本发明涉及细胞工程领域，具体来说是一种高效的人颊脂体脂肪干细胞的制备方法。
背景技术：
脂肪干细胞（adiposed-derivedstemcells,ascs）来源于脂肪组织，是一种处于静止状态的，未分化的干细胞，它具有保持长期自我更新的能力，且在一定条件下，能诱导分化成为特定的组织。由于脂肪组织易获得，供应充足，可反复取材，无道德争论，因此，ascs是组织工程优秀的种子细胞，有望在乳房再造、面部凹陷畸形、各种组织缺损修复、帕金森病治疗中发挥作用。
颊脂体是一团特殊的脂肪组织，它与皮下脂肪组织有着明显的区别,颊脂垫内的脂肪小叶间隔为薄弱而疏松的结缔组织，脂肪细胞小，富于顺应性和半流动性，非常柔软，易与周围组织分离，易于伸展和塑形,抗感染能力强，不易吸收和坏死,颊脂体以上解剖特点为其临床应用提供了有利条件。
脂肪组织是一种非常有前景的间充质干细胞来源，其不需要给病人全身麻醉隔离，而给病人最小的不适感,人脂肪干细胞已经被证明是一种多能干细胞,尤其是颊脂体很容易在口腔颌面外科领域获得，并提供了一个可靠的口腔外科的组织材料,颊脂体包含有大量的脂肪干细胞，其表型与腹部皮下脂肪组织干细胞,在适当的条件下，颊脂体脂肪干细胞能体外分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等。
目前在人体脂肪干细胞研究方面，关于颊脂体脂肪干细胞研究鲜见报端,另外脂肪干细胞的培养方法多采用单一酶消化法，细胞得率低，消化时间长，损伤细胞、影响细胞活性，且掺杂有内皮细胞等,在细胞移植方面受到限制。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中的细胞得率低、消化时间长、细胞活性差的缺陷，提供一种高效的人颊脂体脂肪干细胞的制备方法来解决上述问题。
本发明公开了一种高效的人颊脂体脂肪干细胞的制备方法，具体步骤为：
（1）、通过外科手术获得的颊脂体组织，用d-hank’s溶液冲洗3次，洗去组织表面的结缔组织、血管内皮；
（2）、用外科手术剪把人颊脂体组织剪碎成1mm3的小块；
（3）、用含有0.01%（m/v）ⅰ型胶原酶和0.05%（m/v）中性蛋白酶的高糖dmem培养基10ml，在37℃的条件下，消化60min；
（4）、吹打上述细胞悬液4-5次，在室温条件下，以860×g的转速，离心10min；
（5）、吸弃上层悬浮脂肪颗粒和成熟脂肪细胞，获取底部细胞团，采用pbs溶液重悬细胞，并用100μm孔径滤膜过滤；
（6）、对细胞滤液计数，用过量的1×bdimag™buffer轻洗细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
（7）、把cd31磁珠彻底涡旋均匀，然后每1×107个细胞加50μlcd31磁珠，混合均匀后，在30℃的条件下孵育30min；
（8）、用bdimag™buffer把体系调整到1-8×107个/ml细胞之后，迅速把标记好的体系放到磁力架上孵育8-10分钟；
（9）、吸出磁力架上的流式管里面的液体上清，上清细胞为cd31-细胞，此时即为去除了内皮细胞后，纯化的脂肪干细胞；
（10）、在1500rpm条件下，将上清液离心5min，弃上清；
（11）、将上述细胞置于37℃，5%co2培养箱中，用10mldmem培养基进行培养，每周换液2次；
（12）、细胞融合度达到80%以上后，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞两次；
（13）、向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的co2温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml高糖dmem培养基终止消化；
（14）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm条件下，离心7min，采用高糖dmem培养基洗3次；
（15）、将细胞按1:3比例分瓶传代，并用含有10%（v/v）fbs，40u/ml硫酸庆大霉素的dmem培养基进行培养；
（16）、细胞传至3代即可用于分化成神经细胞、软骨细胞、脂肪细胞等组织，或细胞移植，或传代至4代、5代进行冷冻保存。
作为优选，所述的步骤（7）中，在对cd31磁珠涡旋均匀之前，先用pbs液对cd31磁珠稀释10倍，然后置于4℃保存备用。
作为优选，所述的步骤（11）中，所述的dmem培养基中含有10%（v/v）fbs和40u/ml硫酸庆大霉素。
作为优选，所述的步骤（13）中，所述的胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%。
作为优选，所述的步骤（13）中，胰蛋白酶-edta溶液购自北京雷根生物技术有限公司。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1、本发明选用颊脂体作为脂肪干细胞的来源组织，这一组织中含有大量的脂肪干细胞，易于获取，且对供体无影响；
2、本发明使用0.01%ⅰ型胶原酶和0.05%中性蛋白酶同时消化细胞，缩短了消化时间，对细胞损伤小，且得率高，活力旺盛；
3、本发明使用了cd31免疫磁珠负选法筛选脂肪干细胞，由于cd31是内皮细胞的表面标志物，通过免疫磁珠系统可以筛除表达cd31的内皮细胞，使得脂肪干细胞进一步纯化，纯化的脂肪干细胞可以应用于细胞移植；
4、本发明使用了bdimagtm磁分选系统，其成本低廉，操作简便。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明公开了一种高效的人颊脂体脂肪干细胞的制备方法，具体步骤为：
（1）、通过外科手术获得的颊脂体组织，用d-hank’s溶液冲洗3次，洗去组织表面的结缔组织、血管内皮；
（2）、用外科手术剪把人颊脂体组织剪碎成1mm3的小块；
（3）、用含有0.01%（m/v）ⅰ型胶原酶和0.05%（m/v）中性蛋白酶的高糖dmem培养基10ml，在37℃的条件下，消化60min；
（4）、吹打上述细胞悬液4-5次，在室温条件下，以860×g的转速，离心10min；
（5）、吸弃上层悬浮脂肪颗粒和成熟脂肪细胞，获取底部细胞团，采用pbs溶液重悬细胞，并用100μm孔径滤膜过滤；
（6）、对细胞滤液计数，用过量的1×bdimag™buffer轻洗细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
（7）、把cd31磁珠彻底涡旋均匀，然后每1×107个细胞加50μlcd31磁珠，混合均匀后，在30℃的条件下孵育30min；
（8）、用bdimag™buffer把体系调整到1-8×107个/ml细胞之后，迅速把标记好的体系放到磁力架上孵育8-10分钟；
（9）、吸出磁力架上的流式管里面的液体上清，上清细胞为cd31-细胞，此时即为去除了内皮细胞后，纯化的脂肪干细胞；
（10）、在1500rpm条件下，将上清液离心5min，弃上清；
（11）、将上述细胞置于37℃，5%co2培养箱中，用10mldmem培养基进行培养，每周换液2次；
（12）、细胞融合度达到80%以上后，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞两次；
（13）、向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的co2温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml高糖dmem培养基终止消化；
（14）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm条件下，离心7min，采用高糖dmem培养基洗3次；
（15）、将细胞按1:3比例分瓶传代，并用含有10%（v/v）fbs，40u/ml硫酸庆大霉素的dmem培养基进行培养；
（16）、细胞传至3代即可用于分化成神经细胞、软骨细胞、脂肪细胞等组织，或细胞移植，或传代至4代、5代进行冷冻保存。
作为优选，所述的步骤（7）中，在对cd31磁珠涡旋均匀之前，先用pbs液对cd31磁珠稀释10倍，然后置于4℃保存备用；
作为优选，所述的步骤（11）中，所述的dmem培养基中含有10%（v/v）fbs和40u/ml硫酸庆大霉素。
作为优选，所述的步骤（13）中，所述的胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%。
作为优选，所述的步骤（13）中，胰蛋白酶-edta溶液购自北京雷根生物技术有限公司。
实施例1
本发明公开了一种高效的人颊脂体脂肪干细胞的制备方法，具体步骤为：
（1）、通过外科手术获得的颊脂体组织，用d-hank’s溶液冲洗3次，洗去组织表面的结缔组织、血管内皮；
（2）、用外科手术剪把人颊脂体组织剪碎成1mm3的小块；
（3）、用含有0.01%（m/v）ⅰ型胶原酶和0.05%（m/v）中性蛋白酶的高糖dmem培养基10ml，在37℃的条件下，消化60min；
（4）、吹打上述细胞悬液5次，在室温条件下，以860×g的转速，离心10min；
（5）、吸弃上层悬浮脂肪颗粒和成熟脂肪细胞，获取底部细胞团，采用pbs溶液重悬细胞，并用100μm孔径滤膜过滤；
（6）、对细胞滤液计数，用过量的1×bdimag™buffer轻洗细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
（7）、把cd31磁珠彻底涡旋均匀，然后每1×107个细胞加50μlcd31磁珠，混合均匀后，在30℃的条件下孵育30min；
（8）、用bdimag™buffer把体系调整到7×107个/ml细胞之后，迅速把标记好的体系放到磁力架上孵育9分钟；
（9）、吸出磁力架上的流式管里面的液体上清，上清细胞为cd31-细胞，此时即为去除了内皮细胞后，纯化的脂肪干细胞；
（10）、在1500rpm条件下，将上清液离心5min，弃上清；
（11）、将上述细胞置于37℃，5%co2培养箱中，用10mldmem培养基进行培养，每周换液2次；
（12）、细胞融合度达到80%以上后，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞两次；
（13）、向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的co2温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml高糖dmem培养基终止消化；
（14）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm条件下，离心7min，采用高糖dmem培养基洗3次；
（15）、将细胞按1:3比例分瓶传代，并用含有10%（v/v）fbs，40u/ml硫酸庆大霉素的dmem培养基进行培养；
（16）、细胞传至3代即可用于分化成神经细胞、软骨细胞、脂肪细胞等组织，或细胞移植，或传代至4代、5代进行冷冻保存。
所述的步骤（7）中，在对cd31磁珠涡旋均匀之前，先用pbs液对cd31磁珠稀释10倍，然后置于4℃保存备用。
所述的步骤（11）中，所述的dmem培养基中含有10%（v/v）fbs和40u/ml硫酸庆大霉素。
所述的步骤（13）中，所述的胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%。
所述的步骤（13）中，胰蛋白酶-edta溶液购自北京雷根生物技术有限公司。
实施例2
本发明公开了一种高效的人颊脂体脂肪干细胞的制备方法，具体步骤为：
（1）、通过外科手术获得的颊脂体组织，用d-hank’s溶液冲洗3次，洗去组织表面的结缔组织、血管内皮；
（2）、用外科手术剪把人颊脂体组织剪碎成1mm3的小块；
（3）、用含有0.01%（m/v）ⅰ型胶原酶和0.05%（m/v）中性蛋白酶的高糖dmem培养基10ml，在37℃的条件下，消化60min；
（4）、吹打上述细胞悬液5次，在室温条件下，以860×g的转速，离心10min；
（5）、吸弃上层悬浮脂肪颗粒和成熟脂肪细胞，获取底部细胞团，采用pbs溶液重悬细胞，并用100μm孔径滤膜过滤；
（6）、对细胞滤液计数，用过量的1×bdimag™buffer轻洗细胞，1500rpm离心5min，弃上清；
（7）、把cd31磁珠彻底涡旋均匀，然后每1×107个细胞加50μlcd31磁珠，混合均匀后，在30℃的条件下孵育30min；
（8）、用bdimag™buffer把体系调整到7×107个/ml细胞之后，迅速把标记好的体系放到磁力架上孵育10分钟；
（9）、吸出磁力架上的流式管里面的液体上清，上清细胞为cd31-细胞，此时即为去除了内皮细胞后，纯化的脂肪干细胞；
（10）、在1500rpm条件下，将上清液离心5min，弃上清；
（11）、将上述细胞置于37℃，5%co2培养箱中，用10mldmem培养基进行培养，每周换液2次；
（12）、细胞融合度达到80%以上后，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞两次；
（13）、向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的co2温箱3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里加入10ml高糖dmem培养基终止消化；
（14）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm条件下，离心7min，采用高糖dmem培养基洗3次；
（15）、将细胞按1:3比例分瓶传代，并用含有10%（v/v）fbs，40u/ml硫酸庆大霉素的dmem培养基进行培养；
（16）、细胞传至3代即可用于分化成神经细胞、软骨细胞、脂肪细胞等组织，或细胞移植，或传代至4代、5代进行冷冻保存。
所述的步骤（7）中，在对cd31磁珠涡旋均匀之前，先用pbs液对cd31磁珠稀释10倍，然后置于4℃保存备用。
所述的步骤（11）中，所述的dmem培养基中含有10%（v/v）fbs和40u/ml硫酸庆大霉素。
所述的步骤（13）中，所述的胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%。
所述的步骤（13）中，胰蛋白酶-edta溶液购自北京雷根生物技术有限公司。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。