一种裸鼹鼠骨髓间充质干细胞的原代分离培养方法与流程

本发明涉及干细胞培养领域，具体地说，是一种裸鼹鼠骨髓间充质干细胞的原代分离培养方法。

背景技术：

裸鼹鼠是一种分布于东非部分地区的挖掘类啮齿目动物，在分类学上属于哺乳纲、啮齿目。裸鼹鼠终生在黑暗的地下生活，能够适应低氧环境，并且是啮齿类中寿命最长的动物；对癌症具有超级免疫力。裸鼹鼠长寿、抗衰老、耐低氧、抗肿瘤等特性引起了科学家的广泛关注，针对这些特性的研究成果已发表在nature、pnas等著名刊物上。

骨髓间充质干细胞(bmsc)是从骨髓中分离得到的一种具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。目前虽然已从多种组织中培养出间充质干细胞，但因为骨髓的取材较方便，分离培养简便及含量相对较高，因此骨髓成为间充质干细胞的主要来源。bmscs不仅可以定向分化为脂肪、软骨、骨骼肌细胞等多种细胞；还可分泌多种促进血管生成因子、凋亡因子等多种具有生物学活性的细胞因子。分离裸鼹鼠间充质干细胞对于裸鼹鼠生物资源的推广应用具有重要意义。由于一些体细胞不太容易分离并体外培养，而成体干细胞可以在特定条件向多种细胞进行转化，因此分离裸鼹鼠间充质干细胞可以为研究裸鼹鼠其他不易分离培养的体细胞的生物学特性提供有力的工具。

目前从骨髓分离获得间充质干细胞的方法主要有直接贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞术和免疫磁珠分离法。流式细胞术和免疫磁珠分离法成本较高，推广范围有限；密度梯度离心法在分离小型动物的骨髓间充质干细胞时获得的细胞活性较低；直接贴壁法获得的细胞活性较高，但是由于红细胞影响目标细胞的贴壁，不适用于红细胞过多的动物。裸鼹鼠体型接近小鼠，适应低氧环境，红细胞含量较高，目前的培养方法不利于获得较高活性和数量的裸鼹鼠骨髓间充质干细胞。因此，有必要发明一种适合分离培养裸鼹鼠骨髓间充质干细胞的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于为了推广裸鼹鼠实验动物资源，加强裸鼹鼠体细胞的研究，提供一种裸鼹鼠骨髓间充质干细胞的原代分离培养方法，包括以下步骤：1)冲洗裸鼹鼠骨髓；2)骨髓冲出物过细胞筛；3)破除红细胞；4)直接铺板。

本发明的第一方面，提供一种裸鼹鼠骨髓间充质干细胞的原代分离培养方法，包括以下步骤：

a、用洗涤液冲洗成年裸鼹鼠的骨髓腔，获得骨髓冲出液；所述洗涤液的组成为：pbs溶液，加入0.005％-0.02％(w/v)dnasei；

b、将骨髓冲出液，过细胞筛，制成单细胞悬液；

c、将步骤b得到的单细胞悬液，离心弃上清，收集细胞沉淀；

d、将步骤c得到的细胞沉淀加入1-3ml红细胞裂解液重悬，裂解红细胞1-2min，加等体积终止液，终止裂解，离心后弃上清；所述终止液的组成为：低糖dmem培养基、5％-15％(v/v)fbs、0.5％-2％(v/v)ps双抗、0.005％-0.02％(w/v)dnasei；

e、用培养液将步骤d处理后的细胞沉淀重新制成细胞悬液，按照2×10⁵/cm²接种于培养皿中；所述培养液的组成为：低糖dmem培养基、10％-20％(v/v)fbs、0.5％-2％(v/v)ps双抗、0.005％-0.02％(w/v)dnasei；

f、在33-37℃、10-15％o2、3-5％co2的环境中培养48-72h，半量换培养液，继续培养36-48小时，全量换培养液，此后隔天换液，直到细胞融合达80％，进行传代培养；所述培养液的组成为：低糖dmem培养基、10％-20％(v/v)fbs、0.5％-2％(v/v)ps双抗、0.005％-0.02％(w/v)dnasei。

其中，步骤a所述骨髓冲出液可通过以下方法制备：取成年裸鼹鼠，脱颈椎法安乐死，75％乙醇浸泡，移入超净台。无菌条件下取其两后肢，剥离皮肤和肌肉，分离股骨和胫骨，去掉两端软骨组织。1ml注射器轻轻插入骨髓腔，用洗涤液冲洗骨髓腔，获得骨髓冲出液。

在本发明的一个优选实施例中，步骤a所述洗涤液的组成为：pbs溶液，加入0.01％(w/v)dnasei。

在本发明的一个优选实施例中，步骤b所述细胞筛为200目细胞筛。

在本发明的一个优选实施例中，步骤c所述离心为100g离心5min弃上清，收集细胞沉淀。

在本发明的一个优选实施例中，步骤d所述终止液的组成为：低糖dmem培养基、10％(v/v)fbs、1％(v/v)ps双抗、0.01％(w/v)dnasei。

在本发明的一个优选实施例中，步骤e和步骤f所述培养液的组成为：低糖dmem培养基、15％(v/v)fbs、1％(v/v)ps双抗、0.01％(w/v)dnasei。

在本发明的一个优选实施例中，步骤f在35℃、12％o2、5％co2的环境中培养72h，半量换培养液，继续培养48小时，全量换培养液。

在细胞分离过程中，细胞可能受损释放出dna，与细胞外基质形成dna蛋白复合物，聚集细胞成团。因此，本发明在细胞分离全程各种溶液都加入了dnasei，防止细胞聚团。

本发明优点在于：

1、本发明的裸鼹鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法是首次建立的裸鼹鼠干细胞分离培养方法。贴壁法获得的细胞能分泌生长因子和促贴壁物质，可促进间充质干细胞贴壁生长。红细胞在一定程度上会干扰干细胞贴壁，因此去除红细胞可以提高间充质干细胞的纯度，增加干细胞贴壁的机会。随着传代次数的增多，间充质干细胞得以更加纯化。本发明利用红细胞裂解液破除红细胞而后将细胞直接贴壁，获取间充质干细胞。此方法获得的干细胞，损失低，纯度高，细胞形态均一，细胞增殖能力强，可用于体外大量扩增培养。

2、本发明建立了一种裸鼹鼠骨髓间充质干细胞的原代分离培养方法，并对该方法培养的细胞进行了生物学特性的鉴定，证实该培养方法能够获得纯度很高、活性很好、有分化能力的裸鼹鼠骨髓间充质干细胞，从而为进一步深入研究裸鼹鼠干细胞特性以及探讨裸鼹鼠不易分离但可以由干细胞转化的体细胞的特征提供了可能性。

附图说明

图1为倒置显微镜观察原代培养的裸鼹鼠骨髓间充质干细胞图(5×)；

图2为倒置显微镜观察传代培养的裸鼹鼠骨髓间充质干细胞图(5×)；

图3为免疫荧光染色法在荧光显微镜下鉴定裸鼹鼠骨髓间充质干细胞图；

图4为流式鉴定裸鼹鼠骨髓间充质干细胞图；

图5为倒置显微镜观察成骨诱导的裸鼹鼠骨髓间充质干细胞图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

以下实施例所使用的主要材料及来源分别如下：

裸鼹鼠(第二军医大学实验动物中心)；

dmem低糖培养基(gibco)；fbs(gibco)；dnasei(solarbio)；双抗(gibco)；红细胞裂解液(生工)；细胞核染料dapi(sigma)；cd73抗体(proteintech)，荧光二抗(jackson)；谷氨酰胺、茜素红染液、β-磷酸甘油、地塞米松、抗坏血酸(cyagen)；流式抗体apc-cd45、fitc-cd90(biolegend)；

洗涤液(pbs、0.01％(w/v)dnasei)

终止液(低糖dmem培养基、10％(v/v)fbs、1％(v/v)ps双抗、0.01％(w/v)dnasei)

培养液(低糖dmem培养基、15％(v/v)fbs、1％(v/v)ps双抗、0.01％(w/v)dnasei)

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

实施例1裸鼹鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法

(1)取一只成年裸鼹鼠，脱颈椎法安乐死，75％乙醇浸泡，移入超净台。无菌条件下取其两后肢，剥离皮肤和肌肉，分离股骨和胫骨，去掉两端软骨组织。1ml注射器轻轻插入骨髓腔，用洗涤液冲洗骨髓腔，获得骨髓冲出液。

(2)将骨髓冲出液，过200目细胞筛，制成单细胞悬液；

(3)将上述细胞悬液，100g离心5min弃上清，收集细胞沉淀；

(4)将细胞沉淀加入2ml红细胞裂解液重悬，裂解红细胞1-2min，加等体积终止液，终止裂解，离心后弃上清；

(5)用培养液将细胞沉淀重新制成细胞悬液，按照2×10⁵/cm²接种于培养皿中；

(6)在35℃、12％o2、5％co2的环境中培养72h，半量换培养液，继续培养48小时，全量换培养液，此后隔天换液，直到细胞融合达80％，进行传代培养。

倒置显微镜观察原代培养和传代培养的裸鼹鼠骨髓间充质干细胞见图1和图2。

实施例2实施例1的裸鼹鼠骨髓间充质干细胞鉴定及纯度与活力评估

1、细胞免疫荧光鉴定

将细胞接种盖玻片，待骨髓间充质干细胞爬片达理想密度，4％(w/v)多聚甲醛固定样本10min；pbs洗5min，0.1％(v/v)tritonx-100处理10min，增加细胞膜的通透性；山羊血清封闭1h；孵育一抗(cd73用含0.1％(v/v)tritonx-100的pbs1：1000稀释)稀释，4℃过夜；另外用pbs代替一抗作阴性对照；pbs洗3遍，每次10min，孵育二抗(goatanti-rabbitigg(h+l))(用含0.1％tritonx-100的pbs1：200稀释)4℃过夜或37℃避光1h；加入dapi(4，6-二脒基-2-苯基吲哚)室温3min-5min染核pbs洗3次，10min/次。抗淬灭剂封片。-20℃避光保存，直到荧光显微镜观察成像。

免疫荧光细胞化学染色可见裸鼹鼠骨髓间充质干细胞经荧光二抗显色后，呈红色颗粒状分布于胞浆中，细胞核被dapi染成蓝色细胞表面标志物cd73为阳性，符合骨髓间充质干细胞表面标志特征(图3)。

2、裸鼹鼠骨髓间充干细胞纯度评估

将分离培养的骨髓间充质干细胞，弃上清；pbs洗涤后，用胰酶消化细胞，l-dmem终止消化，离心弃上清；pbs洗涤后，室温避光同时孵育apc-cd45和fitc-cd90，30min后，pbs洗涤，并重悬细胞，上机进行流式细胞术检测。

将第2代骨髓间充质干细胞，利用流式细胞仪检测细胞表面标志物，结果发现cd90为98.36％，呈阳性高表达；而cd45为0.74％，呈阴性表达。符合骨髓间充质干细胞表面标志特征，且纯度很高(图4)。

3、裸鼹鼠骨髓间充质干细胞活力评估

台盼蓝染色评估细胞的活力：取对数生长期细胞，调整细胞密度为10⁴/ml.接种于96孔培养板，每孔180μl，培养24h后加0.4％(w/v)台盼蓝，每孔20μl。用细胞全自动计数仪计数，拒染的为活细胞，计算活细胞的百分比，以判断细胞存活状况。

4、分离培养的裸鼹鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导

将传第二代的裸鼹鼠骨髓间充质干细胞，接种到六孔板，每孔1×10⁵，24h后加入诱导培养基。成骨诱导培养基成分为低糖dmem培养基，含10％(v/v)胎牛血清、10mmol/lβ-磷酸甘油、100nmol/l地塞米松和0.2mmol/l抗坏血酸。每周换液2次。诱导结束后，吸走成骨诱导分化培养基，用pbs冲洗1-2次。每孔加入2ml4％(w/v)中性甲醛溶液，固定30min。吸走中性甲醛溶液，用pbs冲洗2次。每孔中加入1ml茜素红染液染3-5min。吸走茜素红染液，用pbs冲洗2-3次。将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。

由图5可以看出，本实施例分离培养的裸鼹鼠骨髓间充质干细胞，在成骨分化诱导实验中，呈现良好的分化能力。在成骨诱导实验中，成骨诱导培养1天，细胞体积增大，呈短梭形；诱导第3天，细胞呈多角形，胞质内细胞颗粒增多；第5天，胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长，细胞间钙质沉积；第7天，细胞结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构，钙结节形成明显，经茜素红染色呈红色结节。骨髓间充质干细胞在茜红染色后出现明显的骨质结构；这说明了本发明所获取的骨髓间充质干细胞维持着良好的干性。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。