一株人工合成ii号染色体的酿酒酵母菌株的制作方法
【专利摘要】本发明提供了人工合成的酿酒酵母菌株及其用途。更具体而言，本发明提供了一株人工合成II号染色体的酿酒酵母菌株，该酿酒酵母菌株于2014年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2014434。所述酿酒酵母菌株可用于代谢产物的优化生产；通过诱导SCRaMbLE产生突变体库，用于筛选具有各种特性的菌株；作为筛选工具，对加入的代谢通路进行高通量筛选。CCTCC NO: M 201443420140919
【专利说明】
一株人工合成11号染色体的酿酒酵母菌株
技术领域
[0001] 本发明涉及生物工程领域，更具体而言，本发明涉及人工染色体及其用途。
【背景技术】
[0002] 合成生命作为合成生物学的一个重要研究方向，近年来一直是科学家研究和讨论 的热点。2002年，美国纽约州立大学溪石分校的EckardWimmer研究小组人工合成了脊髓灰 质炎病毒全基因组（约7. 5kb)，开创了人工合成生命的先河[1]。2003年和2005年，(pX 174丨 噬菌体和西班牙流感病毒基因组又分别被人工合成[2, 3]。2008年，J. Craig Venter研究 所的Daniel G. Gibson等人完成了生殖道支原体（Mycoplasma genitalium)基因组在酵 母体内的人工合成，合成长度达到了 580kb[4]。2010年，Daniel G. Gibson等人又完成了 1.08mb的丝状支原体（Mycoplasma mycoides)基因组的人工合成，并成功将合成的基因组 移植入了受体细胞并发挥功能[5]。
[0003] 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)是一种子囊菌门的单细胞真菌，是与人类 关系最为广泛的微生物之一。酿酒酵母作为真核模式生物，具有重要的科研和应用价值。酿 酒酵母基因组包括16条染色体，总长度约为12Mb，1996年全基因组测序完成，是第一个完 成全基因组测序的真核生物。2011年，美国科学家Jef D. Boeke提出了人工合成酿酒酵母 全基因组的Sc2. 0计划，即以酿酒酵母野生型基因组序列为蓝本，通过人工设计，采用化学 合成的方法，从头合成全部酿酒酵母染色体序列。他们设计并合成了 IX号染色体右臂和VI 号染色体左臂，用于方法测试[6]。2014年，Jef D. Boeke实验室顺利完成了酿酒酵母III 号染色体的人工合成[7]。
[0004] 酿酒酵母是第一个人工合成基因组的真核生物。酿酒酵母基因组的人工合成不仅 在科学上具有重要意义，而且在生产应用上也将起到重要的作用。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一株人工合成II号染色体的酿酒酵母菌株，命名为SynYII，该酿酒 酵母菌株于2014年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC，中国，武汉，武汉大 学中国典型培养物保藏中心，430072)，保藏号为CCTCC N0:M 2014434,分类命名为酿酒酵 母 SynYII(SaccharomycescerevisiaeSynYII)〇
[0006] 在一个实施方案中，本发明描述了酿酒酵母染色体的人工合成及测试方法。
[0007] 在一个实施方案中，所述酿酒酵母菌株通过导入诱导SCRaMbLE质粒，例如 pSCWll-CRE/EBD，发生诱导变异。
[0008] 在一个实施方案中，所述酿酒酵母菌株诱导发生SCRaMbLE。
[0009] 在一个实施方案中，本发明的人工合成II号染色体的酿酒酵母菌株可以用作制 备具有不同特性的菌株。例如，通过l 〇xP位点，该菌株可以自身进行重组，也可以与外来基 因进行重组。可以根据需要设计重组，进而得到多种具有不同特性的菌株，如具有更精简基 因组的菌株，压力耐受菌株，代谢产物高产菌株等（具体见菌株优势的描述）。本发明的人 工合成II号染色体的酿酒酵母菌株用作制备具有不同特性的菌株的用途以及这些具有不 同特性的菌株均在本发明的范围内。
[0010] 本发明的人工合成II号染色体的酿酒酵母菌株可用于酒精等代谢产物的优化生 产；可通过诱导SCRaMbLE产生突变体库，用于筛选具有各种特性的菌株；可作为筛选工具， 对加入的代谢通路进行高通量筛选。
[0011] 本发明的人工合成的酿酒酵母具有如下优势：
[0012] 首先，人工合成的酿酒酵母染色体序列是经过人工设计和精简的，合成菌株用于 生产将比野生型菌株更易于操作和控制，具有更大的应用潜力。
[0013] 其次，人工合成的酿酒酵母菌株引入了可诱导的SCRaMbLE (synthetic chromosome rearrangement and modification by loxP-mediated evolution，loxP 介导 的合成染色体重排）系统（loxP位点间的DNA序列在Cre重组酶的作用下会发生插入、删 除、颠倒、重复、易位等变异；人工合成的酵母染色体上插入了多个loxP位点，诱导表达Cre 重组酶以后，就会引发整条合成染色体序列的重排，产生大量突变体，这个诱导变异系统就 称为SCRaMbLE系统），是人工合成酿酒酵母菌株的重要特征之一。通过诱导合成菌株发生 SCRaMbLE，通过控制筛选条件，可以得到多种具有不同特性的菌株，如具有更精简基因组的 菌株，压力耐受菌株（耐高温、高糖、高乙醇浓度菌株等），代谢产物高产菌株等，在生产上 具有巨大的应用价值。
[0014] 再次，人工合成的酿酒酵母菌株删除了终止密码子TAG，后续可引入一种新的氨基 酸，尤其是人工合成的氨基酸，在酵母的品质改良和代谢产物优化等方面都具有重要应用 价值。
【附图说明】
[0015] 图1酿酒酵母II号染色体设计示意图。
[0016] 图2A和2B酿酒酵母人工合成II号染色体设计图。
[0017] 图3染色体合成示意图。
[0018] 图4 chunkF质粒、酶切结果和同源接头。
[0019] 图5 chunkF替换PCR筛选结果。
[0020] 图6 chunkF替换PCR鉴定结果。
[0021] 图7 SynYII菌株PCR鉴定结果。
[0022] 图8合成菌株在不同培养基中的生长曲线。
[0023] 图9合成菌株在不同培养条件中的表型。
[0024] 图10 SCRaMbLE菌株的生长曲线。
[0025] 图11本发明设计的所用的minichunk序列。
【具体实施方式】
[0026] 本发明提供了一株人工合成II号染色体的酿酒酵母菌株，命名为SynYII。合 成起始菌株为酿酒酵母菌株 BY4741(MATa his3A lleu2A〇LYS2metl5A〇ura3A〇 ;ATCC 201388)。菌株合成的具体实验步骤如下。
[0027] 1染色体设计
[0028] 1. 1染色体序列设计
[0029] Sc2. 0项目人工合成酿酒酵母染色体设计原则包括：①无害，即人工合成的酵母 菌株至少在表型上与野生型没有明显差异；②稳定：即人工合成的染色体可以在细胞内稳 定存在；③可变：即人工合成的染色体增加了遗传的可操作性。在以上的原则下，通过计算 机软件，对野生型酿酒酵母基因组进行了如下操作：移除反转录转座子、亚端粒结构以及没 有功能的内含子；移除tRNA基因，统一放到同一条染色体上；插入LoxP位点；将终止密码 子TAG替换为TAA ;以及一些密码子同义突变等（见参考文献[6])。
[0030] 本发明的II号染色体的设计遵循Sc2. 0项目规定的设计原则，具体设计包括：移 除了端粒及亚端粒，替换为人工设计的精简端粒；移除了 22个内含子，31个反转录转座子， 13 个 tRNA 基因；插入了 367 个 loxP 位点（SEQ ID NO. 1 :ATAACTTCGTATAATGTACATTATACG AAGTTAT);将90个TAG终止密码子替换为TAA ;以及通过同义突变设计了 532组鉴定引物 (合成和野生鉴定引物各532对）。设计示意图见图1。II号染色体设计图见图2。
[0031] 1.2染色体切分设计
[0032] 人工设计的酿酒酵母II号染色体总长度约为770kb，切分为25个30kb左右的片 段，每个片段称为一个megachunk，分别命名为megachunkA-megachunkY ;每个megachunk又 切分为3-5个10kb左右的片段，称为chunk，chunk之间设计同源接头（800-1200bp)用于 合成染色体的替换；每个chunk再切分为2-7个2kb左右的片段，称为minichunk。本发明 所用的minichunk的序列见图11。
[0033] 2人工合成染色体方法
[0034] 人工合成酵母染色体的步骤为：首先合成2kb左右的双链DNA片段并测序验证，保 证0嫩序列与设计序列100%相同；然后将2吐左右的0嫩片段拼接成10吐左右的0嫩片 段（见图3A);再将3-5个10kb左右的DNA片段连同同源接头一起使用醋酸锂法转化酿酒 酵母，通过同源重组的方式整合至野生型酵母体内（见图3B)。每一个megachunk末端带有 一个营养缺陷型筛选标记，并覆盖掉上一个megachunk的筛选标记，逐段替换，两个筛选标 记轮流筛选，直至替换掉所有野生型染色体全部DNA序列（见图3C)。每个megachunk替换 完成后，使用多对设计好的合成和野生型鉴定引物进行PCR鉴定，当所有合成引物均有目 标条带而野生引物均无条带时（即只有合成染色体序列，没有野生染色体序列），即认为合 成正确。
[0035] 实施例
[0036] 实施例中所提及的实验操作，如无特殊说明，均为常规实验方法；所提及的试剂耗 材，如无特殊说明，均为常规试剂耗材。
[0037] 实施例一：染色体合成
[0038] 1DNA片段合成
[0039] 1. 12kb片段合成
[0040] 2kb DNA片段由北京六合华大基因科技有限公司、英潍捷基（上海）贸易有限公 司、金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0041] 1.210kb 片段合成
[0042] 使用Gibson组装的方法将2kb DNA片段拼接成10kb DNA片段，具体合成方法参 见专利申请：Gibson组装载体及其制备方法和应用（201310085313. 7)。
[0043] 2合成染色体替换
[0044] 以megachunkF为例说明合成染色体替换流程。megachunkF长度约为31kb，分为 4个chunk，分别为chunkFl，chunkF2, chunkF3, chunkF4 ;筛选标记为Ura，合成和野生鉴定 引物各23对。
[0045] 2.1DNA 制备
[0046] 使用试剂盒（质粒小提试剂盒，天根）提取10kb DNA片段质粒，使用 Nanodrop (Nanodrop 2000，Thermo)测定DNA浓度，电泳检测（见图4A)。用设计的相应的 限制性内切酶（NEB)从质粒上切下10kb片段，电泳检测（见图4B，箭头所指为目标片段条 带）。酶切体系分别为：chunkFl(SfiI 1.5yL，NEBuffer4 2yL，BSA 0.2yL，DNA 4yg，补 水至 20 y L) ;chunkF2 (Sfil 0? 75 y L，Eco0109I 0? 75 y L，NEBuffer4 2 y L，BSA 0? 2 y L， DNA 4yg，补水至 20yL) ;chunkF3(Eco0109I 0.75yL，RsrII 0.75yL，NEBuffer4 2yL， BSA 0.2yL，DNA 4yg，补水至 20yL) ; chunkF4 (RsrII 0. 5 y L, Bael 1 y L, NEBuffer4 2yL，BSA 0.2yL，l/10SAM 0.25yL，DNA 4yg，补水至 20yL)。chunkFl-chunkF3 分别 37°C 酶切 3h，chunkF4 25°C 酶切 5h。
[0047] 使用试剂盒（AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒，康宁）切胶纯化酶切产物目标条带， Nanodrop测定DNA浓度。4个10kb片段取等摩尔量的DNA用DNA连接酶（T4 DNA连接酶， TAKARA)连接。连接体系为：T4 DNA连接酶0. 5 y L，10 X T4 DNA连接酶缓冲液1 y L，4个 10kb片段各50ng，加水补足10yL。16°C连接过夜。
[0048] 2. 2同源接头制备
[0049] 将10kb DNA片段连接产物加水稀释10倍，用作接头PCR模版。PCR体系为： Phusion DNA 聚合酶（Phusion DNA Polymerase，NEB)0.2yL，5XHF 缓冲液 4yL，dNTPs 1.6yL，MgCl20. 6yL，模版DNA lyL，正向引物Pf lyL，反向引物Pr lyL，无菌水 10.6^匕？0?程序为：98￡€3〇86(：;98。(：1〇86(3,55 1€3〇86(3,72。(：1111111，35个循环；721€ 5min;12°C保持。电泳检测PCR产物（见图4C)。使用试剂盒（AxyPrep PCR清洁试剂盒， 康宁）纯化PCR产物，Nanodrop测定DNA浓度。
[0050] 2. 3酵母转化筛选
[0051] 转化细胞制备：挑chunkE合成成功的酿酒酵母菌株单克隆，接种至3mL YF>D液体 培养基中，30°C 200rpm摇培过夜。取lmL菌液接至40mLYro液体培养基中，30°C 200rpm 摇培至0D600 = 0. 6-1. 0, 3000rpm离心5min收集菌体，分别用40mL无菌水和20mL 0. lmol/ L醋酸锂洗涤沉淀各一次，用lmL 0. lmol/L醋酸锂重悬沉淀。
[0052] 酵母转化：取上述菌液100 y L，分别按顺序加入10kb DNA片段各300ng，同源接头 各 200ng，变性 ssDNA (Deoxyribonucleic acid from herring sperm，Sigma) 25 y L，lmol/ L 醋酸锂 41 y L，50% PEG3350 312 y L，涡旋混匀，30°C 静置 30min ;加 50 y L DMS0,涡旋混 勾，42°C静置 15min ;3000rpm 离心 1. 5min，弃上清，加 lmL 5mm CaCl2,混勾，3000rpm 离心 lmin，弃上清，加100 y L 5mm 0&(：12重悬沉淀，取适量转化液涂SC-Ura培养基平板，30°C培 养3d。
[0053] 转化子筛选：将以上转化平板分别影印至SC-Leu和SC-Ura培养基平板，30°C培 养Id ;挑Ura+Leu (即在SC-Ura培养基上生长，在SC-Leu培养基上不生长）克隆，涂布在 SC-Ura平板lcm2范围内，30°C培养Id ;将涂布平板再分别影印至SC-Leu和SC-Ura培养基 平板，30°C培养Id。
[0054] 2. 4PCR筛选鉴定
[0055] PCR模版制备：在上一步影印的SC-Ura培养基平板上挑选Ura+Leu克隆，刮适量 菌体至500 yL水中，祸旋混勾，12000rpm离心lmin，弃上清；加裂解液100 yL重悬浮菌体， 加酸洗玻璃珠（〇. 5mm) 0. 2g，PCI 200 y L，涡旋仪调至最大转速振荡3min ;补加100 y L水， 混匀，12000rpm离心10min，取150 y L上层液体做为PCR模版。
[0056] PCR筛选：从4个chunk中分别各取1组鉴定引物（合成和野生鉴定引物各1 对）对转化子进行PCR筛选。PCR体系为：rTaq (TAKARA) 0. 1 y L，10 XPCR缓冲液1. 25 y L， dNTPs lyL，模版 lyL，正反向混合引物 lyL，ddH20 8.15 yL。PCR 程序为：94°C 5min; 94°C 30sec，55°C30sec，72°C 30sec，30 个循环；72°C 5min;12°C保持。电泳检测：PCR 产 物加 1. 5 y L 10 X 上样缓冲液，混匀，取 3 y L 点样；点 3 y L DL2000DNA Marker (TAKARA)， 2%琼脂糖凝胶，电泳电压120V，电泳时间40min，EB染色lOmin，凝胶成像仪照相（见图5 ; 依次相邻的2个泳道为1组引物，分别为合成和野生引物；同时满足合成引物有目标条带、 野生引物无条带则认为合成正确；框中所示为PCR筛选正确克隆）。
[0057] PCR鉴定：从上步中挑选PCR筛选正确的克隆（取#2和#5号克隆），取chunkF所 有23组引物进行PCR鉴定。PCR体系、程序、电泳检测方法均同上（鉴定结果见图6 ;2个 菌株各23组引物鉴定结果均为合成引物有目标条带，野生引物无条带，所以均为合成正确 克隆）。
[0058] 人工合成II号染色体酿酒酵母菌株SynYII全部引物PCR鉴定结果见图7。
[0059] 人工合成II号染色体酿酒酵母菌株SynYII于2014年9月19日保藏于中国典 型培养物保藏中心（CCTCC，湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中 心），保藏号为 CCTCC NO:M 2014434。
[0060] 实施例二：合成菌株培养测试
[0061] 1生长曲线测定
[0062] 分别在YH)培养基和SC培养基中测定野生型菌株BY4741和合成菌株SynYII的 生长曲线，比较合成菌株SynYII与野生型菌株BY4741的区别。
[0063] 1. 1菌液制备
[0064] 酿酒酵母野生型菌株BY4741和合成菌株SynYII分别挑取单克隆，接种至3mL YPD 或SC液体培养基中，30 °C 200rpm摇培过夜。
[0065] 1.2生长曲线测定
[0066] 使用可见光分光光度计测定菌液的0D600值，在蜂窝板孔中加入300 yL YH)或SC 液体培养基，分别接种YPD或SC液体培养基摇培的BY4741和SynYII菌株菌液至0D600 = 0. 1，每个菌株3个重复。使用Biosceen C MBR型生长曲线分析仪测定野生和合成酵母菌 株在YH)或SC液体培养基中的生长曲线。生长曲线分析仪参数为：30°C，中等转速，中等振 荡强度，检测波长600nm，30分钟检测一次。生长曲线见图8 (图8A为BY4741和SynYII在 YH)培养基中的生长曲线，图8B为BY4741和SynYII在SC培养基中的生长曲线）。
[0067] 从生长曲线测定结果可以看出，人工合成酵母菌株SynYII在YH)和SC培养基中 的生长情况与野生型菌株BY4741均无明显差异，符合设计要求。
[0068] 2表型实验
[0069] 酿酒酵母野生型菌株BY4741和合成菌株SynYII分别在YPD固体培养基（pH7)， SC固体培养基，不同pH值（pH 4. 0或pH 9. 0)的YH)固体培养基，YH)加药品（甲基磺酸 甲酯（MMS)，苯菌灵（Benomyl)，不同浓度山梨醇（Sorbitol))固体培养基，SC加药品6-氮 尿嘧啶（6-AU)固体培养基和YPEG固体培养基上点板，比较合成菌株与野生型菌株的表型 差异。
[0070] 2. 1菌液制备
[0071] 酿酒酵母野生型菌株BY4741和合成菌株SynYII分别挑取单克隆，接种至3mL YPD 培养基中，30°C 200rpm摇培过夜。
[0072] 2. 2 点板
[0073] 取500 y L菌液，12000rpm离心收集菌体，用500 y L ddH20重悬菌体，再用ddH20依 次10倍稀释菌液浓度至1〇°，10 \ 10 2, 10 3, 10 4,分别取5 y L菌液在YPD培养基平板上点 板；取7 y L菌液在SC培养基上点板。
[0074] 2. 3培养条件
[0075] YPD 或 SC 培养基：各分别 25°C、30°C、37°C培养 2d ;pH4. 0, pH9. 0 培养基：各 30°C 培养2d ;甲基磺酸甲酯培养基：30°C培养2d ;苯菌灵培养基：30°C培养2d ;山梨醇培养基： 30°C培养3d ;6_氮尿嘧啶培养基：30°C培养2d ;YPEG固体培养基：30°C培养4d。表型实验 结果见图9。
[0076] 从表型测试结果可以看出，人工合成酵母菌株SynYII在多种培养基上和不同培 养条件下的生长情况与野生型菌株BY4741均无明显差异，符合设计要求。
[0077] 实施例三：诱导SCRaMbLE测试
[0078] 1诱导载体导入
[0079] 使用醋酸锂法（见实施例一）将诱导SCRaMbLE质粒pSCWl 1-CRE/EBD (由美国约 翰霍普金斯大学Jef D. Boeke教授提供）导入合成酵母菌株SynYII中，涂SC-His培养基 平板筛选转化子。
[0080] 2 诱导 SCRaMbLE
[0081] 在SC-His培养基平板上挑单克隆（命名为SynYII+HIS)，接种至3mL SC-His液 体培养基中，30°C 200rpm摇培过夜，12000rpm离心收集菌体；用3mL SC-His液体培养基重 新悬浮菌体，加雌二醇（0-Estradiol)至终浓度为lymol/L，37°C 200rpm诱导SCRaMbLE 24h，12000rpm离心收集菌体；用无菌水重新悬浮菌体，梯度稀释后分别涂SC-His培养基平 板，30 °C培养3d挑选单克隆。
[0082] 3SCRaMbLE 菌株测试
[0083] 从SC-His培养基平板上挑6个单克隆（分别命名为Scb-1~6)，分别各接种至 3mL SC-His液体培养基中，30°C 200rpm摇培过夜，在37°C条件下测生长曲线（生长曲线测 定方法见实施例二）。SCRaMbLE菌株在37°C的生长曲线测定结果见图10。
[0084] 从生长曲线测定结果可以看出，人工合成的酿酒酵母菌株诱导发生SCRaMbLE以 后，得到的突变体的生长情况出现了丰富的多样性；经过筛选，可以得到一些耐高温的目标 菌株，如倍增时间更短的菌株Scb-1、稳定期0D值更高的菌株Scb-2等。如此进行多轮诱导 和筛选，即可得到高温耐受能力更强的菌株。
[0085] 附录：
[0086] 裂解液：NaCl 0? lmol/L，Tris-HCl (pH 8. 0) 10mmol/L，EDTA(pH 8. 0) lmmol/L， Triton x-100 2%，SDS 1%。
[0087] PCI :Tris-饱和酚 250mL，三氯甲烷 240mL，异戊醇 10mL。
[0088] ￥^)培养基：酵母粉1(^/1，蛋白胨2(^/1，葡萄糖2(^/1;固体培养基加2%琼脂 粉。
[0089] SC培养基：_5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基础氮源（不含氨基酸、硫酸铵）1. 7g/ L，硫酸铵 5g/L，葡萄糖 20g/L，100XUral0mL/L，50XLeu20mL/L，100XMetl0mL/L， 100父1^81〇111171，333\出8 3111171;固体培养基加3%琼脂粉。
[0090] SC-Ura培养基：_5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基础氮源（不含氨基酸、硫酸 铵）1. 7g/L，硫酸铵 5g/L，葡萄糖 20g/L，50XLeu20mL/L，100XMetl0mL/L，lOOXLyslOmL/ L，333XHis 3mL/L，琼脂粉 3%。
[0091] SC-Leu培养基：_5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基础氮源（不含氨基酸、硫酸 铵）1. 7g/L，硫酸铵 5g/L，葡萄糖 20g/L，100XUral0mL/L，100XMetl0mL/L，lOOXLyslOmL/ L，333XHis3mL/L，琼脂粉 3%。
[0092] -5氨基酸混合粉末：腺嘌呤1. 5g，丙氨酸6g，精氨酸6g，天冬氨酸6g，天冬酰胺 6g，半胱氨酸6g，谷氨酸6g，谷氨酰胺6g，甘氨酸6g，异亮氨酸6g，苯丙氨酸6g，脯氨酸6g， 丝氨酸6g，苏氨酸6g，色氨酸6g，酪氨酸6g，缬氨酸6g。
[0093] lOOXUra :尿嘧啶 2. 24g/L。
[0094] 50XLeu :亮氨酸 13g/L。
[0095] 100 XMet :甲硫氨酸 7. 5g/L。
[0096] 100 X Lys :赖氨酸 18. 3g/L。
[0097] 333XHis :组氨酸 21g/L。
[0098] pH4. 0、pH9. 0培养基：YPD固体培养基分别加HC1和NaOH调pH值至4. 0或9. 0。
[0099] 甲基磺酸甲酯（MMS)培养基：YPD固体培养基加甲基磺酸甲酯0. 05%。
[0100] 苯菌灵培养基：YPD固体培养基加苯菌灵15 y g/mL。
[0101] 山梨醇培养基：YPD固体培养基加山梨醇分别0.5mol/L，1.0mol/L，1.5mol/L， 2.Omol/L〇
[0102] 6-氮尿嘧啶培养基：SC固体培养基加6-氮尿嘧啶100 y g/mL。
[0103] YPEG培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，甘油2%，乙醇2%，琼脂粉2%。
[0104] 参考文献：
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【主权项】
1. 一株人工合成II号染色体的酿酒酵母菌株，该酿酒酵母菌株于2014年9月19日保 藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2014434。2. 权利要求1的酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株通过导入诱导SCRaMbLE质粒发生诱 导变异。3. 权利要求2的酿酒酵母菌株，所述诱导SCRaMbLE质粒是pSCWll-CRE/EBD。4. 权利要求1-3任一项的酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株诱导发生SCRaMbLE。5. 权利要求1-4任一项的酿酒酵母菌株用作以下的用途：通过诱导SCRaMbLE产生突 变体库，用于筛选具有不同特性的菌株。6. 权利要求5的用途，其中用作制备具有不同特性的菌株为：所述酿酒酵母菌株通过 ΙοχΡ位点自身进行重组，或者与外来基因进行重组。7. 权利要求6的用途，所述ΙοχΡ位点的序列是SEQ ID NO. 1。8. 权利要求5-7任一项的用途获得的具有不同特性的菌株。9. 权利要求8的菌株，所述菌株为具有更精简基因组的菌株，压力耐受菌株或代谢产 物高产菌株。10. 权利要求1-4任一项的酿酒酵母菌株的以下用途：用于代谢产物的优化生产；作为 筛选工具，对加入的代谢通路进行高通量筛选。
【文档编号】C12N1/19GK105820965SQ201510008356
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月8日
【发明人】陈泰, 高峰, 王云, 沈玥, 赵宏翠, 田埂, 徐讯
【申请人】深圳华大基因研究院