重组纤维素糖化酶混合物和重组酵母复合菌株及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及：与野生型蛋白质相比在酵母中分泌能力增加的蛋白质表达用表达 盒、包含该表达盒的表达载体、将上述表达载体导入到宿主细胞中而形成的转化子及包含 两种以上的上述转化子的复合菌株，其中，上述表达盒包含对翻译融合配偶体 (Translational fusion partner，TFP)进行编码的多核苷酸和对选自 TrXynl I、TrBxl、 TrEGL2、PaCELl、PaCel2、TeCBHl、NfCBHl、HgCBHl、CtCBHl、ClCBH2和CfCexl的蛋白质进行编 码的多核苷酸。并且，本发明涉及一种包括用于培养上述转化子的步骤的半纤维素酶、内切 葡聚糖酶或外切葡聚糖酶的生产方法及生物乙醇的生产方法。进一步，本发明涉及一种包 含β-葡萄糖苷酶、通过上述方法生产出的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的重组纤维素酶混 合物及利用上述混合物对生物质进行糖化的方法。此外，本发明涉及一种通过使用单一的 用于制备上述纤维素酶的菌株或复合使用两种以上的用于生产上述纤维素酶的菌株并将 糖化及发酵这两个工程简化为单一步骤，来以廉价的费用从纤维素生物质中生产出生物能 源或有用生化物质的方法。
【背景技术】
[0002] 全世界上，因原油枯竭及地球暖化问题而正在进行着从廉价且可再生的生物质中 容易地获取生物能源的努力。纤维素生物质为地球上最为丰富的有机物，其为能够生产以 现有石油为基础生产出的各种能源和原料平台化合物的可再生原料(Hoffert等，2002， 3以611(^，298,981)。目前，利用这种纤维素生物质来获取生物能源(特别是生物乙醇）的过 程在技术方面上是可行的，但属于高价工程，具有与目前的原油价格相比缺乏经济性的问 题（Zaldivar等，2001，Appl.Microbiol.Biotechnol·，56,17)〇
[0003] 为了从纤维素生物质中获取生物乙醇，对生物质进行分解并将分解后的糖 (sugar)进行发酵来获取生物乙醇，但由于存在于自然界中的微生物无法同时高效进行生 物质的分解和发酵，因此现有技术将生物质的分解及发酵分成两个步骤来进行，从而是无 效率的（Lynd等2002，Microbiol.Mol. Biol.Rev. 66,506)。特别是，纤维素生物质为非常坚 固的结构，其自然分解过程非常缓慢，因此为了人工加快分解速度而必须进行高费用的前 处理过程和高价的纤维素分解酶处理过程（Lynd等，1999，Biotechnol. Prog . 15，777， Himmel等，2007,Science,315,804)〇
[0004] 因此，为了确保利用纤维素生物质的生物能源及平台化合物生产的经济性，需要 能够将纤维素生物质有效分解的纤维素分解酶(纤维素酶)的低价生产技术，特别是要求开 发出能够将这种酶生产重组菌株直接应用到生物能源生产技术中的联合生物加工 (Consolidated bioprocessing)技术（Hahn-Hagerdal等，2006，Trends Biotechnol .,24, 549,Lynd等，2008,Nat.Biotechnol·，26,169)〇
[0005] 纤维素生物质通过与作为葡萄糖聚合物的纤维素、作为木糖聚合物的半纤维素、 以及木质素（lignin)结合而具有非常坚固且稳定的结构。为了利用酶来使其有效分解，首 先，需要通过物理化学前处理来瓦解植物体的稳定结构，并使酶能够接近基质，并根据基质 种类需要各种纤维素分解酶。为了分解作为葡萄糖聚合物的纤维素，内切l，4-i3-D-葡聚糖 酶(end〇-l，4-0-D_glucanase)、外切 1，4-β-?-葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(ex〇-l，4-0_D-区111〇&11&86或〇611〇13；[0117(11'01&86)和0-葡萄糖苷酶（0-8111(308丨(1&86或0611013丨&86，0-葡萄 糖苷酶或纤维二糖酶）是必不可少的（Kubicek 等，1992，Adv .Biochem. Eng. Bio techno 1,45， 1)。此外，为了分解作为木糖聚合物的半纤维素，代表性地需要内切1，4-β-木聚糖酶(-(10-1，4-0-17131^86)和0-木糖苷酶(0-171081(^86)，并且为了完全分解，需要多种脱支((16-branching)酶。在使植物体自然腐蚀的微生物(特别是霉菌）中发现这些酶，关于商业上生 产出的纤维素分解酶复合体，由诺维信(Novozymes)公司和丹尼斯克(Danisco)公司销售源 于霉菌里氏木霉(Trichoderma reesei)的酶复合体。
[0006] 目前在全世界上，由上述两个跨国企业垄断生产并销售生物能源生产用生物质分 解酶，但由于其价格相当高且并不是根据生物质被最佳化的状态，因此具有根据情况需要 使用过剩的酶的问题（Merino and Cherry，2007，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol · 108,95， Kabel等，2006,Bioeng.Biotechnol.93,56)〇
[0007] 因此，如果利用细菌或酵母(yeast)等重组宿主系统来重组生产各个酶并将生产 出的各个重组酶进行组合而按生物质种类进行最佳化，则具有能减少酶的使用量的优点。 作为用于生产这种重组酶的宿主细胞，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的乙醇发酵 能力优异，普遍用作乙醇生产菌株，并且进行用于对该菌株导入纤维素分解能力的尝试和 用于生产重组纤维素分解酶的诸多研究（1^11(1等，2002，]^(^〇1^〇1.]\1〇1.8丨〇1.1^￥.，66， 506)，但由于纤维素分解酶的分泌生产率低于霉菌，因此作为重组酶大量生产的目的，应用 可能性较低。
[0008] 如此，虽然现有的酵母的生物乙醇发酵能力非常优异，但全然没有纤维素生物质 的分解能力，从而在将非粮型资源的纤维素生物质作为原料来生产生物能源时，具有不可 避免地使用高价纤维素分解酶的问题，并且为了解决该问题，进行了无数次的导入了外来 纤维素分解酶基因的重组菌株开发，但因酶的分泌生产率较低而具有生产出的酶无法有效 分解培养基内的纤维素基质的问题。由此，利用生产出的糖(sugar)来进行生物乙醇的生产 是受限制的。
[0009] 近年来，虽然具有在酿酒酵母中表达从几种霉菌中发掘到的纤维素糖化酶基因并 利用微晶纤维素(Avicel)来确认生物乙醇的生成的报告，但仍然存在分泌酶的量不够充分 且乙醇生成效率较低，需要供给外部酶的问题(M. Ilmen等,2011，Biotechnol Biofuels.4: 30,2011)〇
【发明内容】
[0010] 技术问题
[0011] 对此，本发明人为了利用酵母来大量分泌生产纤维素分解酶，利用本发明人所持 有的技术即作为酵母蛋白质定制型高分泌生产技术的TFP技术(韩国专利第10-0626753号、 第10-0798894号、第10-0975596号）来开发出能够高分泌生产各种酶的技术。即，从多个霉 菌基因中发掘出能够在酵母中进行大量分泌的纤维素分解酶蛋白质，并利用最佳的TFP进 行生产，确保了纤维素分解中所必须的酶群。作为上述纤维素分解中所必须的酶群，确保作 为半纤维素酶（hemicellulase)的TrXynII(Trichoderma reesei xylanase II，里氏木霉 木聚糖酶Π )、TrBxl(Trichoderma reesei beta-xylosidase，里氏木霉β-木糖苷酶），作为 外切葡聚糖酶(exoglucanase)的PaCel 1 (Polyporus acularius Cell，漏斗棱孔菌Cell)、 PaCel2(Polyporus acularius Cel2)、TeCBHl(Talaromyces emersonii CBH1，埃默森篮状 菌CBH1)、NfCBHl (Neosartorya fischeri CBH1，费氏新萨托菌CBH1)、HgCBHl (Humicola 区1^86&03!11，灰腐质霉03!11)、(]1:03!11(〇1&61:〇111；[111111:1161'111(^11；[11111103!11，嗜热毛壳菌 CBHl)、ClCBH2(Chrysosporium lucknowense CBH2,丝状真菌 CBH2)和 CfCexl (Cellulomonas f imi，奠碱纤维单胞菌），作为内切葡聚糖酶(endo-glucanase)的TrEGL2 (Trichoderma reesei EGL2,里氏木霉EGL2)，以及作为β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)的 改良后的5€1361^2(3&(^11&1'01115^0口813；1^13111186抑1361^2，扣囊复膜酵母1361^2)(韩国专利公 开第10-2013-0027984号），可通过人工混合各蛋白质而制造作为纤维素生物质糖化酶混合 物的KCC(KRIBB Cellulase cocktail，KRIBB纤维素酶混合物）系列，提高纤维素生物质的 糖化效率，并且可通过制造出最佳的定制型糖化酶，降低纤维素的糖化费用。此外，以如下 方式完成了本发明：通过复合使用用于分泌生产纤维素分解酶的各个重组酵母而使其应用 到生物质同步糖化生物乙醇的生产工程中，由此同时进行纤维素生物质糖化及发酵，能够 降低纤维素生物乙醇生产工程费用。
[0012] 用于解决问题的手段
[0013] 本发明的目的在于提供一种表达载体，其用于在酵母中大量生产半纤维素酶 TrXynII、TrBxl和内切葡聚糖酶TrEGL2、0-葡萄糖苷酶SfBGL2、外切葡聚糖酶PaCell、 PaCel2、TeCBHl、NfCBHl、HgCBHl、CtCBHl、CfCexl及C1CBH2。
[0014] 本发明的又一目的在于提供一种由上述表达载体转化成的转化子。
[0015] 本发明的又一目的在于提供一种重组纤维素酶的生产方法，其包括以下步骤:培 养上述转化子，并从该培养物或培养上清液中回收半纤维素酶TrXynll、TrBxl、内切葡聚糖 酶 TrEGL2、外切葡聚糖酶 PaCel 1、PaCel2、TeCBHl、NfCBHl、HgCBHl、CtCBHl、ClCBH2、CfCexl 和β-葡萄糖苷酶SfBGL2。
[0016] 本发明的又一目的在于提供一种利用具有木聚糖(xylan)分解能力的所生产的半 纤维素酶来复合培养生产菌株的方法。
[0017] 本发明的又一目的在于将所生产的纤维素酶按适当的比率混合来提供生物质定 制型纤维素酶混合物。
[0018] 本发明的又一目的在于提供一种利用将上述转化子混合后的复合菌株的同步糖 化（SSF，simulatneous saccharification and fermentation)或耳关合生物加工（CBP， consolidated bioprocessing)生物乙醇发酵工程。
[0019] 发明的效果
[0020] 如果使用本发明所提供的纤维素酶表达载体，则能够在酿酒酵母中大量生产纤维 素酶，并且上述菌株可适用于同步糖化或联合生物加工中，从而能够广泛应用于木质纤维 生物质到生物乙醇制造等的产业工程中。
【附图说明】
[0021] 图1表示用于导入漏斗棱孔菌、埃默森篮状菌、费氏新萨托菌、灰腐质霉、嗜热毛壳 菌、丝状真菌和源于粪碱纤维单胞菌的外切纤维素酶基因、和源于里氏木霉的半纤维素酶、 内切葡聚糖酶基因的酵母TFP载体的聚合酶连锁反应(PCR)及细胞内重组过程的示意图。 [0022]图2是表示利用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)对在酵母Y2805 菌株中导入TrXynII(A)、TrBxl(B)(图2&)、1'池61^2(〇、卩&〇611(0)(图213)、？&〇612^)、 TeCBHl (F)(图2c)、NfCBHl (G)、HgCBHl (H)(图2d)、CtCBHl (I)、C1CBH2( J)或CfCexl (K)(图 2e)而形成的24个转化子的培养上清液进行分析的结果的电泳照片。
[0023]图3是表示为了去除在所选的转化子中表达的TrXyηII(A)、TrBx 1 (B)、TrEGL2(C)、 C1CBH2(J)或CfCexl(K)(图3c)蛋白质的糖链，在对作为糖链去除酶的内切糖苷酶H(End〇-H)进行处理之后，利用SDS-PAGE进行分析的结果的电泳照片。
[0024]图4是表不利用MF或自身信号（861卜818仙1)来表达在所选的转化子中所表达的 TrXynll (A)和TrBxl (B)的情况和为了比较相对蛋白质表达量和活性而进行SDS-PAGE分析 和活性分析的结果。
[0025] 图5是表不在含有駿甲基纤维素 （carboxymethyl cellulose，CMC)的YP(2%yeast extract+2%peptone，2%酵母抽提物+2%蛋白胨）培养基中利用刚果红（congo-red)对 TrEGL2表达转化子进行染色，并以环的大小比较内切葡聚糖酶活性的结果。
[0026] 图 6 是表示为 了将最终选择的各个51'13-?3〇611、51'19-1'迚