一种饲用嗜酸小球菌固体生料发酵培养基及发酵方法
【专利摘要】一种饲用嗜酸小球菌固体生料发酵培养基及发酵方法，该发酵方法是将嗜酸小球菌斜面菌种接种到新鲜MRS固体斜面培养基上，恒温培养得固体斜面菌种；将固体斜面菌种在无菌条下接种到液体种子培养基中，恒温静置培养得液体菌种；将培养好的液体菌种按一定量接种到制备好的固体生料发酵培养基中，恒温静置培养，再加入抗热保护剂，并充分搅拌均匀；最后将发酵好的固体发酵料干燥至含水量低于12%，粉碎。本方法生产工艺简单，对设备的要求低，投资小，生产成本低，获得的嗜酸小球菌制剂质量稳定，产品活性高，有利于嗜酸小球菌制剂在畜牧业和水产养殖业中的推广应用，对提高我国的动物产品水产品质量具有重要的现实意义，同时具有良好的经济效益和社会效益。
【专利说明】一种饲用嗜酸小球菌固体生料发酵培养基及发酵方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物工程发酵【技术领域】，具体涉及一种饲用嗜酸小球菌固体生料发酵培养基及发酵方法。
【背景技术】
[0002]乳酸菌是被各国批准使用的最大一类和最早使用的益生菌。该菌作为人和动物的有益菌(或称为益生菌)广泛用于发酵乳制品(如益生菌酸奶、益生菌发酵乳饮料、益生菌奶酪)、发酵豆乳制品、功能性食品配料和食品添加剂(如在婴儿配方乳粉、中老年乳粉、果蔬汁等中的添加等)、膳食补充剂(片剂、胶囊等)以及饲料微生态制剂中。
[0003]嗜酸小球菌(Ped1coccus acidilactici)是一种乳酸菌,属于革兰氏阳性菌,不运动，兼性厌氧。目前，嗜酸小球菌能赋予食品柔和的酸味及香气，改进食品的品质和营养，还具有抗菌、降低胆固醇、维持微生态环境、抗肿瘤、抗变异和增强免疫力等重要生物学功能。其作为发酵菌种已经大量的在多国的食品中使用，是备受人们喜爱和接受的有益菌群。此外，其显著的抑菌效果，使得嗜酸小球菌潜藏着巨大的应用价值和广阔的应用前景。
[0004]嗜酸小球菌作为一种新型的微生态制剂，除了具有益生素的功能外，还同时具有保健功能，尤其对人及动物无毒无病原性，对酸有很强的抵抗力，可顺利地通过胃，并在肠道内迅速增殖，调节肠道菌群，分泌类杀菌因子，刺激免疫系统提高免疫能力，促进动物全群健康水平等方面，是饲料业中的绿色添加剂。
[0005]固态发酵是指没有或几乎没有自由水存在下，用一种或多种微生物的一个生物反应过程。从生物反应过程中的本质考虑，固态发酵是以气相为连续相的生物反应过程。固体发酵具有操作简便、能耗低、发酵过程容易控制、对无菌要求相对较低、不易发生大面积的污染等优点。
[0006]生料发酵是指微生物在培养基不经过高温高压条件下生长、繁殖和代谢的一种发酵方式。生料发酵最初就是在酿酒的研究过程中出现的新技术，它是在传统酿造方法受到能源问题挑战的时候被提出的。我国在生料发酵研究方面虽然起步晚，但应用早，发展快。进入20世纪80年代，生料发酵制酒研究随着酶工程的发展取得了实质性进展。生料发酵技术又分为两种:一种是微生物直接利用原料发酵产生所需物质；另一种是借助外界酶作用将生淀粉水解为微生物可利用后，在发酵产生所需要的物质。后一种方法随着酶制剂的发展已经变成现实被广泛应用；而前一种方法国内学者报道较少。
[0007]目前关于嗜酸小球菌生料发酵及制剂应用于动物养殖的公开文献不多，主要集中在片球菌素的发酵生产和在香肠发酵中的应用。国内专利CN101050437和CN102115720A分别公开了生产片球菌素的方法；CN102127578A公开了一种积累片球菌素的方法，可以增加片球菌素的生产量；CN101289647公开的一株片球菌能够在发酵香肠中作为发酵剂的应用，改善发酵香肠的风味；CN103283950A公开了嗜酸小球菌活菌制剂(作为畜禽饲料添加齐U)的生产方法，但该方法是采用传统的发酵技术，存在生产成本高、工艺复杂、设备投资大等缺点。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是:针对上述现有技术的不足，提供一种饲用嗜酸小球菌固体生料发酵培养基及发酵方法，该方法具有生产工艺简单、不需要投资发酵设备、生产成本和能耗低、易于推广和应用、产品活菌数高且活性高、无三废排放等特点，解决了目前嗜酸小球菌生产工艺上存在的生产工艺复杂，生产成本高，设备投资大等问题。
[0009]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:一种饲用嗜酸小球菌固体生料发酵培养基，该培养基按重量百分比是取麦麸58-68%、玉米粉20-25%、豆饼粉4_8%、酵母抽提粉0.5-0.8%、无水乙酸钠0.8-1.2%、CaC033-4%及杂菌抑制剂2_3%搅匀，并调节含水量为45-55%而成。
[0010]上述杂菌抑制剂为双乙酸钠或NaCl中的一种或两种。
[0011]一种饲用嗜酸小球菌固体生料发酵方法，该发酵方法步骤如下:
(1)固体斜面菌种制备:将保藏于4°c环境中的嗜酸小球菌斜面菌种接种于新鲜MRS固体斜面培养基上，37-40°C恒温培养3-5d ；
(2)液体菌种制备:将培养好的固体斜面菌种，在无菌条件下，挑取一接种环细胞接种于液体种子培养基中，37-40°C恒温静置培养24-36h ；
上述液体种子培养基是按每100ml水加20-30g葡萄糖、5-8g蛋白胨、3-5g牛肉膏、
2-4g酵母抽提粉、3-5g无水乙酸钠、1-1.5gK2HP04&0.05-0.15g无水硫酸镁的比例，取葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母抽提粉、无水乙酸钠、K2HPO4及无水硫酸镁溶于水中，搅匀，调节pH值为 6.0-6.5，115-121°C灭菌 25_30min 而成。
[0012](3)发酵:按15-20%的接种量(V/W)将培养好的液体菌种接种到前述饲用嗜酸小球菌固体生料发酵培养基中，37-40°C恒温静置培养3-5d ；
(4)加入抗热保护剂:加入抗热保护剂，搅拌均匀，抗热保护剂的加入量为上一步骤中发酵前的饲用嗜酸小球菌固体生料发酵培养基重量的5-7%;其中，抗热保护剂为海藻糖、葡萄糖或谷氨酸钠中的两种或三种组合。
[0013](5)干燥:将加入有抗热保护剂的发酵料于45_55°C干燥至含水量低于12%，粉碎至40-60目，即可。
[0014]本发明中用到的嗜酸小球菌acidilactici )为现有技术,保藏号为:CGMCC1.4、CICC10344、CCAM080049或CICMB1355。本发明中用到的酵母抽提粉为市购女口广叩ο
[0015]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
(I)本发明方法采用的固体生料发酵，培养基不需要经过高温灭菌环节，极大地降低了嗜酸小球菌生产过程中的能耗，同时也避免了高温灭菌过程中营养物质的损失。
[0016](2)本发明方法生产嗜酸小球菌制剂，不仅包含了能改善动物肠道微生态系统的嗜酸小球菌活菌，同时也包含了嗜酸小球菌代谢过程中产生的细菌素等各种代谢产物，有利于动物肠道微生态系统的快速建立和快速修复，减少外源病原微生物的侵袭。
[0017](3)本发明方法与现有生产工艺相比，不需要投资复杂且价格昂贵的发酵设备，具有生产成本低、易于推广和应用、产品活菌数高且活性高、无三废排放等特点。
【具体实施方式】
[0018]以下实施例仅对本发明作进一步说明。
[0019]实施例1
(I)固体斜面菌种制备:将保藏于4°c冰箱的嗜酸小球菌斜面菌种接种于新鲜MRS固体斜面培养基上，37 °C恒温培养5d。
[0020](2)液体菌种制备:取葡萄糖25g、蛋白胨6g、牛肉膏4g、酵母抽提粉3g、无水乙酸钠4g、K2HP04l.2g及无水硫酸镁0.1g溶于100mL水中，搅匀，调节pH值为6.2，121°C灭菌25min，制得液体种子培养基。无菌条件下，将培养好的固体斜面菌种挑取一接种环细胞接种于上述液体种子培养基中，37 °C恒温静置培养36h。
[0021](3)发酵:取麦麸58g、玉米粉25g、豆饼粉Sg、酵母抽提粉0.Sg、无水乙酸钠1.2g、CaC034g、双乙酸钠0.2g及NaC12.8g，搅拌均匀，调节含水量为52%，制得固体生料发酵培养基。按18%的接种量(V/W)将培养好的液体菌种接种到该固体生料发酵培养基中，40°C恒温静置培养3d。
[0022](4)保护剂加入:按发酵前固体生料发酵培养基的重量加入海藻糖3%和谷氨酸钠3.5%，并搅拌均匀。
[0023](5)干燥:将加有抗热保护剂的发酵料于45°C条件下干燥至含水量低于12%，粉碎至50目，即得饲用嗜酸小球菌粉剂。
[0024]实施例2
(I)固体斜面菌种制备:将保藏于4°C冰箱的嗜酸小球菌斜面菌种接种于新鲜MRS固体斜面培养基上，40°C恒温培养3d。
[0025](2)液体菌种制备:取葡萄糖20g、蛋白胨Sg、牛肉膏5g、酵母抽提粉4g、无水乙酸钠5g、K2HPO4L 5g及无水硫酸镁0.05g溶于100mL水中，搅匀，调节pH值为6.0，115°C灭菌30min，制得液体种子培养基。无菌条件下，将培养好的固体斜面菌种挑取一接种环细胞接种于上述液体种子培养基中，40°C恒温静置培养24h。
[0026](3)发酵:取麦麸68g、玉米粉21.7g、豆饼粉4g、酵母抽提粉0.5g、无水乙酸钠
0.8g、CaC033g及NaC12g，搅拌均匀，调节含水量为55%，制得固体生料发酵培养基。按15%的接种量(V/W)将培养好的液体种子接种到该固体生料发酵培养基中，37°C恒温静置培养5d。
[0027](4)保护剂加入:按发酵前固体生料发酵培养基的重量加入海藻糖2%、葡萄糖3.5%及谷氨酸钠1.5%，并搅拌均匀。
[0028](5)干燥:将加有抗热保护剂的发酵料于55°C条件下干燥至含水量低于12%，粉碎至40目，即得饲用嗜酸小球菌粉剂。
[0029]实施例3
(I)固体斜面菌种制备:将保藏于4°C冰箱的嗜酸小球菌斜面菌种接种于新鲜MRS固体斜面培养基上，38 °C恒温培养4d。
[0030](2)液体菌种制备:取葡萄糖30g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、酵母抽提粉2g、无水乙酸钠3g、K2HPO4L Og及无水硫酸镁0.15g溶于100mL水中，搅勻，调节pH值为6.5，121°C灭菌25min，制得液体种子培养基。无菌条件下，将培养好的固体斜面菌种挑取一接种环细胞接种于上述液体种子培养基中，38°C恒温静置培养32h。
[0031](3)发酵:取麦麸66.4g、玉米粉20g、豆饼粉6g、酵母抽提粉0.6g、无水乙酸钠1.0g、CaC033.5g及双乙酸钠2.5g，搅拌均匀，调节含水量为45%，制得固体生料发酵培养基。按20%的接种量(V/W)将培养好的液体种子接种到该固体生料发酵培养基中，38°C恒温静置培养3.5d。
[0032](4)保护剂加入:按发酵前固体生料发酵培养基的重量加入葡萄糖2%及谷氨酸钠3%，并搅拌均匀。
[0033](5)干燥:将加有抗热保护剂的发酵料于50°C条件下干燥至含水量低于12%，粉碎至60目，即得饲用嗜酸小球菌粉剂。
【权利要求】
1.一种饲用嗜酸小球菌固体生料发酵培养基，其特征在于，该培养基按重量百分比是取麦麸58-68%、玉米粉20-25%、豆饼粉4_8%、酵母抽提粉0.5-0.8%、无水乙酸钠0.8-1.2%、CaC033-4%及杂菌抑制剂2-3%搅匀，并调节含水量为45-55%而成。
2.如权利要求1所述的一种饲用嗜酸小球菌固体生料发酵培养基，其特征在于，所述杂菌抑制剂为双乙酸钠或NaCl中的一种或两种。
3.一种饲用嗜酸小球菌固体生料发酵方法，其特征在于:该发酵方法步骤如下: (O固体斜面菌种制备:将嗜酸小球菌斜面菌种接种于新鲜MRS固体斜面培养基上，37-40°C恒温培养3-5d ； (2)液体菌种制备:将培养好的固体斜面菌种，在无菌条件下，挑取一接种环细胞接种于液体种子培养基中，37-40°C恒温静置培养24-36h ； (3)发酵:按15-20%的接种量(V/W)将培养好的液体菌种接种到权利要求1-2中任一项所述的饲用嗜酸小球菌固体生料发酵培养基中，37-40°C恒温静置培养3-5d ； (4)加入抗热保护剂:加入抗热保护剂，搅拌均匀，抗热保护剂的加入量为步骤(3)中发酵前的饲用嗜酸小球菌固体生料发酵培养基重量的5-7% ； (5)干燥:将加入有抗热保护剂的发酵料干燥至含水量低于12%，粉碎至40-60目，SP可。
4.如权利要求3所述的一种饲用嗜酸小球菌固体生料发酵方法，其特征在于:所述步骤(2)中的液体种子培养基是按每100ml水加20-30g葡萄糖、5_8g蛋白胨、3_5g牛肉膏、2-4g酵母抽提粉、3-5g无水乙酸钠、1-1.5gK2HP04&0.05-0.15g无水硫酸镁的比例，取葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母抽提粉、无水乙酸钠、K2HPO4及无水硫酸镁溶于水中，搅匀，调节pH值为 6.0-6.5，115-121°C灭菌 25_30min 而成。
5.如权利要求3所述的一种饲用嗜酸小球菌固体生料发酵方法，其特征在于:所述步骤(4)中的抗热保护剂为海藻糖、葡萄糖或谷氨酸钠中的两种或三种组合。
6.如权利要求3所述的一种饲用嗜酸小球菌固体生料发酵方法，其特征在于:所述步骤(5)中的干燥温度为45-55°C。
【文档编号】C12N1/20GK104450565SQ201410643675
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】兰时乐, 李玥, 肖调义, 周芳如, 厉大伟, 王红权 申请人:湖南农业大学