一种N糖基转移酶AaNGT及其应用的制作方法

本发明涉及一种来源于嗜沫嗜血杆菌(aggregatibacteraphrophilus)中n糖基转移酶aangt及其应用，属于分子生物学中糖工程技术领域。

背景技术：

糖蛋白是由寡糖和多肽链共价修饰链接而形成的一类重要的生理活性物质，它广泛存在于细胞膜，细胞间质，血浆以及粘液中。它在细胞信号识别，神经调控，细胞间的信息传达以及免疫调节的过程中扮演着非常重要的角色。蛋白质的糖基化修饰按照重要性依次分为n-o-p-c-和g-糖基化，其中n-连接最为普遍，n-连接的第一个糖为glcnac。它的研究最为透彻。研究发现将糖抗原与载体蛋白相结合，形成的糖蛋白疫苗可以刺激机体产生免疫记忆，因此糖蛋白疫苗的研究引起了广泛关注。而糖蛋白的获得以往是通过生物体内直接提取，或者是体外进行化学合成，这两种方法均存在步骤繁杂，成本较高的缺点。经检索，有关来源于嗜沫嗜血杆菌(aggregatibacteraphrophilus)中的n糖基转移酶aangt及其酶学性质与其在对多肽进行n连接糖基化修饰中的应用还未见报。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种来源于嗜沫嗜血杆菌(aggregatibacteraphrophilus)中n糖基转移酶aangt及其在对多肽进行n连接糖基化修饰中的应用。

本发明所述n糖基转移酶aangt，其特征在于：所述n糖基转移酶aangt来源于嗜沫嗜血杆菌(aggregatibacteraphrophilus)，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

上述n糖基转移酶aangt来源于嗜沫凝聚杆菌(aggregatibacteraphrophilus)的aangt基因由南京金斯瑞公司负责合成并构建与载体pet45b上，通过大肠杆菌bl21发酵诱导表达、纯化回收获得。

本发明所述n糖基转移酶aangt在对多肽进行n连接糖基化修饰中的应用。

其中，所述应用的方法是：以aangt作为一种多肽糖基化修饰的工具酶，将udp-glc或udp-gal转移至含n-x-s/t序列的多肽，形成糖肽；或aangt将特殊的糖基供体udp-glcnh2转移至含有n糖基化位点的多肽上，再利用其他的糖基转移酶将glcnh2转化成glcnac，形成天然的n糖连接。

本发明公开的n糖基转移酶apngt在利用udp-glc的效率上要高于已报到的来源于胸膜肺炎放线杆菌(actinobacilluspleuropneumoniae)的n糖基转移酶apngt，并且aangt还可以利用独特的糖基供体udp-glcnh2转移至含有n糖基化位点的多肽上，进而通过其他糖基转移酶将glcnh2转化成glcnac，形成天然的n连接的糖肽，这为天然n连接糖蛋白的合成提供了一种新的途径，为糖蛋白疫苗的开发奠定了基础。

附图说明

图1：含aangt基因的pet-45b质粒提取的琼脂糖凝胶电泳结果

其中：m表示琼脂糖凝胶电泳marker，1号泳道是从bl21实验菌株中提取的质粒bl21pet45b-aangt，2号泳道是原始构建质粒pet45b-aangt作为阳性对照。

图2：aangt蛋白的sds-page考马斯亮蓝染色结果

其中：m表示蛋白maker，aangt分子量大约在70kda左右，图中1号泳道为诱导后的菌体；2号泳道为超声破壁后的上清，3号泳道为超声破壁后的沉淀；4号泳道为上样流出液，5，6号泳道是低浓度咪唑洗脱目的蛋白流出液；7号泳道是250mm咪唑洗脱的目的蛋白液。

图3：hplc检测aangt酶活结果图。

图4：质朴鉴定结果图。

图5：aangt最适温度结果图。

图6：aangt最适ph结果图。

图7：金属离子aangt酶活影响结果图。

图8：hplc检测aangt与apngt利用udp-glc能力比较。

图9：hplc检测aangt糖基供体底物特异性。

图10：反应产物质朴鉴定结果图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所有的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明的实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行各种变动或者改动也属于本发明的保护范围。

下面结合附图对本发明提供的aangt(来源于嗜沫嗜血杆菌aggregatibacteraphrophilus)及其具体应用进行详细说明。

本试验所采用的底物肽是由南京金斯瑞公司合成的在n端带有tamra标记的六肽danytk，本试验酶学反应之后均将反应液进行处理，利用hplc对反应进行分析，所采用的分析柱为c18反向柱，采用的分离程序如表1-1所示：

表1-1hplc分析程序

本发明设计的菌种和质粒来源如下：

表1-2本发明所用菌株和质粒

实施例1：n糖基转移酶aangt的制备

1.表达菌株的构建

将金斯瑞公司合成的质粒转入bl21感受态细胞中，42℃热击1min，涂amp平板。将单菌落挑至5ml的试管培养基37℃200rpm培育12h，提质粒验证。质粒琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

2.aangt蛋白的表达与纯化

将单菌落bl21pet45b-aangt挑入50mllb培养基中，(含50ug/ml的氨苄青霉素amp)37℃200rpm活化12h。接着扩大培养，将菌液转移至1l培养基中(含50ug/ml的氨苄青霉素amp)，200rpm37℃培育大约3.5h后，测od值，当od600值为0.6时，冰浴20min，之后加入400μl0.5m的iptg，诱导蛋白表达(16℃200rpm)。诱导20h后，10000rpm离心10min收集菌体，用bindingbuffer冲洗菌体，然后按每克湿菌体加入10ml的bindingbuffer的量悬浮菌体，冰浴条件下超声破碎菌体(40w，工作2s休息4s，破碎40min)，然后4℃12000rpm离心，收集上清。将上清用0.22um的滤膜过滤之后，加入到经bindingbuffer平衡过得ni-nta重力柱中，4℃孵育10min后，让液体经重力流经填料，依次用含10mm20mm咪唑的bindingbuffer除去杂蛋白，用含250mm咪唑的bindingbuffer洗脱目的蛋白，并收集目的蛋白。收集30ml左右的目的蛋白后，用10kd的超滤管4℃3500g离心脱盐。

3.目的蛋白的检测

通过sds-page的方法检测目的蛋白，aangt蛋白检测结果见图2。目的蛋白即为n糖基转移酶aangt，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

实施例2：n糖基转移酶aangt在多肽糖基化修饰中的应用

1.酶活的测定：

测定酶活的底物肽为南京金斯瑞公司合成的带荧光标记的六肽danytk，在ngt的催化下，分别于udp-glc或udp-gal反应，反应液经hplc荧光检测器检测，反应体系如表1-3：

表1-3aangt酶活检测反应体系

反应结果图见图3，发现aangt可以利用udp-glc与udp-gal对含糖基化序列的多肽进行修饰，接着对产物进行质朴分析，质谱结果图见图4。

2.最适ph的测定：

为了探究aangt的最适ph，我们选取不同ph的缓冲液，hac(5.0，6.0)pbs(6.0，7.0，8.0)tris(8.0，9.0，10.0)hepes(7.0，8.0)。并做10μl的反应体系，反应15min后煮沸5min停止反应，接着用hplc进行分析。反应体系如表1-4：

表1-4最适ph的测定

反应结果图见图5，发现aangt在ph8.0的pbs缓冲液中活性是最强的。

3.最适温度的测定：

为了探究aangt最适温度，我们做10μl的反应体系，在不同的温度下反应15min(分别在10℃，20℃，30℃，37℃，40℃，50℃和60℃下进行反应)，接着煮沸5min停止反应，并用hplc进行分析，反应体系如表1-5：

表1-5最适温度的测定

反应结果见图6，发现aangt在30℃下活性是最高的。

4.金属离子对活性的影响：

选取了8中金属离子，研究金属离子对aangt酶活的影响，反应体系如表1-6：

表1-6金属离子对酶活的影响

反应结果见图7，我们发现aangt在有无金属离子的情况下均有活性，其中cu²⁺与mn²⁺离子对于aangt的活性有明显的抑制作用。

5.糖基化效率的比较：

为了比较aangt与apngt之间的糖基化效率的差别，设计如下反应体系，保证体系中各种条件都相同，反应体系如表1-7：

表1-7糖基化效率的比较

反应结果见图8，我们可以从hplc的结果中明显发现aangt催化产生的产物明显要高于已报到的apngt，说明aangt利用udp-glc的能力要高于apngt。

6.糖基供体底物特异性分析：

选取5种udp-sugar衍生物，研究aangt的糖基供体底物特异性，其中udp-sugar衍生物见表1-8，反应体系如表1-9：

表1-8udp-sugar衍生物

表1-9糖基供体底物特异性分析

反应hplc结果见图9，我们发现aangt可以利用udp-glcnh2，接着对产物进行质谱验证，质谱结果图见图10，质谱结果证明aangt利用udp-glcnh2。

序列表

<110>山东大学

<120>一种n糖基转移酶aangt及其应用

<141>2017-6-20

<160>1

<210>1

<211>621

<212>prt

<213>人工序列

<221>aangt的氨基酸序列

<222>（1）…（621）

<400>1

msrkknpsviqfekaiteknyeaactelldilnkidtnfgdiegidfdypqqletlmqdr60

ivyfctrmsnaitqlfcdpqfslsesganrffvvqrwlnlifasspyinadhilqtyncn120

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