枸杞子的新用途的制作方法

本发明涉及一种枸杞子的新用途，具体地，是在制备促进胚胎干细胞向类卵细胞的诱导液中的用途。
背景技术：
：近年来，由于环境污染严重、工作压力加大、饮食习惯改变、生殖系统疾病等因素对正常受孕造成不利影响，不孕症患者数量呈上升势头，发病率约为12.5％～15％，且有逐年增加趋势。因此世界卫生组织(who)宣布将不孕症与心血管病、肿瘤并列为当今影响人类生活和健康的三大主要疾病。自1978年全球首例试管婴儿诞生以来，以体外授精-胚胎移植(ivf-et)为代表的辅助生殖技术(art)的引入给不孕不育症的成功治疗提供了更大的可能。助孕的相关研究对于解决不孕不育患者的实际问题具有现实的意义。体外受精(ivf)是指哺乳动物的精子和卵在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。获取合格的卵和精子，是体外受精的基础，目前，体外受精包括促排卵、卵泡检测与取卵、精子的优选与处理和体外受精步骤。诱发多个卵泡发育的促排卵是不孕治疗的重要基础，此环节早时使用自然周期排卵，但每一自然周期一般仅有一个卵泡成熟，提供卵少，导致实施以后步骤困难，且妊娠率低，现已被超排卵技术所取代。然而，超排卵技术是指应用人类促性腺激素促进更多卵泡成熟排卵的一种技术，由于此过程多个同时发育，雌二醇增加，引起反馈性的黄体生成素(lh)峰出现，导致卵早熟，质量差，妊娠率低，而且因药物过度使用引起的并发症，如卵巢过度刺激综合征(ohss)、多胎妊娠、出生缺陷和表遗传学修饰异常等。因此，急需寻找其他合适的方法，制备生殖细胞。同时，对于因机能衰退，体内无法发育得成熟生殖细胞的人群，如，绝经妇女，更需要寻找一种体外制备生殖细胞的方法。枸杞子，为茄科植物宁夏枸杞lyciumbarbaruml.的干燥成熟果实。夏、秋二季果实呈红色时采收，热风烘干，除去果梗，或晾至皮皱后，晒干，除去果梗。性味:甘，平。归经:归肝、肾经。功效:滋补肝肾，益精明目。主治:用于虚劳精亏。医膝酸痛，眩晕耳鸣，内热消渴，血虚萎黄，目昏不明。胚胎干细胞，简称es、ek或esc细胞，是早期胚胎(原肠胚期之前) 或原始性腺中分离出来的一类细胞。目前，未见枸杞子影响胚胎干细胞向生殖细胞方向分化的报道。技术实现要素：本发明的技术方案是提供了一种诱导人胚胎干细胞定向分化为类卵细胞的方法。本发明首先提供了枸杞子在制备人胚胎干细胞定向分化为类卵细胞的诱导液中的用途。类卵细胞，是指具有卵细胞样结构，表达卵细胞标志物的细胞。本发明还提供了人胚胎干细胞定向分化为类卵细胞的诱导液，它以细胞培养基为基础培养液，添加有终浓度为2～20％(v/v)的含药血清；所述含药血清按照如下方法制备：(1)取枸杞子，以5.0g/kg的剂量施用于鼠，施用方式为口服给药；(2)给药30min、60min、90min后，眼底静脉丛取血，分别静置、离心得上清液，混匀，即为含药血清。其中，所述细胞培养基的制备方法如下：取dmem/f-12(1：1)培养基，加入1/4倍体积的血清替代品，混匀，再加入bfgf和非必须氨基酸，得基础培养液，其中，bfgf的终浓度为4ng/ml，非必须氨基酸的终浓度为1％(v/v)。其中，所述含药血清的终浓度为3％(v/v)。步骤(2)中，静置的时间为2h，离心转速为3000rpm，离心时间为10min。本发明还提供了人胚胎干细胞定向分化为类卵细胞的方法，包括如下步骤：a、取人胚胎干细胞；b、置于前述的诱导液中培养，培养时间不低于5天，即得类卵细胞。优选地，步骤b中，所述培养时间为5～7天。综上，本发明药物枸杞子诱导人胚胎干细胞后，细胞出现了类卵细胞样结构，同时还表达卵母细胞标识基因和标识蛋白，说明枸杞子以及含药血清可以人胚胎干细胞分化为类卵细胞。本发明药物可以诱导人胚胎干细胞分化为类卵细胞，可以为体外受精技术提供原材料，克服超排卵技术的种种缺陷，应用前景非常优良。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1人胚胎干细胞的形态图；图2scp3、zp1的荧光免疫结果图。具体实施方式实验例1本发明诱导液诱导人胚胎干细胞分化为类卵细胞1、实验材料1.1实验仪器激光扫描共聚焦荧光显微镜成像系统(zeisslaserscanningconfocalmicroscopeimagingsystem)：lsm710，德国zeiss超声波清洗器(ultrasoniccleaner)：昆山市超声仪器有限公司，kq5200b；电子天平(electronicbalance)：瑞士梅特勒-托利多公司，ab265-5；纯水机(ultra-purewaterprocessor)：中国优普公司，upr-iv-10t；co2细胞培养箱(co2cellcultureincubator)：美国thermoscientific公司，3111；单人超净工作台：中国苏州净化公司，bj-cdseries；cdna合成仪(generalpcrsystem)：美国mjresearch公司，ptc-200；实时荧光定量pcr仪(real-timequantitativepcr)，bio-rad,cfx96倒置荧光显微镜(uprightfluorescencemicroscope)：德国zeiss公司，dm4000b；倒置显微镜(invertedmicroscope)：德国leica公司，dmi3000b；-80℃超低温冰箱(-80℃ultra-lowtemperaturefreezer)：日本sanyo公司，mdf-u73c；-40℃低温冰箱(-40℃lowtemperaturefreezer)：日本sanyo公司，mdf-u5412；4℃冰柜(4℃refrigerator)：日本sanyo公司，mpr-1411r；大型台式冷冻离心机(large-sizeddesktopcentrifugewithrefrigerator)：美国thermoscientific公司，sorvallbiofugestratos；台式冷冻离心机(desktopcentrifugewithrefrigerator)：美国thermoscientific，legendmicro17r；台式离心机(desktopcentrifuge)：美国thermoscientific公司，micromax；大容量液氮罐(largevolumeliquidnitrogencanister)：美国mve公司，xc47/11-10；高压灭菌锅(autoclaver)：日本sanyo公司，mls-3020；全波长酶标仪(fullwavelengthmicroplatereader)：美国thermoscientific公司，multiskan；精密ph计(phmeter)：德国sartorius公司，pp-15；恒温烤箱：上海精宏实验设备有限公司，dhg-9053a；恒温水浴锅：四川成都赛可隆机械设备有限公司，esun-0048；恒温磁力搅拌器：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司，h01-1a；0.1-2.5ul手动单道可调式移液器：德国eppendorf,7093536a；0.5-10ul手动单道可调式移液器：德国eppendorf，9093136a；10-100ul手动单道可调式移液器：德国eppendorf，5394296a；20-200ul手动单道可调式移液器：德国eppendorf,321356a；100-1000ul手动单道可调式移液器：德国eppendorf，349514a；1.2实验材料与试剂饲养层细胞nih3t3：atcc编号：atcccrl-1658人胚胎干细胞h9：中国科学院干细胞库编号：scsp-302枸杞子：市售品bfgf(碱性成纤维细胞生长因子)，市售品。胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)：corning,australiasource:35076101rknockoutserumreplacementforescs，血清替代品gibco，lot:1347549dmem/f-121:1(hyclone,sh30023.01b):thermo，usadmem/highglucose(hyclone,sh30243.01b):thermo，usarhwnt-3a5036-wnp,10ug,r&dsystems,usa.svh1214081rhbmp4314-bp,10ug,r&dsystems,usa.bem9214021rhfgf-basic234-fse,25ug,r&dsystems,usa.bue3913101非必需氨基酸(non-essentialamino，memneaa100x):gibco，lot:12401962-巯基乙醇(β-mercaptoethanol):gibco，lot:862986pbs(phosphatebuffersolution,pbs)：成都哈里生物青、链霉素(penicillin-streptomycinsolution)：hyclone，j140031，usa明胶(gelatin):biosharp,sigma,g-9382丝裂霉素c(amresco，1413c221)usa二甲基亚砜(细胞冻存)(dmso)：sigma-aldrich,d2650,usa0.25％胰蛋白酶-0.01％edta：gibco-brl，md，usa超低吸附培养板：corning,costar(08714009)usa6/12孔细胞培养板：thermoscientific(7076154)24/48孔细胞培养板：nunctm(150687)通气盖75cm2、25cm2培养瓶：corningflaskny(430639)15ml锥形离心管：corningcentristar50ml锥形离心管：corningcentristar2ml一次性冻存管：corningcentristar10ul袋装吸头：axygen，13513418200ul袋装吸头：axygen1000ul袋装吸头：axygen(21614378)1.5ml离心管：axygenacorningbrand(31108051)0.5ml薄壁管[平盖]：axygenacorningbrand(1641309)50ml加样槽jetbiofil(141205-139)200ulpcrtubeslbtide,greystonebiosciences,25719,usa一抗：rabbitanti-foxl2antibody(1:100，santacruzbiotechnologysc-683489248)、rabbitanti–fshr(1:100，santacruzbiotechnology,sc13953,1813)。rabbitanti-scp3(1:200，cellsignalingtechnology)rabbitanti-gdf-9(1:100，abcam)rabbitanti-zp1(1:200，santacruzbiotechnology)二抗：山羊抗兔(goatanti-rabbit)igg-cfl488(santacruzbiotechnologysc-362262,7611)hoechst33258:碧云天牛血清白蛋白(bsa)5gaidscience,l101024多聚甲醛：上海铭睿生物科技有限公司txitonx-100：amrescobiobasichrp-dab底物显色试剂盒：碧云天0.22μm滤膜：millipore注射用高纯度尿促性素75国际单位(hmg):ferringgmbh(德国)(k10152c)无水乙醇ethanol500ml：成都科龙化工试剂厂异丙醇：成都科龙化工试剂厂三氯甲烷：成都科龙化工试剂厂免疫染色封闭液(beyotimep0102)：碧云天引物：invitrogen,成都莱弗生物科技有限公司trizol：beyotimer0016,成都，碧云天estradioleiakit：caymanchemical,usa1ml、5ml、20ml、50m一次性无菌注射器：上海双鸽cdna试剂盒：thermosciences(00200829)rt-pcr试剂盒sybrgreenrt-pcr试剂盒：qiagensciences(204054)，德国无菌棉球、95％酒精、75％酒精等1.3培养基：nih3t3细胞培养液组成：dmem/highglucose+10％fbshes完全培养液(h9完全培养液)的组成：80％dmem/f-121：1+20％knockoutserumreplacement+4ng/mlbfgf+0.1mmβ-mercaptoethanol+1％nonessentialaminoacidspbs液的配制：氯化钠8g,氯化钾0.2g，磷酸二氢钠1.93g，磷酸二氢钾0.2g，加1000ml双蒸水混匀。4％多聚甲醛：多聚甲醛4g，80mlpbs，60℃助溶。逐滴加入1nnaoh，ph调节至7.4，用pbs定容至100ml。2、实验方法2.1诱导培养基的制备以及细胞培养2.1.1鼠血清的制备sd大鼠，清洁级，6～8周龄，体重220～250g，♀♂兼用，各15只，许可证号：scxk(川)2004-15；四川省医学科学院实验动物研究所提供。动物饲养于清洁级动物室，温度22±2℃，湿度40～70％，10h/14h明暗交替，每3min自动换气一次，常规全价颗粒饲料喂养，自由饮水，♀♂分开饲养于不锈钢饲养笼内。在体重均一的情况下随机将60只大鼠分成2组：空白组和药物组，每组10只，雌雄各半。空白组大鼠灌服蒸馏水，药物组大鼠灌服枸杞子超细粉，给药剂量均为5.0g/kg，给药容量均为20ml/kg。分别于给药后30、60、90min股动脉取血，血液静置2小时后，3000rpm离心15min，分离各组各不同时间段血清，将每组三个时间段的血清混匀；取大鼠血清150μl，加入高氯酸-甲醇液(15μl50％高氯酸+5μl甲醇)，漩涡振荡2min，然后20000rpm离心10min，取上清液作为供试液做高效液相色谱分析，按分析结果，按成分峰制备含药大鼠血清。所有分离所得血清均用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，得含药鼠血清，-20℃保存待用。2.1.2人胚胎干细胞h9的培养人类胚胎干细胞h9细胞具有正常的女性核型(46，xx)，从美国wicell 引进，购买于中科院上海干细胞库，中国科学院干细胞库编号：scsp-302。2.1.2.1饲养层细胞nih3t3的培养准备0.1％明胶铺板静置30min，去掉明胶溶液，将已复苏的nih3t3细胞接种t25培养瓶中，加入3mlnih3t3完全培养液5％co2、37℃条件下培养，每隔48h换液。当每孔细胞生长至80％满板时，按1:40比例加入丝裂霉素c抑制细胞生长，3h后pbs缓冲液轻柔清洗5次，加入3mlnih3t3完全培养液，至mef准备完毕，次日即可复苏h9。2.1.2.2人胚胎干细胞h9的培养以及eb的制备将已用丝裂霉素c处理后的nih3t3作为mef，将h9接种于mef之上，加入h9完全培养液置于于5％co2、37℃条件下培养，复苏后48h换液，以后每24h换液。5-6d后镜下观察可见明显的干细胞克隆团。此刻可以进行干细胞拟胚体的制备，弃h9完全培养液，加入2ml0.125％trypsin-edta后，于超净台放置2min。轻轻晃动培养瓶见细胞脱下时，加入2mlh9完全培养液中止消化。轻轻吹打细胞直至细胞完全脱落，将细胞悬液吸至15ml离心管中，37℃，1000rpm/min，3min。弃上清，加入的h9完全培养液3ml，重置细胞，利用差数贴壁法将mef细胞与h9分离，将已经去mef的h9细胞用干细胞完全培养液稀释至大约1.5×105细胞/孔的浓度接种于超低吸附板中，5％co2、37℃条件下静置培养。24h后，肉眼可见培养板中漂浮着白色颗粒状物体,即为eb。2.2人胚胎干细胞的诱导分化72h后将制备好的eb放置于24孔培养板中，以终浓度为3％的含药鼠血清分别诱导各组细胞分化，每隔48h换液，5％co2、37℃条件下培养，镜下观察及拍照，培养5天后进行生殖细胞分化相关的标记基因的检测，培养7天后进行细胞免疫荧光实验。诱导分化培养基是添加了终浓度为3％的含药鼠血清的hes完全培养液(h9完全培养液)，其制备方法如下：取dmem/f-12(1：1)培养基，加入1/4倍体积的血清替代品(knockoutserumreplacementforescs)，混匀，再加入bfgf和非必须氨基酸(nonessentialaminoacids)，bfgf的终浓度为4ng/ml，非必须氨基酸的终浓度为1％(v/v)，得基础培养液；再在基础培养液中，加入含药鼠血清，其中，含药鼠血清的终浓度为3％(v/v)，即得本发明诱导液。2.2.1细胞免疫荧光实验(1)用pbs洗涤培养板细胞2次；(2)加入4％多聚甲醛固定15min；(3)用1‰pbstriton洗涤2次；(4)加入封闭液封闭1h；(5)分别滴加适当浓 度的一抗(scp3)，37℃孵育1h；(6)pbstriton洗2次；(7)加fitc标记的山羊抗兔igg(150:1)，室温孵育1h；(8)加入hoechst332585min；(9)pbs冲洗2次；加入抗淬灭剂；(8)荧光显微镜下观察，拍照。2.2.2生殖细胞分化相关的标记基因的检测提取两组细胞总rna(1)弃培养液上清，pbs轻轻液洗1次，每孔加入trizol500ul,轻轻吹打至澄清，室温下放置10分钟,转入1.5mlep。(2)每管加入100ul氯仿，轻柔震荡使液体充分混匀，静置10min。(3)12000rpm，4℃，离心15min；将透明上清移至ep管。(4)弃上清，加入100ul异丙醇，混匀，室温静置10min；(5)12000rpm，4℃，离心10min；(6)弃上清，管壁底部可见少许乳白色rna沉淀，70％depc乙醇500ul，温和震荡混匀；(7)8000rpm，4℃，离心5min，弃上清。(8)弃上清液，开盖静置5min后，加入20ul/管depc水，混匀，至此rna提取结束合成cdna(1)提前取出cdna合成试剂盒，室温下至少放置30min，实验前15min内取出rna样品。(2)将合成试剂与样品按如下比例配制：表1cdna合成试剂配制表(3)将配制好的cdna样品放置于ptc-200中，选择cdna合成程序开始进行合成。cdna合成程序如下：1＝5minutesat65℃2＝60minutesat42℃3＝5minutesat70℃4＝end参考genbank中mrna序列，按照引物设计原则，应用genetool和oligo软件设计引物，引物由invitrogen，成都莱弗生物科技有限公司。根据各引物分子量大小加入适量te缓冲液配制成100mm的贮存液，用时加蒸馏水稀释为10mm。表2针对7种标识基因及内参基因的引物信息qpcr实验样品配制提前取出qpcr试剂盒及合成好的cdna样品，室温下放置15-20min。qpcr实验样品配制如下：(1)引物：5ul＝1ulforwardprimer+1ulreverseprimer+3ulh2o(2)样品：15ul＝10ulmastermix+0.5ulsample+4.5ulh2oqpcr样品上机上机程序如下：(1)95℃for3:00(2)95℃for0:10(3)55℃for0:20+plateread(4)72℃for0:30(5)goto2,59moretimes(6)meltcurve50.0to95.0℃，increment0.5℃for0:05+plateread(7)endqpcr实验数据处理与分析将软件biorad所分析得出的ct值导出至excel表格中，以同组中gapdh为内参，计算出每组基因△ct值，以2为底数算出2△c即每个基因表达量的绝对值；选择相同时间段完全培养液对照组所对应基因为内参，算出2△△ct即每个基因表达量的相对值。运用spss19.0统计软件中卡方检验对2△ct和2△△ct进行数据统计与分析，若所有数据均满足正态分布、方差齐性则采用均数±标准差表示；以p＜0.01有高度显著统计学意义，p＜0.05为有统计学意义，p＞0.05为无统计学意义。3、实验结果3.1形态学变化结果如图1所示：培养7天后，空白组(medium)未见有明显细胞形态学变化，而添加了含药鼠血清的本发明药物组(22#)，细胞逐渐向四周铺散生长，部分细胞体积增大变圆，出现类卵细胞形态样改变。3.2细胞免疫荧光实验结果结果如图2所示：培养7天后，与空白组(medium)相比，添加了含药鼠血清的本发明药物组(22#)，卵母细胞标识蛋白scp3、zp1的表达水平显著提高。3.3生殖细胞分化相关的标记基因的检测结果如下表3所示：表3干预5天后各标识基因表达情况gene空白22号gdf90.325±0.0220.293±0.006vasa0.083±0.0120.346±0.007*zp10.012±0.0010.020±0.005*zp215.051±0.8737.655±0.519fshr0.1581±0.0230.509±0.031*zp39.489±0.71811.475±1.386△scp30.026±0.0030.358±0.001*注：表3使用配对t检验法，其中“△”表示p＜0.05，“*”表示p＜0.01。如表3所示：培养5天后，与空白组相比，添加了含药鼠血清的本发明药物组(22号)，其卵母细胞标识基因vasa、zp1、fshr、zp3、scp3的表达水平显著提高。综上，本发明药物诱导人胚胎干细胞后，细胞出现了类卵细胞样结构，同时还表达卵母细胞标识基因和标识蛋白，说明枸杞子以及用其制备的含药血清可以人胚胎干细胞分化为类卵细胞。本发明药物可以诱导人胚胎干细胞分化为类卵细胞，可以为体外受精技术提供原材料，克服超排卵技术的种种缺陷，应用前景非常优良。当前第1页12