本发明属于生物技术领域，涉及一种提高复合菌剂发酵生物量的培养基及其使用方法。
背景技术：
解磷微生物是土壤中能够将无效磷转化为植物可以吸收利用的有效磷的微生物功能群体，在自然及农业生态的磷素生物地化循环中起到了关键作用。大量试验证实，向土壤中施用解磷细菌，不仅能够增加作物的磷吸收量，提高作物产量，还能大大提高磷肥利用率，减少农业面源污染。
芽孢杆菌(Bacillus)是一类广泛存在于自然界的好氧或兼性厌氧革兰氏阳性菌，由于芽孢壁中“皮质层”的存在，芽孢杆菌对热、紫外线和离子辐射以及抗菌素均具有很高的抗性。因此，芽孢杆菌能够显著促进植株生长，抑制病虫害，提高农作物产量。
微生物菌剂根据菌株组成可以分为单一菌剂和复合菌剂，单一菌剂的研究和开发较多，目前的发展趋势是研制复合菌剂。利用多个生物因子构建的多功能菌群协同作用发挥生态效应，可以解决单一菌剂作用机制单一、效果不稳等问题。
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)为革兰氏阳性菌及好氧菌，是一种植物根系促生细菌，也是微生物肥料中的常用菌种。它是一种解磷促钾细菌，对卵磷脂、土壤中植物无法直接利用的吸附态有机磷、无机磷有明显的分解作用，能提高土壤肥力，促进作物的增产。郑传进，黄林，龚明(巨大芽孢杆菌解磷能力的研究.江西农业大学学报(自然科学版)，2002.4)测定了巨大芽孢杆菌(B.megaterium)ACCC10011对难溶性无机磷、有机磷的解磷能力，结果显示，ACCC10011菌株具有很强的分解难溶性磷Ca3(PO4)2的能力和分解有机磷卵磷脂的能力。
培养基(Medium)是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，按培养基的物理状态，可以分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基等三种。固体培养基是在培养基中加入了凝固剂，如琼脂、明胶、硅胶等，常 用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等。半固体培养基是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态，可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等。而液体培养基中则不添加任何凝固剂，这种培养基成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，由于发酵率高，操作方便，液体培养基常用于发酵工业。
目前，芽孢杆菌的发酵培养基一般为LB液体培养基，LB液体培养基的组成为蛋白胨10g/L，酵母粉5.0g/L，氯化钠10.0g/L，因此，采用LB液体培养基，发酵成本较高。现在，市场竞争愈演愈烈，如何能够有效降低生产成本，将成为企业提高市场竞争力的一个重要研究方向。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明公开了一种提高复合菌剂发酵生物量的培养基及其使用方法。
本发明的第一个方面在于公开一种提高复合菌剂发酵生物量的培养基，所述复合菌剂包括解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌，所述培养基包括：
玉米粉3-30g/L
黄豆粉3-30g/L
硫酸镁0.2-5g/L
磷酸氢二钾0.2-5g/L
铵盐0.2-5g/L
钠盐0.2-5g/L。
作为本发明的一个优选方案，所述培养基包括：
玉米粉5-20g/L
黄豆粉5-20g/L
硫酸镁0.5-3g/L
磷酸氢二钾0.5-3g/L
铵盐0.5-3g/L
钠盐0.5-3g/L。
作为本发明的一个优选方案，所述培养基包括：
玉米粉10-15.6g/L
黄豆粉10-15.6g/L
硫酸镁1.0-1.5g/L
磷酸氢二钾1.0-1.5g/L
铵盐1.0-1.5g/L
钠盐1.0-1.5g/L。
作为本发明的一个优选方案，所述铵盐可以为氯化铵、硝酸铵中的一种或两种。
作为本发明的一个优选方案，所述钠盐可以为氯化钠、硝酸钠中的一种或两种。
作为本发明的一个优选方案，所述解淀粉芽孢杆菌的保藏号为CCTCC AB2014337。
作为本发明的一个优选方案，所述巨大芽孢杆菌由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供，保藏号为CICC21695。
本发明的另一个方面在于公开一种提高复合菌剂发酵生物量培养基的使用方法，所述使用方法包括如下步骤：
步骤1、将活化的菌株分别接种到种子培养基中培养，得到种子液；
步骤2、将步骤1中获得的种子液混合，并接种到本发明提供的培养基中培养，得到复合菌剂；
其中，步骤1中所述的菌株为解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。
作为本发明的一个优选方案，步骤1中所述的种子培养基为液体培养基、半固体培养基和固体培养基中的一种或几种，并优选为液体培养基，更优选为LB液体培养基。
作为本发明的一个优选方案，所述LB液体培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化钠10.0g/L，121℃条件下灭菌20min。
作为本发明的一个优选方案，步骤1中所述培养条件为：温度为25-35℃，转速为100-300rpm条件下培养10-30h。
作为本发明的一个优选方案，步骤2中所述的混合比例为V解：V巨＝0.2：1-5：1，如0.3：1，3.0：1等，优选为V解：V巨＝0.5：1-2：1，如0.7：1， 1.9：1等，更优选为V解：V巨＝1：1-1.75：1，比如1.27：1等，其中，V解：V巨为解淀粉芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌的体积比。
作为本发明的一个优选方案，所述复合菌株接种到所述培养基时的接种比例为1％-20％，更优选为5％-10％。
作为本发明的一个优选方案，所述复合菌株的发酵条件为温度为25-35℃，如26℃，34℃等，转速为50-500rpm，如100rpm，400rpm，摇床培养12-48h；优选为温度为27-32℃，转速为150-300rpm，摇床培养15-36h；更优选为温度为28-31℃，如29℃，30℃，转速为170-200rpm，如180rpm，190rpm等，摇床培养20-24h，如22h。
本发明所述的培养基，适用于微生物液体发酵生产，本发明采用廉价原料，如玉米粉、黄豆粉等，替代价格高昂的蛋白胨和酵母粉，使生产成本大幅降低；且采用本发明所述的培养基培养解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌形成的复合菌株，复合菌株的总生物量显著提高，为大规模生产奠定了基础。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图,对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为本发明提供的培养基的使用方法
具体实施方式
实施例一
选取实验组和对照组，考察本发明提供的培养基对不同菌株的发酵效果。实验组采用解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌组成的复合菌株，对照组为单一菌株，其中，对照组一采用解淀粉芽孢杆菌菌株，对照组二采用巨大芽孢杆菌菌株。
实验组的发酵方法如图1所示，并包括如下步骤：
步骤1、分别将解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌接种到LB斜面培养基中活化，得到各自活化的菌株；
步骤2、将步骤1中活化的菌株分别接种到LB液体培养基中培养，得到解淀粉芽孢杆菌种子液和巨大芽孢杆菌种子液；
步骤3、将步骤2中得到的种子液按V解：V巨＝1：2、1.25：1、2：1分别混合，得到不同比例的复合菌株；
步骤4、将步骤3中得到的复合菌株按体积比5％的比例接种到发酵培养基中发酵。
对照组的发酵方法为：
步骤1、将解淀粉芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌接种到LB斜面培养基中活化，得到活化的菌株；
步骤2、将步骤1中活化的菌株接种到LB液体培养基中培养，得到解淀粉芽孢杆菌种子液或巨大芽孢杆菌种子液；
步骤3、将步骤2中得到的种子液按体积比5％的比例接种到发酵培养基中发酵。
其中，步骤2中的培养条件为30℃，190rpm培养20h；
LB液体培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5.0g/L，氯化钠10.0g/L，121℃条件下灭菌20min。
发酵培养基组成为：玉米粉12.3g/L，黄豆粉13.6g/L，氯化铵1.2g/L，硝酸钠1.3g/L，硫酸镁1.1g/L，磷酸氢二钾1.2g/L。
在发酵培养基中的培养条件为：在28℃，转速在190rpm的条件下摇床培养20h。
用平板稀释涂布法检测，实验组发酵液中活菌的总量最高为5.13×109CFU/mL，对照组一中的有效活菌数为2.09×109CFU/mL，对照组二中的有效活菌数为2.02×109CFU/mL。
由实验结果可知，实验组发酵液中活菌总量明显高于对照组中的活菌总量，因此，与单一菌株的发酵培养相比，本发明提供的培养基更适合于解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌混合形成的复合菌株的发酵。
实施例二
选取实验组和对照组，考察本发明提供的培养基对不同菌株的发酵效果。实验组采用解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌混合形成的复合菌株，对照组采用单一菌株，对照组一采用解淀粉芽孢杆菌，对照组二采用巨大芽孢杆菌。
实验组的发酵方法如图1所示，并包括如下步骤：
步骤1、分别将解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌接种到LB斜面培养基中活化，得到各自活化的菌株；
步骤2、将步骤1中活化的菌株分别接种到LB液体培养基中培养，得到解淀粉芽孢杆菌种子液和巨大芽孢杆菌种子液；
步骤3、将步骤2中得到的种子液按V解：V巨＝2：1混合，得到复合菌株；
步骤4、将步骤3中得到的复合菌株按体积比5％的比例接种到发酵培养基中发酵。
对照组的发酵方法为：
步骤1、将解淀粉芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌接种到LB斜面培养基中活化，得到活化的菌株；
步骤2、将步骤1中活化的菌株接种到LB液体培养基中培养，得到解淀粉芽孢杆菌种子液或巨大芽孢杆菌种子液；
步骤3、将步骤2中得到的种子液按体积比5％的比例接种到发酵培养基中发酵。
其中，步骤2中的培养条件为30℃，190rpm培养20h；
LB液体培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5.0g/L，氯化钠10.0g/L，121℃条件下灭菌20min。
在发酵培养基中的培养条件为：在28℃，转速在190rpm的条件下摇床培养20h。
实验组的培养基组成为：玉米粉12.8g/L，黄豆粉15.6g/L，氯化铵1.3g/L，硝酸钠1.3g/L，硫酸镁1.3g/L，磷酸氢二钾1.0g/L。
对照组的培养基组成为：玉米粉12.86g/L，黄豆粉12.85g/L，氯化铵1.3g/L，硝酸钠1.2g/L，硫酸镁1.26g/L，磷酸氢二钾1.41g/L。
用平板稀释涂布法检测，实验组发酵液中活菌的总量为3.40×109CFU/mL，对照组一中有效活菌数为2.09×109CFU/mL，对照组二中有效活菌数为2.02×109CFU/mL。
由实验结果可知，实验组发酵液中活菌总量为对照组中活菌总量的1.6倍以上，因此，本发明提供的培养基更适合于解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌混合形 成的复合菌株的发酵。
实施例三
选取实验组和对照组，考察本发明提供的培养基的发酵效果。
实验组的发酵培养基为本发明提供的培养基，对照组的发酵培养基为常用的LB液体培养基；
实验组和对照组均采用如图1所示的发酵方法进行发酵，并包括如下步骤：
步骤1、分别将解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌接种到LB斜面培养基中活化，得到各自活化的菌株；
步骤2、将步骤1中活化的菌株分别接种到LB液体培养基中培养，得到解淀粉芽孢杆菌种子液和巨大芽孢杆菌种子液；
步骤3、将步骤2中得到的种子液按V解：V巨＝1.25：1混合，得到复合菌株；
步骤4、将步骤3中得到的复合菌株按体积比5％的比例接种到发酵培养基中发酵。
其中，实验组的发酵培养基为：玉米粉12.8g/L，黄豆粉12.8g/L，氯化铵1.3g/L，硝酸钠1.0g/L，硫酸镁1.6g/L，磷酸氢二钾1.6g/L；
对照组的发酵培养基为LB液体培养基；
其中，LB液体培养基配方为：蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化钠10.0g/L，121℃条件下灭菌20min。
在发酵培养基中的培养条件为：30℃，190rpm、装料系数为2/5，培养20h。
用平板稀释涂布法检测，实验组发酵液中活菌的总量为4.18×109CFU/mL，对照组一中有效活菌数为3.25×109CFU/mL，对照组二中有效活菌数为2.02×109CFU/mL。
由实验结果可知，实验组发酵液中活菌总量明显高于对照组中的活菌总量，也就是说，本发明提供的培养基对复合菌剂的培养效果比目前常用的LB液体培养基的发酵效果更好。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一 步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。