与荠菜抗药性相关的分子标记及其检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了与荠菜抗药性相关的分子标记和用于检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂荠菜的特异性PCR引物对，包括用于特异性扩增荠菜JC-ALS基因的引物对。采用该引物的PCR检测方法具有极好的特异性和灵敏性，能够实现对田间疑似抗ALS抑制剂荠菜的快速鉴定和突变位点的确认，从而指导生产实践中抗性杂草的科学治理。
【专利说明】与荠菜抗药性相关的分子标记及其检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗除草剂杂草检测技术，具体地说，涉及与荠菜抗药性相关的分子标 记及其检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase,简称ALS)，也称乙酰轻酸合酶 (acetohydroxyacid synthase,简称AHAS)，是诱导植物和微生物体内缴氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸的生物合成过程中关键性酶，也是一种重要的除草剂靶标。ALS抑制剂类除草剂的开发 及使用始于上世纪80年代初，由于此类除草剂有超高活性、对人及动物低毒、环境友好等 明显的优势，受到广泛关注，目前已有50多个品种被开发和使用。上世纪80年代开始，我 国陆续在冬小麦田推广使用苯磺隆、甲磺隆、氯磺隆、双氟磺草胺、啶磺草胺等，2009年仅苯 磺隆在我国的产量就达230多吨（有效成分），相当于麦田化除面积2亿多亩。苯磺隆作为 小麦田最经济、有效的优秀除草剂，对控制荠菜等阔叶杂草起到了非常重要的作用。但由于 该类除草剂分子靶标单一，长期使用易引起杂草抗药性，近些年来，以常规剂量喷施苯磺隆 无法有效防除荠菜的问题在我国河北、陕西、山东、河南、山西、江苏等地的一些麦田非常突 出，并且发现，有些麦田抗苯磺隆的荠菜对双氟磺草胺等ALS抑制剂也产生了交互抗性。麦 田杂草对上述几种ALS抑制剂产生交互抗性，使这些农田不能继续使用该类除草剂，而在 生产中由于农民对杂草抗药性的认识上的不足，盲目增大用药剂量，不仅增加了成本，使药 害风险加大，严重影响农民收入和国家粮食安全。因此，目前迫切需要一个简便，快速的抗 药性杂草检测鉴定方法。
[0003] 我国抗药性杂草的研究起步较晚，传统的抗药性杂草检测通常采用室内生物测定 法，既对田间采集的疑似抗性的杂草的种子在室内进行培养，在一定叶龄喷施除草剂后，调 查株防效和地上部分生物量来计算抗性指数。这种方法能够客观地评价某种杂草对相应除 草剂的抗性情况，但也有其局限性，主要表现在以下两方面：一是不能当季、当时进行检测， 二是占地多、时间长、工作量大。
[0004] 随着分子生物学技术在杂草抗药性机理研究方面的应用，越来越多的杂草的 抗药性机理得到明确。目前已有的研究报道显示，对ALS抑制剂产生抗性的植物在其 革巴标酶 ALS 保守区共发现了 8 个 SNP 位点（http: //www. weedscience. org/Mutations/ MutationDisplayAll. aspx)，这些位点的任意一个位点氨基酸突变为其他氨基酸都使植物 对相应除草剂产生抗性。这8个氨基酸位点目前公认以拟南芥ALS为标准标注位点，包括 122、197、205、376、377、574、653、654位氨基酸（图3)。其中，荠菜对苯磺隆等ALS抑制剂 类除草剂产生抗性的原因也已证实与编码ALS保守区某一位点发生点突变相关。研究报道 中只克隆了荠菜的一个ALS基因，但我们在研究中发现，荠菜具有两个ALS基因，分别命名 为JC-ALS-I和JC-ALS-2,这两个基因都具有功能，任意一个基因在保守区发生突变，都能 够引起抗药性产生。因此，可以通过分子生物学手段检测其靶标酶ALS的保守区突变位点 来检测荠菜是否发生抗药性。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种抗乙酰乳酸合酶抑制 剂类除草剂荠菜的检测方法。
[0006] 为了实现本发明的目的，本发明首先提供与荠菜抗药性相关的分子标记，所述分 子标记为：
[0007] (1)核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的JC-ALS-I基因；所编码的蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID No. 3所示；其中，编码第373位氨基酸的密码子发生GAT-GAA碱基突变，或编 码第571位氨基酸的密码子发生TGG-TTG碱基突变，导致荠菜抗药性出现多态性；
[0008] 或（2)核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的JC-ALS-2基因；所编码的蛋白的氨基酸 序列如SEQ ID No. 4所示；其中，编码第372位氨基酸的密码子发生GAT-GAA碱基突变，或 编码第570位氨基酸的密码子发生TGG-TTG碱基突变，导致荠菜抗药性出现多态性；
[0009] 所述抗药性具体表现为抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂。
[0010] 需要指出的是，JC-ALS-I基因发生碱基突变，导致翻译的氨基酸发生变化的第 373位和第571位氨基酸位点，若以拟南芥ALS氨基酸顺序，则分别为376位和574位。同 样，JC-ALS-2基因发生碱基突变，导致翻译的氨基酸发生变化的第372位和第570位氨基 酸位点，若以拟南芥ALS氨基酸顺序，则分别为376位和574位。
[0011] 因此，本发明所述分子标记翻译的氨基酸序列，相对于拟南芥ALS氨基酸顺序来 说，由于在编码第376位氨基酸的密码子发生GAT-GAA碱基突变，使得该位置氨基酸由Asp 变为Glu ;或由于在编码第574位氨基酸的密码子发生TGG-TTG碱基突变，使得该位置氨基 酸由Trp变为Leu。
[0012] 为了叙述简洁，本发明在后文中将利用拟南芥ALS氨基酸顺序，对所述分子标记 导致的氨基酸突变位点进行描述。
[0013] 本发明还提供了用于检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂荠菜的特异性PCR引 物对，包括用于特异性扩增荠菜JC-ALS-I基因和JC-ALS-2基因的引物对，引物对的核苷酸 序列如下：
[0014] 正向引物 JC-ALS-F : 5' -TATTCGCTTACCCAGGTG-3，；
[0015] 反向引物 JC-ALS-R : 5' -GGTTCTGAGTTTCATCTCTCA-3'。
[0016] 本发明还进一步提供了用于检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂荠菜的试剂盒， 所述试剂盒含有前述引物对。
[0017] 作为优选，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的 至少一种。
[0018] 更为优选，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0019] 本发明还提供一种抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂荠菜的PCR检测方法，利用前 述引物对或试剂盒检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂的荠菜。
[0020] 进一步地，所述PCR检测方法具体包括以下步骤：
[0021] 1)提取样品中的DNA ;
[0022] 2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用前述引物对或试剂盒进行PCR扩增反应；
[0023] 3)分析PCR产物。
[0024] PCR反应体系以20 μ 1计为：
[0025]
【权利要求】
1. 与莽菜抗药性相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为： (1)核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的JC-ALS-I基因；所编码的蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No. 3所示；其中，编码第373位氨基酸的密码子发生GAT-GAA碱基突变，或编码第 571位氨基酸的密码子发生TGG-TTG碱基突变； 或（2)核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的JC-ALS-2基因；所编码的蛋白的氨基酸序列 如SEQ ID No. 4所示；其中，编码第372位氨基酸的密码子发生GAT-GAA碱基突变，或编码 第570位氨基酸的密码子发生TGG-TTG碱基突变； 所述抗药性具体表现为抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂。
2. 用于检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂荠菜的特异性PCR引物对，其特征在于， 包括用于特异性扩增权利要求1所述分子标记的引物对，引物对的核苷酸序列如下： 正向引物 JC-ALS-F :5' -TATTCGCTTACCCAGGTG-3，； 反向引物 JC-ALS-R :5' -GGTTCTGAGTTTCATCTCTCA-3'。
3. 用于检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂荠菜的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 含有权利要求2所述引物对。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚 合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。
5. 根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
6. 抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂荠菜的PCR检测方法，其特征在于，利用权利要求 2所述引物对或权利要求3-5任一项所述试剂盒检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂的荠 菜。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 提取样品中的DNA ; 2) 以步骤1)中提取的DNA为模板，利用权利要求2所述引物对或权利要求3-5任一项 所述试剂盒进行PCR扩增反应； 3) 分析PCR产物。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20 μ 1计为：
9. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：94°C预变性3分钟； 94°C变性1分钟，55. 3°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，共30个循环；72°C延伸10分钟。
【文档编号】C12N15/11GK104388559SQ201410643602
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月10日 优先权日:2014年11月10日
【发明者】崔海兰, 李香菊, 张宏军 申请人:中国农业科学院植物保护研究所