，然后迅速置于冰上5分钟；

(3)顺次加入如下组分：

(4)37℃反应1小时。

(5)75℃孵育15分钟终止反应，保存于-20℃或直接用于下游实验。

4、pcr反应：

pcr反应体系为：

pcr反应条件：

取5μlpcr扩增产物待经2％琼脂糖凝胶电泳分析。

2.2.1.3凝胶电泳与pcr产物回收

1、凝胶电泳：

(1)制备2％琼脂糖凝胶：称取2g琼脂糖，加入100ml1×tae电泳缓冲液，微波炉加热，直至完全融化，加入1.5μl10mg/ml的eb，摇匀；

(2)将琼脂糖凝胶液冷却至70℃左右，倒入已放好的制胶槽内，冷却直至成凝胶，将凝胶及胶槽取出，放置于电泳槽内，加入1xtae电泳缓冲液直至浸没凝胶；

(3)把上样缓冲液(溴酚蓝)混合到dna样品，用移液枪将样品加入到凝胶板的小槽内；

(4)加样后，立即通电进行电泳，电压120v，当溴酚蓝将至凝胶顶端时，停止电泳；

(5)取出凝胶，用含有0.5μg/ml的eb/1xtae溶液染色30min，再用蒸馏水清洗15min；

(6)在紫外灯下观察，观察到条带后，采用凝胶成像系统拍照保存。

2、pcr产物回收：

使用紫外光显影出目的dna条带，用切片刀切割相应的琼脂带，置入离心管中；

(1)加入bindingbufferii(7～4μl/1mg琼脂凝胶)，于60℃水浴摇匀，直至完全溶解；

(2)将溶解的琼脂凝胶放进uniq-10柱子中5min,用收集管收集滤液，8000rpm常温离心15min

(3)弃去收集的废液，取下uniq-10柱，入600μlwashsolution，8000rpm离心2min；

(4)重复步骤(3)；

(5)取出uniq-10柱放于新的离心管中，在柱子膜中央加入40μlelutionbuffer，50℃中放置5min；

(6)室温下12000rpm离心1min，液体即为回收dna，-20℃冻存备用。

2.2.2表达外源d6d整合载体ppgk1z-rd-d6d的构建

2.2.2.1整合载体ppgk1z-rd-d6d的构建路线图

利用同源重组原理设计d6d基因整合表达载体，构建技术路线见图1：

2.2.2.2表达载体ppgk1z-rd-me的抽提

ppgk1z-rd质粒为本实验室构建并保存的，按照以下步骤抽提质粒：

(1)将含有ppgk1z-rd质粒的大肠杆菌dh5α接种到装有5mllb-amp培养基中，于37℃下250rpm振荡培养过夜；

(2)吸取1.5ml过夜菌液于离心管中，4℃下12000rpm离心1分钟，弃上清；

(3)用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将菌体沉淀悬浮于200μlstet缓冲液中，用涡旋混合器充分混匀；

(4)加入4ml新配制的溶菌酶溶液，混匀后于室温下静置5分钟；

(5)用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时45秒，取出后立刻12000rpm离心5分钟；

(6)用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入8ml5％ctab，用混合器混匀后，13000rpm离心5分钟，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体；

(7)加入1.2mnacl300ml，充分溶解沉淀物，再加入750ml的预冷乙醇，充分混匀后，13000rpm离心15分钟，弃上清液；

(8)取1ml70％冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，13000rpm离心5min，弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥5-10min；

(9)沉淀物溶于50mlte缓冲液中，混合器混匀，于-20℃保存备用。

2.2.2.3重叠pcr连接pgk1和d6d

为了实现外源基因d6d在强启动子pgk1的带动下高效表达，我们用overlappcr将强启动子pgk1基因和d6d基因片段连接，以保证两个基因片段之间无其他序列，从而避免因其他基因的引入糙造成目的基因表达异常。

用于pgk1和d6d的overlappcr引物如下：

pgk1-bamhiprimer1：

5′-cgcggatcctatttagattcctgacttcaactc-3′(bamhi)

pgk1-xhoiprimer2：

5′-tatccgctcgagtgttttatatttgttgaaaaagtagatgtcgcctattatt-3′(xhoi)

d6d-xhoiprimer1：

5′-tctgctttcttcgctccgctcgagatgtcagggcaaactcgag-3′(xhoi)d6d-xhoiprimer2：

5′-catgccatggatcatctaaaacatcttttgagag-3′(ncoi)

分别以pgk1-bamhiprimer1、pgk1-xhoiprimer2和d6d-xhoiprimer1、d6d-xhoiprimer2分别扩增pgk1和d6d，5个循环后回收pgk1和d6d片段，以回收的pgk1和d6d片段为共同模板，pgk1-bamhiprimer1和d6d-xhoiprimer2为上、下游引物进行overlappcr，得到pgk1-d6d片段。

overlappcr反应体系为：

pcr反应条件：

2.2.2.4pgk1-d6d片段与载体的双酶切反应、连接

1、将overlappcr产物与ppgk1z-rd分别进行ncoi和bamhi双酶切

质粒ppgk1z-rdncoi/bamhi双酶切反应体系：

片段pgk1-d6dncoi/bamhi双酶切反应体系：

酶切反应在37℃水浴反应3小时。

2、连接反应

酶切反应后,pgk1-d6d片段和载体ppgk1z-rd分别用回收试剂盒回收纯化,然后用t4dna连接酶连接双酶切后的载体ppgk1z-rd和pgk1-d6d片段,构建重组质粒ppgk1z-rd-d6d。

连接反应反应体系如下:

16℃水浴过夜反应,载体与外源dna片段的摩尔比要控制在1:3-10。

2.2.3重组质粒ppgk1z-rd-d6d电转化粘红酵母感受态细胞

2.2.3.1粘红酵母感受态的制备

1、挑取酵母单菌落接种在5mlypd液体培养基，于30℃，250rpm振荡培养过夜；

2、以1％接种量转接至100mlypd液体培养基，于30℃，250rpm振荡培养至细胞od600≈1.4；

3、菌液于4℃，3000g离心5min沉淀细胞，弃上清，用100ml无菌水重悬；

4、重复步骤三；

5、4℃，3000g离心2min沉淀细胞，弃上清，用20ml冰预冷的1m山梨醇重悬细胞；

6、4℃，3000g离心2min沉淀细胞，弃上清，用200μl1m山梨醇重悬细胞，用于转化；

2.2.3.2质粒线性化

将约10μg重组质粒ppgk1z/rd/d6d用saci进行单酶切,酶的用量、酶切时的温度,参照厂家说明书,完全酶切所用的时间要特别注意,既不能部分酶切,亦不能将质粒消化掉,这对电转的效率有着十分重要的作用。

酶切体系如下所示:

2.2.3.3电转化

将线性化好的重组质粒电转化至粘红酵母gm4。

1、将80μl己制备好的感受态细胞与20μl(约10μg)已线性化好的待转化质粒dna混合,加入到0.2cm已预冷的电转化杯中；

2、将装有混合液的电转化杯冰浴5min；

3、调整好电转仪的参数:电压1.5kv，电容25uf，电阻200ω，电击持续时间约为5ms左右；

4、电击结束后，立即向转化杯中加入1ml预冷的1m山梨醇溶液,用枪轻微吸打混匀,然后将其转至灭过菌的离心管中,30℃静置lh，然后加入1ml新鲜的ypd培养基，30℃，200rpm摇1小时；

5、室温下3000rpm，离心4min，用200μlddh2o重悬菌体；

6、将消液涂布于ypd平板(含50μlzeocin)，置于30℃培养箱中培养2-3d,直到长出单菌落为止。

2.2.3.4重组粘红酵母的pcr检测

1、挑取ypd抗性平板上长势较好的单菌落转接到ypd液体培养基中，30℃，250rpm振荡培养至od600大于2；

2、取1ml菌液12000rpm离心2min，弃上清，加入100μlte缓冲液重悬菌体，水浴煮沸5-10min，立即置于-20℃冰箱冻存15min，室温下静置使菌悬液溶解，12000rpm离心5min，取上清液5μl为模板进行pcr检测。

反应体系如下：

pcr反应条件

2.2.3.5质粒的酶切验证

经菌液pcr初步验证后，提取正确阳性克隆中的质粒，用ncoi和bamhii分别对重组质粒进行双酶切鉴定，反应温度为37℃。

酶切反应体系如下：

2.2.3.6转化子稳定性检测

将粘红酵母转化子接种于40mlypd液体培养基中，30℃，250rpm振荡培养24h-36h。取1ml菌液用无菌水分别稀释到10^-2,10^-3,10^-4，各取200μl不同稀释度的稀释液分别涂布于普通ypd平板和ypd-zeocin抗性平板，计算菌落数，分别记为总菌数和带有整合质粒的菌落数。以1％接种量转接至ypd液体培养基，30℃，250rpm振荡培养，以24h为10世代，共培养50个世代。每隔10世代进行一次平板计数。

以下式计算质粒稳定性：

稳定性(％)＝带有整合质粒的菌落数÷总菌数×100％

2.2.4转化子d6d表达水平测定

用实时荧光定量pcr来检测d6d在转化菌株中的表达水平。野生菌株gm4和转化菌株gm4-d6d分别在ypd培养基中发酵24h、48h、72h后收集，提取野生菌株和转化菌株的总rna，方法参照前面2.2.1.3；然后经过反转录得到cdna，方法参照2.2.1.3。将合成后的cdna稀释30倍，用于实时荧光定量pcr。

d6d的实时荧光定量pcr引物为：

f:5′-atgtcagggcaaactcgag-3′

r:5′-atcatctaaaacatcttttgagag-3′

以上述稀释好的cdna为模版，按照荧光定量试剂盒sybrprimescripttmrt-pcrkit指导进行。

荧光定量pcr扩增的反应体系为：

pcr扩增条件为：

同时对real-timepcr产物进行sybr熔解曲线分析，每个试样平行做4次反应，重复试验2次，并参考pfaffl(2001)的方法进行数据分析。

2.2.5转化菌株gm4-d6d的脂肪酸组成分析

1、菌株gm4-d6d总脂肪酸的提取

(1)收集在ypd液体培养基培养至稳定期的gm4-d6d菌株，离心后用蒸馏水清洗两遍，5000g于4℃离心5min收集菌体后烘干至恒重，重量后放于研钵中研磨成粉末，用滤纸包好菌粉再次烘干至恒重；

(2)将滤纸包裹的菌粉放于抽提筒中，注入无水乙醚浸没样品，在70度左右的恒温水浴中回流抽提8h左右，乙醚中无油为抽提结束，除去溶剂后的油脂待用；

(3)向提取的油脂加入1ml2％(wt/vol)硫酸-甲醇，60℃酯化2h；

(4)冷却后加入1ml己烷，涡旋10min萃取脂肪酸甲酯；

(5)取上述萃取了脂肪酸甲酯的己烷800μl加入到玻璃瓶中进行gc分析。

2、gc分析

用bruker450-gc仪器配氢火焰离子化(fid)检测器和毛细管色谱柱hp-innowax(30m×0.25mm)。柱温升温程序为：150℃(1min)，10min升至230℃，并在230℃保持2min，分流比为10:1，对照脂肪酸甲酯标准品的保留时间，对不同脂肪酸进行定性定量分析。

结果证明

2.3.1粘红酵母的菌落形态

粘红酵母gm4在孟加拉平板上生长3天后，其形态如图2所示。菌落平均直径在3～5mm，颜色为红色或橘红色，光泽，表面光滑且边缘整齐，呈圆形凸起。

2.3.1pcr扩增检测目的片段

通过设计特定引物对摸底基因pgk1和d6d进行pcr扩增，通过琼脂糖凝胶电泳分析，图3中(a)显示在800bp左右扩增出目的条带，图3中(b)显示在13000bp左右扩增出目的条带。

将重组质粒经过电转化法导入粘红酵母感受态细胞，对粘红酵母的细胞裂解液进行pcr检测，以目的基因d6d的特异性引物进行pcr扩增，通过琼脂糖凝胶电泳分析，图5显示1、2、3通道(重组菌株)在13000bp左右扩增出目的条带，阴性对照(空载体菌株，即野生粘红酵母菌株gm4，没有重组质粒转化)则无条带。说明重组质粒pgk1z-rd-d6d成功转入粘红酵母并插入到粘红酵母基因组中。

重组菌gm4-d6d经过培养后，提取质粒，经过ecori和hindiii双酶切后电泳成像，结果如图4，可看到在2100bp和3100bp左右有条带(通道1)，酶切后的片段大小与所插入的目的基因片段大小相符，说明重组质粒上的目的基因片段的插入方向正确。

2.3.2重组质粒稳定性检测

为了检测重组质粒ppgk1z-rd-d6d的遗传稳定性，我们对转化菌株在非选择压力下摇瓶培养60世代，沾取菌液于zeocine抗性平板上涂布、培养，计算菌落数。结果如表2-1所示，显示转化的粘红酵母菌株在连续培养60世代后，稳定性仍然可以达到99.31％，表明在非选择压力下，粘红酵母中的质粒具有良好的遗传稳定性。

表2-1重组质粒的稳定性检测

2.3.3转化粘红酵母菌株d6d的表达分析

实时荧光定量pcr分析d6d基因转录水平的结果见图6，转化菌株的d6d表达水平为野生菌株的2倍左右，野生菌株d6d转录水平在培养72小时后降到较低水平，而转化菌株在其生长和γ-亚麻酸表达阶段，其d6d的转录水平一直都高于野生菌株。d6d的高转录水平可以可以为γ-亚麻酸的和合成提供所需的足够的酶，从而使γ-亚麻酸的合成量维持在较高的水平。

2.3.4γ-亚麻酸的积累研究

为了过表达d6d基因的粘红酵母转化菌株是否会产生较高水平的gla，实验过程中对其脂肪酸成分进行了测定及分析，发现转化菌株的gla含量显著增高，由原来的3.12％提高到10.36％，同时gla合成的底物亚油酸的含量明显降低，由此可以看出，与野生菌株相比，转化菌株可以积累更多的gla。

表2-2转化菌株和野生菌株的脂肪酸组成

本发明中，δ6-脂肪酸去饱和酶是合成长链多不饱和脂肪酸的限速酶，分别在n-3途径中催化ala脱氢生成sda和n-6途径中的油酸(la)脱氢生成gla。在γ-亚麻酸的生物合成过程中，△6-脂肪酸去饱和酶将la的第六位碳原子脱氢转化成gla。经过研究者们不断努力，已经有不少gla代谢关键酶的编码基因被克隆并且实现功能验证，有的基因还被利用到脂肪酸代谢途径修饰中，并取得理想效果。如laoteng等成功分离mucorrouxii中的δ6-脂肪酸去饱和酶，发现其于植物的δ6-脂肪酸去饱和酶有高度的相似性，并使其在酿酒酵母中成功得以表达；helu等人发现在豆豉的发酵过程中会有大量的gla产生，因此分离出高产gla的根霉菌，并从中克隆得到δ6-脱饱和酶基因，将其表达于酿酒酵母中可导致gla的积累；王萍等人将刺孢小克银汉霉菌中的δ6-脂肪酸去饱和酶表达于橘林油脂酵母中，使其gla的含量占总脂肪酸的1.2％。而本实验中，经过脂肪酸分析，发现转化菌株中的la明显低于野生菌株，这也可以从侧面反应出la经d6d催化进一步合成了gla，从而使转化菌株中la的含量降低，gla的含量增多。

粘红酵母是一株高产油脂的稳定菌株，常备用来生产微生物油脂和不饱和脂肪酸、类胡萝卜素等。本实验室前期筛选到一株产脂能力较强的粘红酵母，其脂含量可以高达22.54％。在本实验中，我们利用了本实验室前期的粘红酵母表达质粒构建工作，成功构建整合表达载体ppgk1z-rd-d6d，该载体上含有粘红酵母的两个rdna片段以及酿酒酵母的强启动子pgk1，以rdna为整合位点实现目的基因的稳定高拷贝表达，从而将外源刺孢小克银汉霉菌的d6d基因整合到粘红酵母的染色体上，使其能够稳定、高效表达，结果显示传代60代后，质粒仍能稳定存在于转化株内，并且粘红酵母转化菌株的d6d表达水平明显高于野生菌株，其gla的产量也明显提高。

总的来说，本发明成功构建了外源基因d6d表达载体ppgk1z-rd-d6d，经双酶切鉴定，重组质粒上的目的片段插入方向正确；将重组质粒导入粘红酵母中，经转化菌株pcr鉴定，重组质粒成功导入粘红酵母中并插入到粘红酵母的基因组中，实现了d6d的稳定、长久表达；实时荧光定量pcr表明d6d的表达水平提高了2倍左右；经气相色谱法分析，转化菌株中的gla较野生菌株提高了3.3倍多。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。