粪肠球菌高密度发酵培养基及其发酵工艺的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种粪肠球菌高密度发酵培养基及其发酵工艺，适用于粪肠球菌的高密度发酵生产。

背景技术：

《饲料添加剂品种目录(2013)》将粪肠球菌规定为可以添加到饲料中的菌种，其在动物肠道内可形成生物薄膜附着于动物肠道粘膜上，并且发育、生长和繁殖。粪肠球菌属于人及动物肠道中的正常菌群，进入肠道后可有效定殖。粪肠球菌发酵产生乳酸，有利于降低肠道环境ph，抑制有害菌的生长。粪肠球菌代谢过程中还会产生过氧化氢，细菌素等物质，对致病菌有一定的杀灭作用，而且能产生天然抗生素，有利于机体健康，目前在养殖业中应用比较广泛，但传统的粪肠球菌发酵多选用mrs培养基，价格昂贵，发酵后的活菌数低，在益生菌有效使用剂量固定的情况下，低发酵水平等于变相的增加了成本。低成本的培养基，高效的可放大的发酵工艺对于推进益生菌发酵的产业化有重大指导及实践意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种比现有技术更加能有效发酵粪肠球菌获得高菌体生物量的粪肠球菌高密度发酵培养基。

本发明的另一目的在于提供了一种采用上述粪肠球菌高密度发酵培养基，并在粪肠球菌发酵期间合理添加补料，从而能比现有技术获得更高生物量的粪肠球菌高密度发酵工艺。

本发明的第三个目的在于提供上述粪肠球菌高密度发酵工艺在粪肠球菌发酵生产中的应用。

本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一种粪肠球菌(enterococcusfaecalis)高密度发酵培养基，该粪肠球菌高密度发酵的种子和发酵培养基为液体培养基，其组分及其含量如下：甘油20～30g/l、豆粕10～15g/l、硫酸铵1～3g/l、三水合磷酸氢二钾2～3g/l、三水合乙酸钠3～8g/l、二水合柠檬酸钠2～4g/l、七水合硫酸镁0.3～0.8g/l、一水合硫酸锰0.1～0.3g/l。

本发明还提供了该粪肠球菌高密度发酵培养基的发酵工艺，主要步骤如下：

(1)将冷冻保存的粪肠球菌甘油菌种划线于mrs琼脂培养基上，放置32～39℃培养箱中培养至长出单菌落；上述单菌落中挑取饱满的单菌落接种于mrs液体试管，32～39℃，50～200r/min摇瓶培养10小时后；以1％接种量转接于mrs液体培养基，培养8～10小时后作为种子液；

(2)配制粪肠球菌高密度发酵培养基，培养基降至所需温度时，接上溶氧电极，标定溶氧为100％；

(3)以2％～8％的接种量将步骤(1)所得的种子液接种于步骤(2)的发酵培养基中；

(4)发酵参数设定为：温度32～39℃；转速50～300r/min；通气比0.5～1.0vvm，维持溶氧20～30％；发酵过程中维持发酵液ph值为4.5～7.0，当ph低于设定值时，自动流加碱性中和剂(氨水、koh、naoh、caco3或na2co3中的任一种)维持在设定值。连续补加料液(补料培养基：甘油800g/l和硫酸铵80g/l)，保持甘油浓度维持在10g/l左右；

(5)当补加料液ph不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值大于35时，终止发酵，即得粪肠球菌活菌数达8×10¹⁰cfu/ml以上的发酵液。

其中，所述补加料液的主要组分及其含量为：甘油800g/l、硫酸铵80g/l。

优选地，发酵参数中维持溶氧20～30％更利于粪肠球菌活的生长。

优选地，发酵参数中ph值为4.5～7.0更利于粪肠球菌活的生长。

本发明的高密度发酵培养基及其发酵工艺适用于粪肠球菌(enterococcusfaecalis)，但为达到最好的发明效果，优选适用于粪肠球菌(enterococcusfaecalis)cicc20419。粪肠球菌(enterococcusfaecalis)cicc20419购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

本发明的粪肠球菌高密度发酵培养基及其发酵工艺具有以下优点：本发明优化了粪肠球菌高密度发酵培养基，通过高溶氧结合甘油为碳源，并在发酵过程中采用ph反馈控制和甘油硫酸铵耦合流加策略，降低了发酵液中乳酸浓度，从而解除乳酸的反馈抑制，使用本发明的高密度发酵培养基及其发酵工艺发酵的粪肠球菌，菌体密度较普通发酵显著提高，活菌数在8×10¹⁰cfu/ml以上，这是现有的技术难以达到的发酵标准，是现行采用分批补料发酵方式获得高密度发酵粪肠球菌活菌数的2.78倍；较普通mrs培养基分批补料发酵培养活菌数2.2×10⁹cfu/ml，提高40倍以上，实现了粪肠球菌的高密度发酵；可以减小生物量的分离费用，缩短生产周期，从而降低生产成本、提高生产效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的实施例1中不同碳源对粪肠球菌高密度发酵的影响的柱状图。

图2为本发明的实施例1中不同碳源对粪肠球菌高密度发酵产乳酸的影响的柱状图。

图3为本发明的实施例2中不同ph对粪肠球菌高密度发酵的影响的柱状图。

图4为本发明的实施例3中不同碱性ph中和剂对粪肠球菌高密度发酵的影响的柱状图。

图5为本发明的实施例4中恒定溶氧对粪肠球菌高密度发酵的影响的柱状图。

图6为本发明的实施例5甘油-硫酸铵耦合流加补料分批发酵试验中的柱状图。

图7为本发明的实施例6中粪肠球菌高密度发酵及比较的折线图。

具体实施方式

下面结合附图1-7对本发明的优选实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。

本实施例中，粪肠球菌来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cicc20419。

实施例1利用不同碳源进行粪肠球菌高密度发酵

发酵培养基：豆粕10g/l、硫酸铵2g/l、三水合磷酸氢二钾2g/l、三水合乙酸钠5g/l、二水合柠檬酸钠2g/l、七水合硫酸镁0.3g/l、一水合硫酸锰0.2g/l、甘油/葡萄糖/蔗糖/淀粉20g/l,用25％氨水调至ph7.0。

种子液制备：将在﹣80℃保存的粪肠球菌甘油菌种划线于mrs(葡萄糖20g/l；蛋白胨10g/l；酵母粉5g/l；柠檬酸氢二铵2g/l；乙酸钠5g/l；磷酸氢二钾2g/l；硫酸镁0.58g/l；硫酸锰0.25g/l)琼脂培养基上，放置32℃培养箱中培养至长出单菌落；挑取饱满的单菌落接入装有mrs液体试管，37℃，50r/min摇瓶培养10小时后；以1％接种量转接于mrs液体培养基，37℃，100r/min震荡培养8小时后作为种子液。

发酵罐发酵培养:标定溶氧电极，配制发酵罐培养基3l，加入5l发酵罐中121℃、15min高压灭菌待用。调节罐体温度至37℃，使用25％氨水调节ph至7.0，并接种种子液90ml，启动发酵程序。发酵参数设定为：温度37℃，初始转速150r/min；调节通气量和转速，维持的恒定溶氧分别为5％、10％、15％、20％；分析不同碳源(甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉)对粪肠球菌发酵罐发酵培养的影响。

结果：如图1、图2所示，粪肠球菌在溶氧控制20％的条件下利用甘油作为碳源时生长状态最好，呈s型曲线增长，在0～3h处于滞留期，3h～14h呈对数增长，而在14h后增殖缓慢，开始进入平台期。甘油作为碳源，降低发酵液中乳酸的浓度，解除乳酸的反馈抑制作用，随着维持的溶氧含量增加，提高了甘油转化为能量的效率，促进了菌体的进一步生长，提高发酵液的活菌数。发酵过程中在粪肠球菌高密度发酵的活菌数达到1.82×10¹⁰cfu/ml，而蔗糖和葡萄糖作为碳源能达到的菌体湿重较之甘油相对较低，为0.96×10¹⁰cfu/ml左右，但仍实现了超过1.1×10¹⁰cfu/ml的高密度发酵。

实施例2控制不同ph对粪肠球菌高密度发酵的影响

发酵培养基：豆粕15g/l、甘油25g/l、硫酸铵2g/l、三水合磷酸氢二钾3g/l、三水合乙酸钠5g/l、二水合柠檬酸钠3g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、一水合硫酸锰0.25g/l。

种子液制备：将在﹣80℃保存的粪肠球菌甘油菌种划线于mrs(葡萄糖20g/l；蛋白胨10g/l；酵母粉5g/l；柠檬酸氢二铵2g/l；乙酸钠5g/l；磷酸氢二钾2g/l；硫酸镁0.58g/l；硫酸锰0.25g/l)琼脂培养基上，放置33℃培养箱中培养至长出单菌落；挑取饱满的单菌落接入装有mrs液体试管，32℃，150r/min摇瓶培养10小时后；以1％接种量转接于mrs液体培养基，37℃，100r/min震荡培养8小时后作为种子液。

发酵罐发酵培养:配制发酵罐培养基3l，加入5l发酵罐中121℃、15min高压灭菌待用。调节罐体温度至32℃，使用25％氨水调节ph至7.0；接种种子液240ml，启动发酵程序。发酵参数设定为：发酵温度39℃、转速300r/min；通风比0.1～0.5vvm；以25％的氨水为中和剂，选定流加过程维持的恒定ph值分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，当ph降至设定值以下时，自动补碱功能进行自动控制流加，使ph维持在设定值，发酵16h后停止发酵。每种恒定ph条件做3个批次的平行试验。

结果分析：如图3，恒定ph为5.5的条件下发酵活菌数明显高于恒定其他ph下，达到2.3×10¹⁰cfu/ml。

实施例3最适碱性ph中和剂的优化

发酵培养基：豆粕10g/l、甘油20g/l、硫酸铵1g/l、三水合磷酸氢二钾2g/l、三水合乙酸钠8g/l、二水合柠檬酸钠2g/l、七水合硫酸镁0.4g/l、一水合硫酸锰0.25g/l。

种子液制备：将在﹣80℃保存的粪肠球菌甘油菌种划线于mrs(葡萄糖20g/l；蛋白胨10g/l；酵母粉5g/l；柠檬酸氢二铵2g/l；乙酸钠5g/l；磷酸氢二钾2g/l；硫酸镁0.58g/l；硫酸锰0.25g/l)琼脂培养基上，放置34℃培养箱中培养至长出单菌落；挑取饱满的单菌落接入装有mrs液体试管，39℃，200r/min摇瓶培养10小时后；以1％接种量转接于mrs液体培养基，37℃，100r/min震荡培养10小时后作为种子液。

发酵罐发酵培养:配制发酵罐培养基3l，加入5l发酵罐中121℃、15min高压灭菌待用。调节罐体温度至37℃，并接种种子液120ml，启动发酵程序。发酵参数设定为：温度37℃；转速50r/min；通风比0.1～0.5vvm；发酵液ph值下限设定为5.5。分别选择氨水、koh、naoh、na2co3作为碱性ph中和剂，当ph降至设定值以下时，利用发酵系统的自动补碱系统功能进行自动控制流加，使ph维持在设定值，以不进行中和剂流加的分批发酵作为对照。发酵16h后停止发酵。每种碱性ph中和剂条件下做3个批次的平行试验。

结果分析：不管采用哪种中和剂，其发酵活菌都显著高于不流加碱性ph中和剂的活菌数。如图4所示，以30％的na2co3作为中和剂，发酵活菌数明显高于氨水组、koh组、naoh组。因此确定30％的na2co3最适碱性ph中和剂。

实施例4发酵参数最适恒定溶氧的优化

发酵培养基：豆粕12g/l、甘油28g/l、硫酸铵1.5g/l、三水合磷酸氢二钾2g/l、三水合乙酸钠6g/l、二水合柠檬酸钠3g/l、七水合硫酸镁0.8g/l、一水合硫酸锰0.15g/l。

种子液制备：将在－80℃保存的粪肠球菌甘油菌种划线于mrs(葡萄糖20g/l；蛋白胨10g/l；酵母粉5g/l；柠檬酸氢二铵2g/l；乙酸钠5g/l；磷酸氢二钾2g/l；硫酸镁0.58g/l；硫酸锰0.25g/l)琼脂培养基上，放置39℃培养箱中培养至长出单菌落；挑取饱满的单菌落接入装有mrs液体试管，35℃，170r/min摇瓶培养10小时后；以1％接种量转接于mrs液体培养基，37℃，100r/min震荡培养9小时后作为种子液。

发酵罐发酵培养:配制发酵罐培养基3l，加入5l发酵罐中121℃、15min高压灭菌待用。调节罐体温度至37℃，使用25％氨水调节ph至6.5，并接种种子液90ml，启动发酵程序。发酵参数设定为：温度37℃、以30％的na2co3为中和剂，当ph降至5.5，自动补碱功能进行自动控制流加，使ph维持在5.5；调节通气量和转速，维持的恒定溶氧分别为20％、25％、30％；发酵16h后停止发酵。每种恒定ph条件做3个批次的平行试验。

结果分析：如图5所示，控制溶氧在25％的条件下发酵活菌数明显高于控制溶氧在20％或30％下，发酵活菌数达到4.8×10¹⁰cfu/ml。

实施例5甘油-硫酸铵耦合流加补料分批发酵试验

1、粪肠球菌高密度发酵培养基组分及其含量为：

豆粕13g/l、甘油22g/l、硫酸铵3g/l、三水合磷酸氢二钾3g/l、三水合乙酸钠7g/l、二水合柠檬酸钠2g/l、七水合硫酸镁0.6g/l、一水合硫酸锰0.3g/l。

2、粪肠球菌高密度发酵主要步骤如下

(1)将冷冻保存的粪肠球菌甘油菌种划线于mrs(葡萄糖20g/l；蛋白胨10g/l；酵母粉5g/l；柠檬酸氢二铵2g/l；乙酸钠5g/l；磷酸氢二钾2g/l；硫酸镁0.58g/l；硫酸锰0.25g/l)琼脂培养基上，放置37℃培养箱中培养至长出单菌落；上述单菌落中挑取饱满的单菌落接入装有mrs液体试管，37℃，50r/min摇瓶培养10小时后；以1％接种量转接于mrs液体培养基，37℃，100r/min震荡培养8小时后作为种子液；

(2)称取甘油800g和硫酸铵80g，加蒸馏水溶解并定容至100ml，在103.4kpa蒸汽压力、110℃下蒸汽灭菌30min得补料液；

(3)配制粪肠球菌高密度发酵培养基，培养基降至所需温度时，接上溶氧电极，标定溶氧为100％；

(4)接种，以5％的接种量将步骤(1)所得的种子液接种于步骤(3)的发酵培养基中；

(5)发酵参数设定为：温度37℃、调节通气量和转速，溶氧维持在25％；发酵过程中维持发酵液ph值为5.5，当ph低于设定值时，30％的na2co3溶液维持在设定值；

a组:补料流加速度控制在10g/h，使甘油浓度在2g/l左右。

b组:补料流加速度25g/h，甘油浓度15g/l左右。

c组:根据细菌生长的密度值改变补料流加速度，补料流加速度控制在10～25g/h，甘油浓度在10g/l左右

(6)发酵16h后停止发酵。每种恒定ph条件做3个批次的平行试验。

3、结果分析：如图6所示，c组条件下粪肠球菌发酵活菌数明显高于a组和b组，发酵活菌数达到7.3×10¹⁰cfu/ml。

实施例6粪肠球菌的高密度发酵培养方法

1、粪肠球菌高密度发酵种子和发酵培养基的成分和配制：

种子及发酵培养基的主要成分及含量为：豆粕10g/l、甘油30g/l、硫酸铵2.5g/l、三水合磷酸氢二钾2.5g/l、三水合乙酸钠8g/l、二水合柠檬酸钠4g/l、七水合硫酸镁0.7g/l、一水合硫酸锰0.1g/l。

补料培养基的主要成分及含量为：甘油800g和硫酸铵80g

补料培养基配配制方法如下:

称取培养基各组分，充分溶解后，定容至所需体积，110℃灭菌30分钟。

种子摇瓶培养基配制方法如下：

称取培养基各组分，充分溶解后，用25％氨水溶液调ph至7.0，定容至所需体积，110℃灭菌30分钟。

发酵罐培养基配制方法如下：

(1)发酵罐中装入20g/l氢氧化钠溶液，装液量为70％，0.11-0.16mpa灭菌1h，冷却后放液，用自来水冲洗发酵罐2次后放空发酵罐。

(2)按上述含量分别称取各组分，用蒸馏水溶解，装入发酵罐中0.14mp灭菌30分钟。

(3)搅拌混匀，37℃，100rpm保温1h，用25％氨水溶液调ph至7.0后，0.14mpa灭菌40分钟。待温度稳定在37℃时，校正溶氧为100％。

(4)灭菌后的培养基在37℃，50rpm，不通气条件下空培至接种前。

2.种子液制备

(1)挑取新鲜培养的粪肠球菌斜面，接种至种子摇瓶培养基中，37℃，50r/min摇瓶培养8小时作为一级摇瓶种子液。

(2)在50l发酵罐中配制二级种子培养基，培养前对二级种子培养基及一级摇瓶种子液进行镜检，确保无杂菌污染。

(3)接种前将50l发酵罐转速调至100rpm，并用灭菌的25％氨水调二级种子培养基ph至7.0后，按照2％的接种量将一级种子液接入50l发酵罐中。

(4)发酵参数设定：发酵温度37℃；转速200rpm；通风比0.1～0.5vvm；；不控ph不补料，发酵8h结束作为二级种子液。

3.2吨发酵罐规模条件下的高密度发酵

(1)发酵前对发酵培养基及二级种子液进行镜检，确保无污染。

(2)接种前将2吨发酵罐转速调至100rpm，并用灭菌的25％氨水调ph至6.8后，将二级种子液全部转接至2吨发酵罐中进行发酵。

(3)发酵参数设定为：发酵温度37℃；调节通气量和转速，维持溶氧在25％左右；发酵过程中维持发酵液ph值为5.5，当ph低于设定值时，30％的碳酸钠溶液维持在设定值；通过流加补料培养基，补料流加速度控制在10～25g/h，使甘油浓度维持在10g/l左右；

(4)当补加料液ph不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值不再增加时，终止发酵，即得粪肠球菌活菌数达8.9×10¹⁰cfu/ml以上的发酵液。

4.对比试验

(1)传统mrs培养基的主要成分及含量为：

葡萄糖：20g/l、蛋白胨：10g/l、牛肉膏：5g/l、酵母粉：4g/l、三水合磷酸氢二钾：2g/l、三水合乙酸钠：5g/l、柠檬酸氢二铵：2g/l、七水合硫酸镁：0.5g/l、一水合硫酸锰：0.25g/l、吐温80：1ml/l。

(2)种子摇瓶培养基配置方法如下

称取培养基各组分，充分溶解后，用冰醋酸调ph至6.2，定容至所需要体积，121℃灭菌15分钟。

(3)发酵罐培养基配制方法如下：

发酵罐中装入20g/l氢氧化钠溶液，装液量为60％，0.11-0.16mpa灭菌1h，冷却后放液，用自来水冲洗发酵罐2次后放空发酵罐。称取培养基各组分，加入适量自来水搅拌至充分溶解，补加自来水至发酵罐总体积的60％。37℃，100rpm保温1h，用冰醋酸调ph至6.2后，0.12mpa灭菌30分钟。待温度稳定在37℃时，校正溶氧为100％。灭菌后的培养基在38℃，50rpm，不通气条件下空培至接种前。

(4)2吨发酵罐的发酵

挑取新鲜培养的粪肠球菌斜面，接种至种子摇瓶培养基中，37℃静置培养10h作为一级种子液。在50l发酵罐中配制二级种子培养基，培养前对二级种子培养基及一级种子液进行镜检，确保无杂菌污染。发酵前对发酵培养基及二级种子液进行镜检，确保无污染。

接种前将2吨发酵罐转速调至100rpm，并用灭菌的40％氢氧化钠溶液调ph至6.2后，将二级种子液全部接入发酵罐中。

发酵参数设定为：温度37℃；转速100r/min；不通气；发酵过程中维持发酵液ph值为6.2，当ph超过设定值时，补加料液(补料培养基:葡萄糖800g/l和硫酸铵80g/l)；当ph低于设定值时，自动流加碱性中和剂(灭菌的20％氢氧化钠溶液)维持在设定值。

(4)当补加料液ph不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值不再增加时，终止发酵，即得粪肠球菌活菌数达1.8×10¹⁰cfu/ml以上的发酵液。

5结果分析

如图7所示，应用本发明的培养基及其发酵工艺，可以得到粪肠球菌活菌数达8.9×10¹⁰cfu/ml的发酵液，而现行采用分批补料发酵方式获得的粪肠球菌最大活菌数为3.2×10¹⁰cfu/ml，本发明的培养基及其发酵工艺得到的高密度发酵粪肠球菌活菌数为现有技术的2.78倍，完全满足了粪肠球菌作为饲用乳酸菌的生产要求。

不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。