一种构建耐盐酵母菌株的新方法与流程

本发明属于微生物学、分子生物学及食品发酵交叉领域，涉及基因工程技术领域，尤其涉及转录因子spt15重组质粒yeplac195-p-t-spt15的构建及其应用，尤其是一种构建耐盐酵母菌株的新方法。

背景技术：

目前国内外针对spt15重组质粒yeplac195-p-t-spt15的构建及其应用，最主要的发现是其能通过大肠杆菌进行表达，而对于spt15重组质粒yeplac195-p-t-spt15能否在t酵母中进行表达，还尚未发现。

酱油是中国传统的调味品，其发酵工艺包括低盐固态和高盐稀态两种。而酱油的高盐稀态发酵工艺的主要是需要加入耐盐酵母(简称t酵母)来增强酱油的风味品质等。高盐稀态发酵盐水浓度要在16％以上，这就要求添加的酵母具有较高的耐盐性，因此筛选耐高盐的酵母菌株成为添加酱油风味的重要手段之一。

t酵母作为酱油发酵的主要菌株之一，有一个复杂的耐盐系统，使得它在高盐环境中保持正常的生理活动和新陈代谢的发酵。在过去二十年中，很多研究已经开始调查其对高盐的适应机制，主要集中在它的等离子膜、atp酶和na⁺/h⁺转运蛋白。盐对酵母新陈代谢的影响开始被研究，例如在酱油生产过程中酯类挥发物的变化，细胞生长和在高盐环境中糖的消耗。

通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献(以下简称对比文件1)：

耐盐耐酸酵母提取物及其制备方法和应用(cn104982875a)，由活性酵母依次加入酵母抽提酶、中性蛋白酶、复合酶、核酸酶与风味酶，调节ph至4-10，同时升温至30-90℃，酶解反应一段时间，然后升温灭酶，再离心分离得到上清液即为酵母水解液，再进行美拉德反应制得的。包括如下步骤：(1)酵母水解液制备以活性酵母为原料，向其中加水进行搅拌均匀，然后依次加入酵母抽提酶、中性蛋白酶、复合酶、核酸酶与风味酶,调节ph至4-10，同时升温至40-90℃，酶解反应一段时间，然后升温灭酶，再离心分离得到上清液即为酵母水解液；(2)热反应将步骤得到的酵母水解液与还原性单糖进行美拉德反应,即得耐盐耐酸酵母提取物。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献的耐盐酵母菌株构建方法存在本质的不同。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种构建耐盐酵母菌株的新方法，该方法扩大了对于转录因子spt15突变库的研究范围，成功地将含有spt15的yeplac195-p-t-spt15重组体质粒在t酵母尿嘧啶缺陷型菌株wm2中表达出来，得到一种构建耐盐酵母菌株的新方法，将该方法所构建出的新的耐盐t酵母菌株用于酱油发酵中，待发酵成熟后测定氨基酸态氮的含量，发现在发酵酱油的过程中能产生更多的氨基酸态氮，验证其在酱油酿造中具有明显优势。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种构建耐盐酵母菌株的新方法，步骤如下：

⑴以野生型t酵母为出发菌株，得到具有遗传稳定性的尿嘧啶缺陷型菌株wm2；

⑵构建spt15基因突变库；

⑶构建spt15重组质粒yeplac195-p-t-spt15库；

⑷将构建好的重组质粒yeplac195-p-t-spt15库导入到w303中，选取优势菌株提取质粒；

⑸将提取出的质粒导入到wm2中，即构建出新的耐盐t酵母菌株。

而且，具体步骤如下：

⑴以野生型t酵母为出发菌株，得到具有遗传稳定性的尿嘧啶缺陷型菌株wm2；

⑵同时，以酿酒酵母为模板，构建转录因子spt15基因突变库；

⑶将启动子基因连接到质粒yeplac195中，即得到质粒yeplac195-p；

⑷将终止子基因连接到步骤⑶中构建的质粒yeplac195-p中，即得到质粒yeplac195-p-t；

⑸将步骤⑵中构建的spt15基因突变库连接到步骤⑷中质粒yeplac195-p-t中，即得到质粒yeplac195-p-t-spt15库；

⑹将步骤⑸中构建的质粒yeplac195-p-t-spt15库导入到w303中，选取优势菌株提取质粒；

⑺从步骤⑹获得的菌株中提取质粒，将该质粒导入到步骤⑴中构建的wm2中，即构建出新的耐盐t酵母菌株。

而且，具体步骤如下：

⑴以野生型t酵母为出发菌株，利用最佳的紫外诱变条件对其进行诱变处理，最佳的紫外诱变条件为：在诱变剂甲基磺酸乙酯质量百分数为1％的条件下，取od660＝1时期的t酵母，在紫外照射距离为25±1cm，对其进行诱变55min；

然后，在含盐的尿嘧啶缺陷型平板和ypd平板上对经过紫外线照射处理后的t酵母进行涂布对照筛菌，将在尿嘧啶缺陷型平板上不能生长、在ypd平板上生长的菌株进行传代处理，得到具有遗传稳定性的尿嘧啶缺陷型耐盐菌株wm2；

其中，所述含盐的尿嘧啶缺陷型平板为：

不添加尿嘧啶的完全极限培养基，调节ph至7.5，115℃灭菌20min制得的平板；

⑵运用易错pcr技术，在反应体系中，设置退火温度为42-58℃，mg²⁺终浓度在1mm以上，对转录因子spt15进行大量扩增，收集得到含有spt15的大量易错pcr产物，用乙醇醋酸钠法纯化后，得到spt15基因突变库，-20℃存储备用；

所用易错pcr反应体系为：

⑶构建spt15重组质粒yeplac195-p-t-spt15库；

具体步骤如下：

①使用sphi和hindⅲ双酶消化步骤⑵中所收集的纯化后的200bppcr产物以及质粒载体yeplac195，使用kpni和saci双酶消化步骤⑵中所收集的纯化后的400bppcr产物以及质粒载体yeplac195-p，使用psti和sali双酶消化步骤⑵中所收集的纯化后的720bppcr产物以及yeplac195-p-t，37℃酶切1-2h；

其中，所述200bppcr产物即为启动子，其所使用的上引物为：5'-gcgagctctcggaatagctttaatggtg-3'；下引物为：5'-gcggtaccaccgatgggaaatgactctt-3'；所述400bppcr产物即为终止子，其所使用的上引物为：5'-gcgcatgcggaaggaattgaaccatata-3'；下引物为：5'-gcaagcttgtttaaggaatccatcttta-3'；所述720bppcr产物即为spt15基因片段；

②在80℃将限制性内切酶进行失活处理5min，将dna聚合酶连接反应体系放在22℃的培养箱或室温下恒温反应4h或过夜，通过连接得到重组质粒库yeplac195-p-t-spt15；

⑷将构建好的重组质粒yeplac195-p-t-spt15库导入到w303菌株中，并进行培养，在长出的菌落中随机挑取数个菌株，从中筛选耐高盐的优势菌株，对耐盐性好的菌株提取质粒；

⑸将提取出的质粒导入到步骤⑴中得到的尿嘧啶缺陷型菌株wm2中，通过培养做dilution验证，从中筛选耐盐性最高的菌株，即构建出新的耐盐酵母菌株。

而且，：所述步骤⑸中使用电转化方法将提取出的质粒导入到步骤⑴中得到的尿嘧啶缺陷型菌株wm2中。

而且，所述电转化方法的电转化条件为：dna质量为0.1μg，li⁺浓度60mm，电压为1400v。

而且，所述步骤⑷的具体步骤如下：

将构建好的重组质粒yeplac195-p-t-spt15库导入到w303菌株中，涂布在尿嘧啶营养缺陷型平板上，30℃倒置培养3-5天，待长出白色菌落后，随机挑取长势良好的菌落划线转接到含质量百分数2％盐nacl的尿嘧啶营养缺陷型平板上，放于30℃培养箱中倒置培养3-5天，待长出菌落后，继续挑取长势旺盛的菌落划线转接到含质量百分数4％盐nacl的尿嘧啶营养缺陷型平板上，经培养继续划线转接到质量百分数6％盐nacl的尿嘧啶营养缺陷型平板上，在含质量百分数6％盐nacl的尿嘧啶营养缺陷型平板上随机挑取长势旺盛的单菌落，培养后提取质粒。

而且，所述步骤⑸中dilution验证的具体步骤如下：

取培养过夜的菌液测od值，根据od值取菌数量相同的菌液量进行离心，离心条件为3000rpm，离心3min，之后用无菌水进行梯度稀释，稀释五个浓度梯度：1╳10⁷、1╳10⁶、1╳10⁵、1╳10⁴、1╳10³，稀释之后取1μl在平板中相同梯度的菌液一一对应进行点接，上述5个浓度均有菌生长即为耐盐菌株。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明方法扩大了对于转录因子spt15突变库的研究范围，成功地将含有spt15的yeplac195-p-t-spt15重组体质粒在t酵母尿嘧啶缺陷型菌株wm2中表达出来，得到一种构建耐盐酵母菌株的新方法，将该方法所构建出的新的耐盐t酵母菌株用于酱油发酵中，待发酵成熟后测定氨基酸态氮的含量，发现在发酵酱油的过程中能产生更多的氨基酸态氮，验证其在酱油酿造中具有明显优势。

2、本发明方法首次将质粒yeplac195-p-t-spt15在t酵母的尿嘧啶缺陷型菌株wm2中成功表达。

3、本发明方法将酿酒酵母的转录因子spt15通过突变后在wm2中表达，成功提高了wm2菌株的耐盐性。

4、本发明方法最终构建的新耐盐t酵母菌株在酱油发酵中，可以明显提高酱油的重要理化指标氨基酸态氮的含量。

附图说明

图1为本发明中dna质量对t1菌株电转化效率的影响图；

图2为本发明中li⁺浓度对t1菌株电转化效率的影响图；

图3为本发明中电压对t1菌株电转化效率的影响图；

图4为本发明中重组质粒yeplac195-p-t-spt15构建过程图；

图5为本发明中氨基酸态氮的测量结果图；

图6为本发明中提取yeplac195-p-t-spt15质粒pcr产物电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种构建耐盐酵母菌株的新方法，步骤如下：

⑴以野生型t酵母为出发菌株，得到具有遗传稳定性的尿嘧啶缺陷型菌株wm2；

⑵构建spt15基因突变库；

⑶构建spt15重组质粒yeplac195-p-t-spt15库；

⑷将构建好的重组质粒yeplac195-p-t-spt15库导入到w303中，选取优势菌株提取质粒；

⑸将提取出的质粒导入到wm2中，即构建出新的耐盐t酵母菌株。

具体地，步骤如下：

⑴以野生型t酵母为出发菌株，得到具有遗传稳定性的尿嘧啶缺陷型菌株wm2；

⑵同时，以酿酒酵母为模板，构建转录因子spt15基因突变库；

⑶将启动子基因连接到质粒yeplac195中，即得到质粒yeplac195-p；

⑷将终止子基因连接到(3)中构建的质粒yeplac195-p中，即得到质粒yeplac195-p-t；

⑸将(2)中构建的spt15基因突变库连接到(4)中，即得到质粒yeplac195-p-t-spt15库；

(6)将(5)中构建的质粒yeplac195-p-t-spt15库导入到w303中，选取优势菌株提取质粒；

(7)从(6)获得的菌株中提取质粒，将该质粒导入到(1)中构建的wm2中，即构建出新的耐盐t酵母菌株。

更具体地，步骤如下：

⑴构建t酵母尿嘧啶营养缺陷型菌种wm2

以野生型t酵母为出发菌株，利用最佳的紫外诱变条件对其进行诱变处理，最佳的紫外诱变条件为：在诱变剂甲基磺酸乙酯(ems)质量浓度为1％的条件下，取od660＝1时期的t酵母，在紫外照射距离为25±1cm，对其进行诱变55min；

然后，在尿嘧啶缺陷型培养基平板(即为不添加尿嘧啶的完全极限培养基，调节ph至7.5，115℃灭菌20min制得的平板)和ypd平板上对经过紫外线照射处理后的t酵母进行涂布对照筛菌，将在尿嘧啶缺陷型平板上不能生长、在ypd平板上生长的菌株进行传代处理，得到具有遗传稳定性的尿嘧啶缺陷型耐盐菌株wm2；

⑵利用易错pcr构建spt15基因突变库

运用易错pcr技术对转录因子spt15进行大量扩增，得到spt15基因突变库；

易错pcr技术是在正常pcr技术的基础上演变而来的，基于易错pcr技术可运用于基因的随机诱变。本发明正是通过改变pcr反应体系的条件和低保真的taqdna聚合酶，降低pcr过程中dna复制的保真度，以增加dna子链的碱基错配率，得到较多点突变的扩增产物。本发明中运用易错pcr技术对转录因子spt15进行大量扩增，得到spt15基因突变库。

本实验采用单因素试验，分别在温度、mg²⁺浓度、datp、dttp、dctp、dgtp的强度及浓度方面对pcr反应进行优化，找出最优点(即退火温度为42-58℃，mg²⁺终浓度在1mm以上，datp、dttp、dctp、dgtp添加量的质量比例为4:1:1:4)，从而发现：

①pcr反应在退火温度为42-58℃温度范围内pcr产物浓度较高，在其他温度范围内则容易得到错配率较高的易错pcr产物，为随机突变提供了有利的条件。

②提高体系中mg²⁺的量时可以得到错配率高的易错pcr产物。

③改变pcr体系中datp和dgtp的添加量较容易得到易错pcr产物，对基因的诱变率较高；改变dttp和dctp的量不容易得到易错pcr产物，所得基因的诱变率不高。

随后在pcr热循环仪中按表1所示反应体系进行pcr扩增，设置退火温度为42-58℃，mg²⁺终浓度在1mm以上，收集得到含有spt15的大量易错pcr产物，用乙醇醋酸钠法纯化后放-20℃存储备用；

表1本发明所用易错pcr反应体系表

⑶构建spt15重组质粒yeplac195-p-t-spt15库；

经双酶切、dna聚合酶连接等操作构建spt15重组质粒库，具体步骤如下：

①使用sphi和hindⅲ双酶消化步骤⑵中所收集的纯化后的200bp(启动子)pcr产物(上引物：5'-gcgagctctcggaatagctttaatggtg-3'；下引物：5'-gcggtaccaccgatgggaaatgactctt-3')以及质粒载体yeplac195，使用kpni和saci双酶消化步骤⑵中所收集的纯化后的400bp(终止子)pcr产物(上引物：5'-gcgcatgcggaaggaattgaaccatata-3'；下引物：5'-gcaagcttgtttaaggaatccatcttta-3')以及质粒载体yeplac195-p，使用psti和sali双酶消化步骤⑵中所收集的纯化后的720bp(spt15基因片段)pcr产物以及yeplac195-p-t，37℃酶切1-2h；

②在80℃将限制性内切酶进行失活处理5min，将dna聚合酶连接反应体系，放在22℃的培养箱或室温下恒温反应4h或过夜，通过连接得到重组质粒库yeplac195-p-t-spt15。构建步骤如图4所示。

⑷将构建好的重组质粒yeplac195-p-t-spt15库导入到w303菌株中，并进行培养，在长出的菌落中随机挑取数个菌株，从中筛选耐高盐的优势菌株，对耐盐性好的菌株提取质粒；

更具体地，步骤如下：

将构建好的重组质粒yeplac195-p-t-spt15库导入到w303菌株中，涂布在尿嘧啶营养缺陷型平板上，30℃倒置培养3-5天，待长出白色菌落后，随机挑取长势良好的菌落划线转接到含质量百分数2％盐nacl的尿嘧啶营养缺陷型平板上，放于30℃培养箱中倒置培养3-5天，待长出菌落后，继续挑取长势旺盛的菌落划线转接到含质量百分数4％盐nacl的尿嘧啶营养缺陷型平板上，经培养继续划线转接到质量百分数6％盐nacl的尿嘧啶营养缺陷型平板上；

在含6％盐nacl的尿嘧啶营养缺陷型平板上随机挑取长势旺盛的4个单菌落，分别命名为303-1，303-2，303-3，303-4。培养后提取质粒，分别命名为a1，a2，a3，a4。

⑸将提取出的质粒导入到步骤⑴中得到的尿嘧啶缺陷型菌株wm2中，即构建出新的耐盐酵母菌株；

将空白质粒yep195、a1、a2、a3、a4质粒分别导入wm2菌株，得到菌株a0、a1、a2、a3、a4。将这5株菌进行酱油发酵，测定其重要理化指标氨基酸态氮含量，结果如图5所示。由图5中可知a1，a2，a3，a4菌株比a0菌株在发酵酱油的过程中能产生更多的氨基酸态氮。

同时，通过培养在不同盐浓度的尿嘧啶缺陷型平板上做dilution验证(取培养过夜的菌液测od值，根据od值取菌数量相同的菌液量进行离心3000rpm，3min，之后用无菌水进行梯度稀释，稀释五个浓度梯度(1╳10⁷、1╳10⁶、1╳10⁵、1╳10⁴、1╳10³)，稀释之后取1μl在平板中相同梯度的菌液一一对应进行点接，上述5个浓度均有菌生长即为耐盐菌株，经dilution实验可以看出四个质粒在耐盐方面有一定的优势。

将得到的a1，a2，a3，a4质粒进行pcr反应，看是否有目的条带，并将所得的pcr产物进行测序。所得pcr产物的电泳条带见图6。经基因测序分析，得到的a1，a2，a3，a4此四个基因是所需要的目的基因。

较佳地，所述步骤⑸中使用电转化方法将提取出的质粒导入到步骤⑴中得到的尿嘧啶缺陷型菌株wm2中。

电转化法是酵母转化的比较通用的方法，真菌转化方法中，常用的ca²⁺转化法、冷冻贮藏法、peg法、传统醋酸锂转化法对于真菌种类的覆盖率均不如电转化方法。因此，本发明选择电转化法对t酵母进行转化，同时对电转化方法进行优化，确定了最佳电转化方法。

①dna质量对t1菌株电转化效率的影响

pzeu质粒浓度及纯度：od260/od280＝1.70，od260＝0.28，dna浓度＝14μg/ml。

1μgdna需要加入71.4μldna溶液(0.1μg＝7.1μl,0.3μg＝21.4μl,0.5μg＝35.7μl,0.7μg＝50.0μl,0.9μg＝64.3μl)。

采用已有标准方法的条件，dna质量＝0.1μg时转化子78个，转化率＝780transformants/μgpdna。0.1μgdna即饱和，对于t酵母来说，高浓度的dna反而使转化效率显著降低，最高转化效率的产生仍然来源于少量dna，如图1所示。

②li⁺浓度对t1菌株电转化效率的影响

li⁺浓度对t1转化效率的影响较为明显，最优转化浓度仍然是60mm，对应转化率为492个/μgpdna，含有147个转化子，如图2所示。

③电压对t1菌株电转化效率的影响

电压对t1酵母电转化率的影响为线性增长，1500v以前转化率线性提升，最高效电压＜1500v，转化率为491transformants/μgpdna(此电压在0.1cm电转槽较容易产生电火花，0.2cm电转槽转入成功率比较高。)，如图3所示。

以上可得：t酵母最适电转化条件为：dna质量为0.1μg，li⁺浓度60mm，电压约1400v的时候。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其它形式的限制，任何技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例；但是凡是未脱离本发明的技术方案内容，对上述实施例做任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

sequencelisting

<110>天津科技大学

<120>一种构建耐盐酵母菌株的新方法

<130>2017-3-7

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>28

<212>dna

<213>spt15上引物

<400>1

gcgtcgacatggctgacgagggacgttt28

<210>2

<211>28

<212>dna

<213>spt15下引物

<400>2

gcctgcagctacattttcctgaattcac28

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>200bppcr产物上引物

<400>3

gcgagctctcggaatagctttaatggtg28

<210>4

<211>28

<212>dna

<213>200bppcr产物下引物

<400>4

gcggtaccaccgatgggaaatgactctt28

<210>5

<211>28

<212>dna

<213>400bppcr产物上引物

<400>5

gcgcatgcggaaggaattgaaccatata28

<210>6

<211>28

<212>dna

<213>400bppcr产物下引物

<400>6

gcaagcttgtttaaggaatccatcttta28