一种人类诱导性多能干细胞专用的复苏试剂及复苏方法与流程

本发明涉及一种细胞的复苏试剂及复苏方法，具体涉及一种人类诱导性多能干细胞专用的复苏试剂以及利用该复苏试剂复苏人类诱导性多能干细胞的方法，属于细胞生物学技术领域。

背景技术：

人类诱导性多能干细胞是当前干细胞研究的热点和焦点。它可以分化成体内所有的细胞，进而形成身体的所有组织和器官。因此，人类诱导性多能干细胞的研究不仅具有重要的理论意义，而且在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值。

在人类诱导性多能干细胞的研究过程中，经常会涉及到细胞冻存和对冻存的细胞进行复苏。

一、细胞冻存

细胞冻存使用的冻存试剂有含血清和无血清两类，由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂贵等缺点，所以无血清冻存和复苏技术成为发展的趋势。

对细胞进行冻存操作时，一般是将细胞悬浮在冻存试剂中，然后采用梯度降温的方法降温，降温速度大约是1℃/min。

二、细胞复苏

目前，对冻存的细胞进行复苏时，一般是将冻存管直接置于37℃迅速解冻，然后加入完全生长培养基重悬细胞，离心弃上清后，再加入完全生长培养基继续培养，以供后续的研究或测试使用。

结合上述无血清冻存和复苏技术对细胞进行冻存和复苏，细胞冻存后复苏率远低于含血清的冻存技术。所以，一些细胞复苏试剂应运而生。但是，现有的细胞复苏试剂还存在以下两方面的问题：

(1)一种复苏试剂只适用于一种细胞，或者只适用于少数几种相似的细胞，通用性较差；

(2)细胞复苏后，复苏成活率(复苏率)较低，并且活性较差。

对于人类诱导性多能干细胞，目前还没有专门的复苏试剂，并且在复苏操作中使用的其他细胞复苏试剂还含有动物成分，使用起来不够安全。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种人类诱导性多能干细胞专用的复苏试剂及复苏方法，该专用的复苏试剂及复苏方法不仅可保证人类诱导性多能干细胞具有较高的成活率(复苏率)和较好的活性，而且可保证细胞仍然保持很好的多功能性，同时不含动物成分、安全可靠。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种人类诱导性多能干细胞专用的复苏试剂，其特征在于，不含有动物成分，具体由以下成分组成：

利用前述的复苏试剂复苏人类诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

step1：将15ml离心管和权利要求1前述的复苏试剂都置于4℃平衡，将水浴锅温度调至37℃；

step2：将细胞冻存管从液氮中取出，然后浸入37℃水浴锅内，轻轻的晃动冻存管，当冻存管内的冰核达到黄豆大小的时候，取出冻存管，用酒精棉擦拭管体，然后转移到超净工作台内；

step3：在冰上打开冻存管的管盖，轻柔的将冻存管内的细胞悬液吸取出来，转移到一个预冷的15ml离心管内，然后缓慢加入8ml权利要求1前述的复苏试剂，边加边轻摇混匀，滴加完之后盖上管盖，轻轻地上下颠倒混匀；

step4：继续缓慢补加权利要求1前述的复苏试剂至13ml，拧上管盖，轻轻地颠倒混匀；

step5：4℃、260g离心8min，小心地吸出上清，然后用手指轻弹离心管管底，将细胞团分散；

step6：向离心管中加入0.1ml浓度为1mg/ml的dnase，37℃孵育10min；

step7：孵育完成后，加入正常的细胞培养基贴壁培养12h-24h，然后冲去上清，换新鲜的正常的细胞培养基继续培养即可。

前述的方法，其特征在于，在step5中，离心的参数为：4℃、260g离心8min。

本发明的有益之处在于：

(1)本发明的复苏试剂是专门针对人类诱导性多能干细胞进行开发的，使用其复苏液氮冻存之后的人类诱导性多能干细胞后，可保证人类诱导性多能干细胞具有较高的成活率(复苏率)和较好的活性，并且保证细胞仍然保持很好的多功能性；

(2)本发明的复苏试剂配方中不含有动物成分，成分完全明确、可控，使用起来安全性较高；

(3)本发明的复苏试剂属于即用型，所以复苏方法操作方便，容易实施，可广泛推广使用。

附图说明

图1是人类诱导性多能干细胞复苏后的成活率(复苏率)统计图；

图2是人类诱导性多能干细胞复苏后的细胞形态图；

图3(a)是oct4免疫荧光染色图；

图3(b)是hoechst免疫荧光染色图；

图3(c)是oct4与hoechst免疫荧光染色叠加图；

图4(a)是nanog免疫荧光染色图；

图4(b)是hoechst免疫荧光染色图；

图4(c)是nanog与hoechst免疫荧光染色叠加图；

图5(a)是ssea1免疫荧光染色图；

图5(b)是hoechst免疫荧光染色图；

图5(c)是ssea1与hoechst免疫荧光染色叠加图；

图6(a)是ssea4免疫荧光染色图；

图6(b)是hoechst免疫荧光染色图；

图6(c)是ssea4与hoechst免疫荧光染色叠加图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

第一部分：配制人类诱导性多能干细胞专用的复苏试剂

重组人表皮生长因子：购自美国peprotech公司。

重组人血白蛋白：购自武汉禾元生物。

b-巯基乙醇：购自美国sigma公司。

dmem-f12培养基：购自美国gibco公司。

实施例1

准确称取重组人表皮生长因子100ng、重组人血白蛋白1000ng，先加5mldmem-f12，轻轻混匀，待完全溶解后再加入b-巯基乙醇0.1ml，最后用dmem-f12培养基补足10.0ml，充分混匀。

实施例2

准确称取重组人表皮生长因子200ng、重组人血白蛋白1500ng，先加5mldmem-f12，轻轻混匀，待完全溶解后再加入b-巯基乙醇0.2ml，最后用dmem-f12培养基补足10.0ml，充分混匀。

实施例3

准确称取重组人表皮生长因子300ng、重组人血白蛋白2000ng，先加5mldmem-f12轻轻混匀，待完全溶解后再加入b-巯基乙醇0.25ml，最后用dmem-f12培养基补足10.0ml，充分混匀。

在本发明人类诱导性多能干细胞专用的复苏试剂的配方中：

(1)重组人表皮生长因子和b-巯基乙醇的作用是：保护细胞在低温环境下处于休眠状态时，细胞内部结构不产生冰晶，从而保持细胞的活性，保证细胞仍然保持很好的多功能性。

(2)重组人血白蛋白的作用是：取代动物成分的胎牛血清，避免动物成分的存在，更加安全，同时也能让细胞获得足够的养分。

(3)dmem-f12培养基的作用是：为人类诱导性多能干细胞的复苏提供最好的缓冲液体系，同时也能提供足够的糖分、矿物质、氨基酸等。

我们用重组人血白蛋白替换动物血清，所以整个配方中不含血清等动物成分，使用起来更加安全可靠，并且便于质量控制。

第二部分：利用前述复苏试剂复苏人类诱导性多能干细胞

利用前述复苏试剂复苏人类诱导性多能干细胞的方法，主要包括以下步骤：

step1：准备工作

将15ml离心管和前述的复苏试剂都置于4℃平衡，将水浴锅温度调至37℃。

step2：解冻

用镊子将细胞冻存管从液氮中取出，如果有液氮渗漏到冻存管中，要稍微拧开管盖，让气化的液氮逃逸。然后用镊子夹住冻存管，将冻存管浸入37℃水浴锅内(注意管口不要浸入液面以下)，轻轻的晃动冻存管，注意冻存管内冻存细胞的融化情况，当冻存管内的冰核达到黄豆大小的时候，取出冻存管，用酒精棉擦拭管体，然后转移到超净工作台内。

step3：首次添加复苏试剂

在冰上打开冻存管的管盖，轻柔的将冻存管内的细胞悬液(大约1ml)吸取出来，转移到一个预冷的15ml离心管内，然后缓慢加入8ml前述的复苏试剂(4℃)，边加边轻摇混匀，滴加完之后盖上管盖，轻轻地上下颠倒混匀。

step4：补加复苏试剂

继续缓慢补加前述的复苏试剂(4℃)至13ml，拧上管盖，轻轻地颠倒混匀。

step5：分散细胞团

4℃、260g离心8min，小心地吸出上清(要求上清液尽可能吸走，同时又不触及管底沉淀的细胞)，然后用手指轻弹离心管管底，将细胞团分散。

step6：孵育

向离心管中加入0.1ml浓度为1mg/ml的dnase，37℃孵育10min，这样做有利于解决细胞成团现象。

step7：细胞培养

孵育完成后，加入正常的细胞培养基贴壁培养12h-24h，然后冲去上清，换新鲜的正常的细胞培养基继续培养即可。

由此可见，本发明的复苏试剂属于即用型，所以复苏方法操作方便，容易实施，可广泛推广使用。

第三部分：观察人类诱导性多能干细胞的复苏效果

1、人类诱导性多能干细胞复苏后的成活率(复苏率)

我们选取了4种代数的人类诱导性多能干细胞进行复苏，并检测细胞复苏率，检测结果见图1。

2、人类诱导性多能干细胞复苏后的细胞形态

我们选取了复苏后的p4代人类诱导性多能干细胞进行细胞形态观察，复苏后的p4代人类诱导性多能干细胞的形态如图2所示。

3、人类诱导性多能干细胞复苏后的细胞抗原表达情况

我们用免疫荧光染色检测复苏后的细胞抗原的表达情况，细胞核用hoechst(蓝色)染色。

染色结果见图3(a)、图3(b)、图3(c)、图4(a)、图4(b)、图4(c)、图5(a)、图5(b)、图5(c)、图6(a)、图6(b)和图6(c)。

从染色结果图我们可以发现：人类诱导性多能干细胞经本发明的复苏试剂复苏后，细胞仍然保持了很好的多功能性。

由此可见，本发明的复苏试剂是专门针对人类诱导性多能干细胞进行开发的，使用其复苏液氮冻存之后的人类诱导性多能干细胞后，可保证人类诱导性多能干细胞具有较高的成活率(复苏率)和较好的活性，并且保证细胞仍然保持很好的多功能性。

需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。