本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株防治蓝莓等果蔬采后病害的浅黄隐球酵母HMQAUSZ01的分离筛选、发酵以及生防效果测定，属于农业生物技术领域。
背景技术：
我国是果蔬生产大国，果蔬往往因运输和贮藏过程的不当而造成大量腐烂，导致经济效益降低、产品竞争力下降和浪费等现象，这也是全球关注的问题。发达国家很早就将采后保鲜加工放在农业的首要位置，据报道，美国果蔬损失率为1.7%~5.0%，而我国则在25~30%，可见，我国果蔬采后的保鲜技术具有很大的经济潜力。
蓝莓属于杜鹃花科Ericaceae，越桔属Vaccinium，是一种具有极高经济价值的新兴世界性小浆果果树（李亚东 2002），因其突出的营养保健价值被联合国粮农组织列为人类五大健康食品之一（Kader & Rovel 1996）。目前，蓝莓种植产业已经成为国内果树种植业最热门的产业之一，蓝莓市场潜力也逐渐被开发出来，至2015年底，全国蓝莓种植面积由最初的24公顷发展到31210公顷, 产量由2002年的2吨发展到43244吨。
蓝莓属于浆果类果实，含水量很高，采后的蓝莓果实极易衰老，发生失水、腐烂等现象，极不耐贮藏，如不及时处理将会造成严重的经济损失。这一特性极大地限制了其鲜果货架期和商品价值。目前在青岛地区引起蓝莓贮藏期病害的病原有5种，其中灰葡萄孢和链格孢为主要病原菌（梁晨等 2010）。
随着蓝莓栽培面积的不断扩大和产量的迅速增加，生产上迫切需要适合于蓝莓果实的采后贮藏保鲜配套技术，以缓解市场的供求矛盾和加工压力，减少采后损失，延长供应期，从而提高蓝莓果实的经济价值并促进蓝莓产业的健康快速发展（姜爱丽 2011）。传统的杀菌剂和保鲜方法不仅不能很好地解决腐烂变质问题，而且带来许多安全隐患。考虑到蓝莓的营养价值及医用价值，决定了蓝莓病害的防治应该尽量避免使用化学药剂，采取有机栽培的方式，发展有机蓝莓种植业必须坚决杜绝化学药剂的使用，因此对于蓝莓采后病害的防治应着眼于发展生物防治手段。
酵母菌作为果蔬生物防治拮抗菌的最大优点是它能在较干燥的果蔬表面生存，能迅速利用营养进行繁殖，且受杀虫剂的影响小（Wisniewski and Wilosn, 1992）且酵母菌不产生抗菌素，可以避免病菌对抗菌素产生抗性而降低生物防治的抑病效果（WiIson and Winsiweksi, 1994），另一方面也可以避免某些抗生素对人体的不利影响。因此寻找新的酵母资源是研发蓝莓等果蔬采后病害生防制剂的关键因素。
技术实现要素：
本发明第一个目的在于提供从山东省青岛市城阳区的柿树果实表面分离得到一株对果蔬采后病害具有显著防治作用的生防酵母-浅黄隐球酵母（Cryptococcus flavescens）菌株HMQAUSZ01，丰富蓝莓等果蔬采后病害生防真菌菌种资源，为研究开发生防菌剂奠定基础。
本发明第二个目的在于提供一种利用上述菌株HMQAUSZ01生产的微生物菌剂。
本发明第三个目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。
本发明第四个目的在于提供上述微生物菌剂对蓝莓等果蔬采后病害的生测方法。
本发明第五个目的在于提供上述菌株HMQAUSZ01在蓝莓等果蔬采后病害上的应用。
本发明第六个目的在于提供上述菌株HMQAUSZ01的鉴定方法。
实现本发明的技术方案如下所述。
浅黄隐球酵母（Cryptococcus flavescens）HMQAUSZ01菌株于2016年1月7日保藏于中国科学院微生物所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No. 11984。
利用上述浅黄隐球酵母HMQAUSZ01菌株生产的微生物菌剂，活性成分为菌体或发酵原液。
上述微生物菌剂的制备步骤如下：
（1）菌种活化：将低温保藏的菌株HMQAUSZ01于10%的豆芽汁培养基平板上25℃培养48h，得到活化的菌种；（2）发酵培养：将活化的菌株HMQAUSZ01接入含有50mL NYDB培养液的150 mL三角瓶中，使发酵液中酵母的初浓度为2*104cfu/mL，于140r/min，25℃摇培48h后的发酵液为菌剂A；将菌液A在3000rpm下离心10min，弃上清液，收集菌体，并用无菌水洗涤菌体两次，并用其制成细胞悬浮液，得到菌剂B；用血球计数板计数，调整菌剂A和菌剂B中的酵母菌所需浓度，4℃保存待用。
上述微生物菌剂中的A和B活菌体数应大于1x109cfu/mL。
豆芽汁培养基：10%豆芽汁200mL，琼脂20g，葡萄糖50g，水800mL，自然pH。
NYDB培养液：牛肉膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，水1000mL。
本发明的有益效果：
1. 本发明的浅黄隐球酵母HMQAUSZ01菌株对蓝莓等果蔬采后病害有很好的防治效果，具有高效，抗菌谱广的优点；
2. 本发明所提供的浅黄隐球酵母HMQAUSZ01菌株防治效果稳定，对环境友好，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。
根据本发明提供的浅黄隐球酵母HMQAUSZ01菌株和发酵原液菌剂可作为单剂或组合制剂利用或施用，这样的制剂可包括农业上合适的助剂、溶剂、载体、表面活性剂或填充剂。
具体实施方式：
下面实施例用于进一步解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，一般为常规方法。
实施例1 HMQAUSZ01菌株的分离筛选
菌株HMQAU SZ01是从山东省青岛市城阳区的柿树果实表面分离得到。2015年11月从山东省青岛市城阳区市场购买无病虫危害、无伤口的冬枣、葡萄、香蕉、梨、苹果、桃和番茄、柿子若干。分别称取10g果皮组织，加入到装有90mL豆芽汁葡萄糖液体培养基的锥形瓶中，同时加入3000单位的链霉素， 25℃下以120r/min振荡培养48h；用移液枪吸取lmL菌液，用浓度梯度法稀释成10-1～10-7的浓度，将10-5、10-6、10-7浓度的菌液分别取0.lmL涂布于倒有豆芽汁葡萄糖琼脂培养基的平板上。每稀释度重复3次, 置于25℃恒温培养箱中培养48h，挑取培养特征相异的单菌落进行平皿划线纯化。酵母分离试验获得40株酵母菌，以蓝莓采后病原菌链格孢为靶标菌，通过离体果实筛选试验进行拮抗菌株的筛选，最终获得一株对果实采后病原真菌具有明显防治效果的菌株HMQAU SZ01，防效为100%。
实施例2菌株 HMQAUSZ01细胞悬浮液对果蔬果实自然腐烂的生防效果
将菌株HMQAUSZ01的菌剂B用无菌水制备成以下浓度的处理液；（1）1×106cfu/mL;（2）1×107cfu/mL;（3）1×108cfu/mL，将蓝莓、葡萄、樱桃、番茄的果实放入菌悬液中，浸泡3min后捞出，风干；将果实放置于塑料盒中，外套塑料保鲜膜以保持湿度（95%左右）。处理果实贮于25℃，定期记录果实的腐烂率。每处理10个果实，重复三次。试验结果表明三种浓度的HMQAUSZ01处理液对水果的自然腐烂均具有明显的抑制效果，浓度越高，水果采后自然发病率越低。其中浓度为1×108cfu/mL的处理液对四种果实自然腐烂率的各自防效均为最好，对番茄的生防效果为100%，其次对蓝莓和葡萄的防效分别为86.96%和86.11%，樱桃的生防效果最低，为61.54%。
实施例3 菌株 HMQAUSZ01细胞悬浮液对蓝莓采后病原菌链格孢和灰葡萄孢的生防效果
将菌株HMQAUSZ01的菌剂B用无菌水制备成以下浓度的处理液：（1）1×105cfu/mL；（2）1×106cfu/mL；（3）1×107cfu/mL；（4）1×108cfu/mL；（5）1×109cfu/mL；对照为无菌水。用无菌的牙签在每个健康蓝莓果实的果蒂部位制造伤口（3mm×3mm），在伤口处分别接种上述处理液15μL，3h晾干后，分别接种1×105 cfu/mL病原菌孢子悬浮液，果实晾干后，将果实放置于塑料盒中，外套塑料保鲜膜以保持湿度。处理果实贮于25℃下, 定期记录果实腐烂率。每处理10个果实，重复3次。试验结果表明随着处理液浓度的增大，果实的发病率降低，其中1×109cfu/mL和1×108cfu/mL两个浓度的处理液的发病率差异不显著，因此在防治时可采用1×108cfu/mL，这个处理浓度的对灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和链格孢（Alternaria alternara）的防效分别为87.50%和84.62%。
实施例4菌株 HMQAUSZ01细胞悬浮液对苹果采后病原菌扩展青霉、灰葡萄孢及粉红单端孢的生防效果
将菌株HMQAUSZ01的菌剂B用无菌水制备成以下浓度的处理液：（1）1×105cfu/mL；（2）1×106cfu/mL；（3）1×107cfu/mL；（4）1×108cfu/mL；（5）1×109cfu/mL；对照为无菌水。用无菌的牙签在每个健康苹果果实的赤道部位制造伤口（3mm×3mm），在伤口处分别接种上述处理液15μL，3h晾干后，分别接种1×105 cfu/mL病原菌孢子悬浮液，果实晾干后，将果实放置于塑料盒中，外套塑料保鲜膜以保持湿度。处理果实贮于25℃下, 定期测量病斑直径。每处理3个果实，重复3次。试验结果表明随着处理液浓度的增大，果实上病斑直径减小。对于三种采后病原菌扩展青霉、灰葡萄孢和粉红单端孢的最适浓度分别为1×108cfu/mL，1×107cfu/mL以及1×109cfu/mL，对应的病斑直径均为0，生防效果100%。
实施例5 菌株HMQAUSZ01发酵液的不同处理液对果实采后病害的生防效果
将活化的菌株HMQAUSZ01接入含有50mL NYDB培养液的150 mL三角瓶中，使发酵液中酵母的初浓度为2*104cfu/mL，于140r/min，25℃摇培48h后，制备成以下处理液；（1）酵母发酵原液：用血球计数板计数，并用滤液调整至浓度为1×108cfu/mL；（2）酵母菌悬液；发酵液在3000r/min下离心10min，弃上清液，用无菌水洗涤酵母菌体2次，并用其制成酵母菌悬液，血球计数板计数，用无菌水调整至浓度为1×108cfu/mL；（3）酵母发酵滤液：培养液在3000r/min下离心10min 后，取上清液，用细菌过滤器（滤膜0.22μm）过滤即得；（4）酵母发酵热杀死液：将酵母发酵原液在121℃下高压灭菌20min。对照为无菌水。用无菌的牙签在苹果的赤道部位制造伤口（3mm×3mm），在伤口处分别接种菌株HMQAUSZ01上述四种处理液20μL，3h晾干后，分别接种病原菌（链格孢和灰葡萄孢）的孢子悬浮液，浓度为1×105 cfu/mL，之后晾干，将果实放置于塑料盒中，外套塑料保鲜膜以保持湿度。处理果实贮于25℃下，7天后测量病斑直径。每处理3个果实，重复3次。试验结果表明，酵母发酵滤液和酵母发酵热杀死液与对照无差异，防效均为0，而酵母发酵原液和酵母菌悬液的防效为100%。
实施例6菌株 HMQAUSZ01细胞悬浮液对番茄采后病原菌链格孢和灰葡萄孢的抑制效果
将菌株HMQAUSZ01的菌剂B用无菌水制备成以下浓度的处理液：（1）1×105cfu/mL；（2）1×106cfu/mL；（3）1×107cfu/mL；（4）1×108cfu/mL；（5）1×109cfu/mL；对照为无菌水。用无菌的牙签在每个健康番茄果实的赤道部位制造伤口（3mm×3mm），在伤口处分别接种上述处理液15μL，3h晾干后，分别接种1×105 cfu/mL病原菌孢子悬浮液，果实晾干后，将果实放置于塑料盒中，外套塑料保鲜膜以保持湿度。处理果实贮于25℃下, 定期测量病斑直径。每处理3个果实，重复3次。试验结果表明随着处理液浓度的增大，果实的病斑直径减小，其中1×109cfu/mL和1×108cfu/mL两个浓度处理液的发病率均为零，差异不显著，因此在防治时可采用1×108cfu/mL。
实施例7菌株HMQAUSSZ01的鉴定
（1）形态学特征：10%的豆芽汁平板上12h光暗交替条件下，25度培养48h,菌落呈圆形，边缘整齐，浅黄色，表明光滑，粘稠易挑起，不透明，无褶皱。镜检细胞呈椭圆形。 在NYDB培养基中培养48h后，菌液浑浊，有沉淀；
（2）生理特征：本发明菌株能发酵葡萄糖、蔗糖、棉子糖、蜜二糖、半乳糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖、松三糖、甲基-α-D-葡萄糖苷、纤维二糖、水杨醇葡萄糖苷、左旋鼠李糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、乙醇、半乳糖醇、D-甘露醇、D-山梨糖醇、肌醇、琥珀酸盐、葡（萄）糖酸盐；
（3）分子鉴定：以菌株HMQAUSZ01基因组DNA为模板，利用引物NL1/ NL4对26S rDNA近5，端的D1/D2区域进行扩增。所述引物序列为NL1（5’-GCA TATCAATAAGCGGAGGAAAAG-’）和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGAC GG- 3’）；扩增反应体系：10×Buffer 2.5μL，5 mM dNTP 2μL，10μLM引物NL1和引物NL4各1μL，Taq酶(5 U/μL) 0.5μL，模板DNA 2μL，补水至25μL。反应条件： 94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min20s，36个循环。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，由生工生物工程（上海）有限公司进行纯化和双向测序，测序结果经Sequencher5.0 软件自动装配后导出重叠群（Contig）并在 NCBI（http://www.ncbi.nlm.gov）数据库中进行 BLAST 分析后提交给 GenBank。再从 GenBank 中 选 取 合 适 的 序 列， 经CLUSTALW 2.0 软件进行序列对比，并用MEGA 5.0 软件采用邻接法（neighbor – joining analysis，NJ）构建系统发育树，其中 Bootstrap检验的重复次数为 1,000次。结果表明，该菌株的大亚基序列与来自美国德克萨斯州的浅黄隐球酵母Cryptococcus flavescens大亚基序列（GenBank登录号为FJ743610)的同源性达到99%。系统发育分析结果表明，该菌株的大亚基序列与4株Cryptococcus flavescens菌株的大亚基序列位于系统发育树的同一分支。同源性比对数据和系统发育树位置进一步证明了菌株HMQAUSZ01为Cryptococcus flavescens。
综合以上形态特征和26SrDNA序列同源性比对分析结果可知HMQAUSZ01属于浅黄隐球酵母（Cryptococcus flavescens）。
核苷酸序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一株浅黄隐球酵母及其在防治蓝莓等果蔬采后病害的应用
<160> 1
<210> 1
<211> 641
<212> DNA
<213> 浅黄隐球酵母(Cryptococcus flavescens)HMQAUSZ01
<400> 1
GCATATCAAT AAGCGGAGGA AAAGAAACTA ACAAGGATTC CCCTAGTAAC GGCGAGTGAA 60
CCGGGAAGAG CTCAAATTTG AAATCTGGCG TGCTCAGTGC GTCCGAGTTG TAATCTATAG120
AGTCGTTTTC CGTGCCGGAC TGTGTCCAAG TCCCTTGGAA CAGGGTATCA AAGAGGGTGA180
TAATCCCGTA CTTGACACAA TGACCGGTGC TCTGTGATAC GTCTTCTACG AGTCGAGTTG240
TTTGGGAATG CAGCTCAAAA TGGGTGGTGA GTTCCATCTA AAGCTAAATA TTGGCGAGAG300
ACCGATAGCG AACAAGTACC GTGAGGGAAA GATGAAAAGC ACTTTGGAAA GAGAGTTAAA360
CAGTACGTGA AATTGTTAAA AGGGAAACGA TTGAAGTCAG TCGTGACTGA GAGGCTCAGC420
CGGTTCTGCC GGTGTATTCC CCTCAGTCGG GTCAACATCA GTTTTGTTCG GTGGATAAGG480
GCGGTTGGAA GGTGGCACCC TCGGGTGTGT TATAGCCAAC TGTCGCATAC ATCGGATGAG540
ACTGAGGAAT GCAGCTCGCC TTTATGGCCG GGGTTCGCCC ACGTTCGAGC TTAGGATGTT600
GACATAATGG CTTTAAACGA CCCGTCTTGA AACACGGACC 640